(Luận văn thạc sĩ) ứng dụng vi khuẩn lên men lactic xử lý hạt giống đậu phộng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS NGUYỄN HỒI HƯƠNG SVTH: NGUYỄN THANH HIẾU MSSV: 1411100748 Lớp: 14DSH04 TP Hồ Chí Minh, 8/2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC XỬ LÝ HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS NGUYỄN HỒI HƯƠNG SVTH: NGUYỄN THANH HIẾU MSSV: 1411100748 Lớp: 14DSH04 TP Hồ Chí Minh, 8/2018 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Sinh viên thực luận văn Nguyễn Thanh Hiếu i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ TP HCM tạo điều kiện cho chúng em học tập Trường Em xin chân thành biết ơn dạy dỗ tận tình tồn thể q thầy Viện Khoa học Ứng dụng Hutech, Trường Đại học Công nghệ TP HCM cho chúng em kiến thức quan trọng suốt thời gian qua, nhờ chúng em có tri thức quý giá để làm hành trang cho đường nghiệp phía trước Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Hoài Hương trang bị cho em kiến thức bổ ích ln theo sát q trình làm việc em để kịp thời hướng dẫn khắc phục lỗi sai để công việc đạt kết tốt Cô chia động viên em cơng việc chưa ổn giúp em tìm niềm vui thấy thành gặt hái Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tiếp cho em nghị lực, bình n tâm hồn, ln bên em lúc khó khăn Em xin cảm ơn tới người bạn gắn bó, động viên giúp đỡ em suốt quãng thời gian thực đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn Thầy/Cô Hội Đồng Phản Biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án tốt nghiệp Em xin gửi đến Thầy/Cô lời chúc sức khỏe va Trong trıǹ h làm đồ án, kinh nghiệm còn thiếu kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong Thầy Cơ bỏ qua TP HCM, ngày tháng 08 năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thanh Hiếu ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Tình hình nghiên cứu 2.1 Ngoài nước: .2 2.2.Trong nước: 3.Mục đích nghiên cứu: 4.Mục tiêu nghiên cứu: Nội dung nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu: 6.1.Phương pháp luận: 6.2.Phương pháp xử lý số liệu: .4 Kết đạt được: CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .5 Tổng quan xử lý hạt giống: 1.1 Giới thiệu chung: .5 1.2 Các phương pháp khử nhiễm độc tố: .6 1.2.1 Phương pháp vật lý: 1.2.2 Phương pháp hóa học: 1.2.3 Phương pháp sinh học: Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng trồng: .12 iii Đồ án tốt nghiệp 2.1 Khả phân giải lân: 12 2.1.1 VSV phân giải lân hữu .13 2.1.2 VSV phân giải lân vô .14 2.2 Tạo màng sinh học biofilm 15 2.3 Khả sinh Indole-3-acetic acid (IAA) .17 Tổng quan vi khuẩn lactic 19 3.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp 19 3.2 Đặc điểm sinh lý 20 3.3 Đặc điểm sinh hóa 20 3.4 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 21 3.5 Quá trình trao đổi chất .23 3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men, trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic .28 3.7 Khả kháng nấm vi khuẩn lactic 29 3.7.1 Khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic 29 3.7.2 Các hợp chất kháng nấm .30 3.7.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác 37 3.8 Ứng dụng vi khuẩn lactic 40 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .42 2.1 Địa điểm nghiên cứu 42 2.2 Thời gian thực 42 2.3 Vật liệu nghiên cứu 42 2.3.1 Vật liệu 42 2.3.2 Hóa chất sử dụng 42 2.3.3 Thiết bị 43 2.3.4 Dụng cụ 43 2.4 Phương pháp luận 44 iv Đồ án tốt nghiệp 2.4.1 Mục tiêu đồ án 44 2.4.2 Nội dung .44 2.5 Phương pháp nghiên cứu 45 2.5.1 Sơ đồ nghiên cứu 45 2.5.2 Khảo sát độ khiết vi khuẩn lactic 46 2.5.2.1 Nhuộm gram 47 2.5.2.2 Nhuộm bào tử 48 2.5.2.3 Thử nghiệm Catalase 49 2.5.2.4 Thử nghiệm khả lên men đường .49 2.5.2.5 Khả di động .50 2.5.3 Khả phân giải lân 51 2.5.4 Khả sinh IAA .52 2.5.5 Khả tạo màng Biofilm 53 2.5.6 Chủng nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 54 2.5.6.1 Khảo sát phát triển loại môi trường 55 2.5.6.2 Khảo sát hình thái 55 2.5.7 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 56 2.5.8 Phương pháp khảo sát mơi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic 56 2.5.9 Xác định acid lactic .57 2.5.10 Xác định mật độ vi khuẩn 57 2.5.11 Phương pháp khảo sát khả bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 60 2.5.12 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N phát triển hạt giống .68 2.5.12.1 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N nảy mầm hạt 68 v Đồ án tốt nghiệp 2.5.12.2 Ảnh hưởng vi khuẩn Lactobacillussp L5, L3, L2N đến độ khỏe mầm đạu phộng 69 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70 3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá chủng vi khuẩn lactic: 70 3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: .70 3.1.2 Nhuộm Gram: 71 3.1.3 Nhuộm bào tử: .71 3.1.4 Thử nghiệm Catalase: 72 3.1.5 Thử nghiệm tính di động: 73 3.1.6 Thử nghiệm lên men loại đường .74 3.2 Khảo sát phát triển chủng nấm Aspergillus sp CĐP1 76 3.3 Khảo sát môi trường lên men thích hợp .78 3.3.1 Khảo sát khả sinh acid lactic mật độ tế bào chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 79 3.3.2 Khảo sát khả tạo màng sinh học biofilm chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 83 3.3.3 Đánh giá khả phân giải lân chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 86 3.3.4 Đánh giá khả sinh IAA chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 91 3.3.5 Đánh giá khả kháng nấm invitro chủng vi khuẩn lactic 93 3.5.6 Khảo sát khả bảo quản hạt đậu phộng 96 3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới phát triển hạt giống 100 3.3.7.1 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới khả phát triển đậu phộng ngày sau nảy mầm 100 vi Đồ án tốt nghiệp 3.3.7.2 Khảo sát khả ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm .104 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110 4.1 Kết luận 110 4.2 Kiến nghị 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic acid bacteria/ Lactobacillales VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn BVTV Bảo vệ thực vật IAA Indole-3-acetic acid EPS Extracellular polymeric substance MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm NT Nghiệm thức KĐC Khơng điều chỉnh MT Môi trường viii Đồ án tốt nghiệp Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 7.93 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MAU A 85.000 TN3-NT8 A A 83.333 TN1-NT12 A A 81.667 TN1-NT1 B 55.667 DC+ B B 49.000 DC- D5.5 Trọng lượng rễ đậu phộng ngày SINH KHOI RE NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 58 Đồ án tốt nghiệp Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 TRONG LUONG RE NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: SINH KHOI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 0.43537333 0.10884333 Error 10 0.32820000 0.03282000 Corrected Total 14 0.76357333 3.32 0.0565 R-Square Coeff Var Root MSE TRONGLUONG Mean 0.570179 47.84232 0.181163 Source DF MAU 0.378667 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 0.43537333 0.10884333 59 3.32 0.0565 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F TRONG LUONG RE XU NGAY The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONG Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.03282 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.3296 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N MAU 0.5900 TN1-NT12 A A 0.5800 TN3-NT8 A B A 0.2867 TN1-NT1 B B 0.2233 DC+ 60 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MAU B B 0.2133 DC- D5.6 Trọng lượng thân đậu phộng ngày TRONG LUONG THAN NGAY 7’ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 TRONG LUONG THAN NGAY 7’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONG Alpha 0.05 61 Đồ án tốt nghiệp Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.00814 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.1641 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N MAU 1.09000 TN1-NT12 A B A 1.04333 TN1-NT1 B A B A 1.03667 TN3-NT8 C 0.89667 DC- B B C C 0.86000 DC+ D5.7 Chiều dài rễ đậu phộng ngày 14 CHIEU DAI RE NGAY 14 The ANOVA Procedure 62 Đồ án tốt nghiệp Class Level Information Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 CHIEU DAI RE NGAY 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUDAI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1035.733333 258.933333 Error 10 304.666667 30.466667 Corrected Total 14 1340.400000 8.50 0.0030 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAI Mean 0.772705 6.747753 5.519662 Source MAU 81.80000 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 1035.733333 258.933333 8.50 0.0030 63 Đồ án tốt nghiệp Source DF Anova SS Mean Square CHIEU DAI RE NGAY 14 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUDAI Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 30.46667 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 10.042 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MAU A 89.333 TN1-NT1 A A 88.333 TN3-NT8 A A 88.000 TN1-NT12 B 72.667 DC- 64 F Value Pr > F Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MAU B B 70.667 DC+ D5.8 Chiều dài thân đậu phộng ngày 14 CHIEU DAI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 CHIEU DAI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUDAI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 65 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3932.933333 983.233333 Error 10 472.666667 47.266667 Corrected Total 14 4405.600000 20.80 F 3932.933333 983.233333 20.80 F Model 0.08602667 0.02150667 Error 10 0.06226667 0.00622667 Corrected Total 14 0.14829333 3.45 0.0509 R-Square Coeff Var Root MSE SINH KHOI Mean 0.580111 12.15235 0.078909 Source DF MAU 0.649333 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 0.08602667 0.02150667 3.45 0.0509 SINH KHOI RE CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SINH KHOI Alpha 0.05 68 Đồ án tốt nghiệp Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.006227 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.1436 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N MAU 0.72333 TN1-NT12 A B A 0.71667 TN3-NT8 B A B A 0.69000 TN1-NT1 C 0.57333 DC+ B B C C 0.54333 DC- D5.10 Sinh khối thân đậu phộng ngày 14 SINH KHOI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure Class Level Information 69 Đồ án tốt nghiệp Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 SINH KHOI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SINH KHOI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 0.63617333 0.15904333 Error 10 0.03480000 0.00348000 Corrected Total 14 0.67097333 45.70 F 0.63617333 0.15904333 45.70