Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ duchenne bằng kỹ thuật microsatellite

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG I HC Y H NI INH THUí LINH CHẩN ĐOáN TRƯớC SINH BệNH LOạN DƯỡNG CƠ DUCHENNE BằNG Kỹ THUậT MICROSATELLITE LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐINH THUÝ LINH CHÈN ĐOáN TRƯớC SINH BệNH LOạN DƯỡNG CƠ DUCHENNE BằNG Kỹ THUËT MICROSATELLITE Chuyên ngành: Sản phụ khoa Mã số: 62720131 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đức Hinh HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi Đinh Thuý Linh, nghiên cứu sinh khóa 33, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Sản phụ khoa, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn Thầy: PGS.TS.Nguyễn Đức Hinh 
 Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam 
 Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Người viết cam đoan Đinh Thuý Linh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BMD Becker Muscular Dystrophy (Bệnh loạn dưỡng Becker) CK Creatine Kinase CĐTS Chẩn đoán trước sinh DMD Duchenne Muscular Dystrophy (Bệnh loạn dưỡng Duchenne) DNA Deoxyribo Nucleic Acid GTTG Giải trình tự gen kb Kilo base MLPA Multiplex Ligation Probe Amplification NST Nhiễm sắc thể NST X Nhiễm sắc thể X NST Y Nhiễm sắc thể Y PCR Polymerase Chain Reaction PGD Preimplantation Genetic Diagnosis rfu Relative fluorescent unit RNA Ribo Nucleic Acid RPA Relative Peak Area RT – RCR Reverse transcription PCR (PCR mã ngược) STR Short tandem repeat (Trình tự lặp lại ngắn) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh loạn dưỡng Duchenne 1.2 Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng, điều trị bệnh loạn dưỡng Duchenne 1.2.1 Triệu chứng lâm sàng 1.2.2 Xét nghiệm cận lâm sàng 1.2.3 Điều trị dự phòng 11 1.3 Cơ chế di truyền bệnh loạn dưỡng Duchenne 15 1.3.1 Cơ chế di truyền 15 1.3.2 Cấu trúc gen dystrophin 17 1.3.3 Cấu trúc, chức Protein dystrophin 18 1.3.4 Các dạng đột biến gen dystrophin 20 1.4 Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne 21 1.4.1 Các kỹ thuật lấy bệnh phẩm chẩn đoán trước sinh 21 1.4.2 Các kỹ thuật di truyền ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne 24 1.4.3 Chẩn đoán tiền làm tổ bệnh loạn dưỡng Duchenne 35 1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh loạn dưỡng Duchenne Việt Nam giới 35 1.5.1 Trên giới 35 1.5.2 Tại Việt Nam 36 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Đối tượng nghiên cứu 38 2.2 Phương tiện nghiên cứu 38 2.2.1 Dụng cụ 38 2.2.2 Hóa chất 39 2.3 Phương pháp nghiên cứu 41 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 41 2.3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 43 2.3.3 Quy trình kỹ thuật 43 2.3.4 Sơ đồ nghiên cứu 50 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 51 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 52 3.1 Kết phát người lành mang gen bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật MLPA giải trình tự gen 52 3.1.1 Kết xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật MLPA 55 3.1.2 Kết xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật giải trình tự gen 66 3.2 Kết chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật Microsatellite DNA 71 3.2.1 Kết xác định marker STR dị hợp tử gen dystrophin kỹ thuật Microsatellite DNA 72 3.2.2 Kết chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật Microsatellite DNA 77 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 104 4.1 Phát người lành mang gen bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật MLPA giải trình tự gen 105 4.1.1 Xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật MLPA 110 4.1.2 Xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật giải trình tự gen 114 4.2 Chẩn đốn trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật Microsatellite DNA 116 4.2.1 Xác định marker STR dị hợp tử gen dystrophin kỹ thuật Microsatellite DNA 116 4.2.2 Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật Microsatellite DNA 118 KẾT LUẬN 135 KHUYẾN NGHỊ 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các marker STR ứng dụng nghiên cứu 41 Bảng 3.1 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh bà mẹ thành viên nữ 52 Bảng 3.2 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh theo tiền sử gia đình 53 Bảng 3.3 Số lượng thành viên nữ xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật MLPA giải trình tự gen 54 Bảng 3.4 Tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh 55 Bảng 3.5 Kết xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật MLPA 55 Bảng 3.6 Các dạng đột biến phát người lành mang gen bệnh kỹ thuật MLPA 56 Bảng 3.7 Kết xác định người lành mang gen bệnh kỹ thuật giải trình tự gen 67 Bảng 3.8 Các dạng đột biến điểm phát người lành mang gen bệnh kỹ thuật giải trình tự gen 67 Bảng 3.9: Tần suất phân bố alen marker STR 74 Bảng 3.10 Kết nuôi cấy tế bào ối làm NST đồ 79 Bảng 3.11 Tỷ lệ sẩy thai sau thủ thuật chọc hút nước ối 79 Bảng 3.12 Kết thai kỳ nhóm thai nam chẩn đốn bị DMD 80 Bảng 3.13 Kết chẩn đoán trước sinh DMD cho thai nhi thai phụ không phát đột biến từ mẫu máu 103 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Dấu hiệu Gower Hình 1.2 Cấu trúc phân tử mRNA dystrophin trưởng thành mơ hình micro mini dystrophin 14 Hình 1.3 Cơ chế di truyền bệnh loạn dưỡng Duchenne 16 Hình 1.4 Vị trí gen DMD NST X 17 Hình 1.5 Cấu trúc gen dystrophin 18 Hình 1.6 Minh họa kỹ thuật chọc ối 22 Hình 1.7 Minh hoạ kỹ thuật sinh thiết gai rau 23 Hình 1.8 Hình ảnh giải trình tự gen dystrophin người bệnh DMD 24 Hình 1.9 Kỹ thuật Southern blotting 25 Hình 1.10 Kỹ thuật Southern blotting xác định đột biến gen dystrophin 26 Hình 1.11 Quy trình kỹ thuật FISH 28 Hình 1.12 Hình ảnh xác định đột biến gen dystrophin kỹ thuật FISH29 Hình 1.13 Sơ đồ bước tiến hành kỹ thuật MLPA 31 Hình 1.14 Hình ảnh MLPA mẫu người bình thường (A), mẫu người bệnh DMD (B) mẫu mẹ người bệnh 31 Hình 1.15 Ứng dụng kỹ thuật Microsatellite chẩn đoán bất thường số lượng nhiễm sắc thể 34 Hình 1.16 Kỹ thuật Microsatellite DNA chẩn đốn trước sinh DMD 34 Hình 2.1 Phả hệ có tiền sử bệnh rõ ràng 42 Hình 2.2 Phả hệ có tiền sử bệnh không rõ ràng 42 Hình 2.3 Marker xác định giới tính thai nhi 47 Hình 2.4 Xác định marker STR dị hợp tử 48 Hình 2.5 Kỹ thuật Microsatellite DNA chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne 49 Hình 3.1 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh 52 Hình 3.2 Tỷ lệ dạng đột biến thành viên nữ 54 ... 1.4 Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne 21 1.4.1 Các kỹ thuật lấy bệnh phẩm chẩn đoán trước sinh 21 1.4.2 Các kỹ thuật di truyền ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne. .. người lành mang gen bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật MLPA giải trình tự gen  Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne người lành mang gen bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật Microsatellite DNA... ? ?Chẩn đốn trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật Microsatellite? ?? thực với hai mục tiêu: Phát người lành mang gen bệnh loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật MLPA giải trình tự gen Chẩn đốn trước sinh