Tài liệu Các Thao tác PCR pdf

I. Các Thao tác PCR 1. chuẩn bị: - Bật bếp nhiệt - Lấy eppendorf 1.7ml, đánh số thứ tự theo quy định, dùng kim tiêm vô trùng đục thủng 1 lổ nhỏ trên nắp tube 2. Lấy mẫu bệnh phẩm: - Post: lấy khoảng 50 – 70 con còn sống hoặc cố định trong cồn 95 0 . Dùng chẩn đoán WSSV, MBV, HPV thao tác cẩn thận không để nhiễm bệnh giữa các mẫu. - Mẫu tôm nuôi: lấy phần nhỏ mang của từ 10 – 15 con (tổng lượng không quá 1gr) dùng chẩn đoán WSSV, MBV, HPV Lấy mẫu RNA virus: TSV, YHV - Mẫu tơm giống: lấy khoảng 30-50 PL - Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10-15 con (tổng lượng mẫu không qúa 200 microgram). - Tơm bố mẹ: lấy mẫu cuốn mắt, chn bị, hoặc chn bơi hoặc một phần mang. - Mẫu gip xc hoang d: lấy một phần mang các loại động vật này (tổng lượng mẫu không qúa 200 microgram). Mẫu đã cố định trong cồn cần thấm sạch qua giấy trước khi cho vào eppendorf. 3. Tách chiết thô DNA - Cho mẫu vào eppendorf 1.7ml thêm vào 300µl dung dịch tách chiết DNA(NaOH 0.25N, SDS 0,125%) rồi dùng chày nghiền nhuyễn. Sau đó tiếp tục thêm 300 µl dung dịch tách chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi mẫu được nghiền hoàn toàn. Lấy chày ra đậy nắp và chuyển sang bếp nhiệt trong 5 – 10 phút. Sau đó lấy ra và làm lạnh nhanh các ống nghiệm trong đá(tủ lạnh) trong vài phút (Mẫu được sốc nhiệt nhằm phá vở màng tế bào và phá huỷ hoạt tính sinh học của một số chất có trong dịch chiết gây ảnh hưởng đến phản ứng PCR). 4. Ly tâm - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Sử dụng phần dịch nổi cho phân tích PCR hoặc giữ lạnh trong -20 0 C. 5. Nạp Mẫu - Thêm 5 µl nước cất 2 lan vào mỗi tube(pcr kit) có sẳn, sau đó lấy 2 µl mẫu phần dịch nổi cho vào ứng với mỗi tube. Thay đầu cone mỗi lần vào mẫu. 6. Chạy PCR - Bật máy PCR, nhan che do chay chuong trinh đến khi máy hoàn tất – complete 7. Điện di - Lấy tube ra đem điện di: lấy 10 µl dung dịch loading buffer cho vào mỗi tube trộn đều, bơm 20 µl dung dịch từ tube đã trộn trên ra máng thạch, 10 µl chứng dương. Khi bơm không để đổ ra ngoài, bơm không quá sâu. Đặt thẳng miếng thạch song song mép. Bật máy dd canh thời gian 30 phút và 100mA. Điện di xong, ngâm thạch vào Ethidium bromide 10 phút sau đó nhúng sơ qua nước rửa để sẳn(dùng nước lạnh thường). 8. Đọc Kết Quả - Lấy miếng thạch đặt trên máy phân tích hình ảnh gen(máy UV) và đọc kết quả. II. PHA CÁC HÓA CHẤT 1. Hố chất tch chiết thơ DNA Dung dịch 0,5 N NaOH: Cân 1 g NaOH cho vào ống định mức (ống falcon) 50ml thêm nước cất 2 lần vô trùng cho tới mức 50 ml của ống. Ta có được dung dịch 0,5N NaOH. Dung dịch 0,25% SDS: Cn 0,125 g SDS cho vào ống falcon 50 ml thêm nước cất 2 lần vô trùng cho tới mức 50 ml. Ta có được dung dịch 0,25 % (W/V) SDS. Dung dịch NaOH 0,25% - SDS 0,125%: 5ml NaOH 0,5N 5ml SDS 0,25% H 2 O đủ 100ml Bảo quản lạnh 4 o C 2.Pha dung dịch TBE 0.5X Từ dung dịch đệm điện di TBE 10X pha lỗng thnh dung dịch đệm TBE 0.5X như sau: Hút 50ml dd TBE 10X cho vào erlen lớn và bổ sung nước cất thành 1 lít dung dịch, lắc cho hỗn hợp trộn đều. Chuẩn bị bồn điện di: Đổ dung dịch TBE 0.5X cho đến vạch định mức của bồn điện di. 3.Chuẩn bị bản gel: 1. Cn 1,5 - 2 gam agarose vo chai chịu nhiệt 200ml, bổ sung dung dịch TBE 0.5X để được 100ml dung dịch, lắc đều. 2. Đun ở lò viba cho đến khi agarose tan hoàn toàn. 3. Khi agarose tan hồn toàn, lấy chai ra khỏi bếp và lắc nhẹ liên tục (không cho agarose đông ở thành chai) cho đến khi nhiệt độ giảm cịn 60 o C. 4. Đổ hỗn hợp Agarose trên vào khuôn bản gel có cài sẵn lược, bề dày thạch khoảng 4-5mm. Để yên khoảng 30 phút cho bản gel đông lại. 5. Khi bản gel đông, nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khuôn, khi đó trên bản gel xuất hiện các lỗ trống gọi là giếng. Đổ TBE 0.5X cho ngập mặt thạch. 6. Đặt cả khuôn và bản gel vào bồn điện di - . I. Các Thao tác PCR 1. chuẩn bị: - Bật bếp nhiệt - Lấy eppendorf 1.7ml, đánh số thứ tự. cố định trong cồn 95 0 . Dùng chẩn đoán WSSV, MBV, HPV thao tác cẩn thận không để nhiễm bệnh giữa các mẫu. - Mẫu tôm nuôi: lấy phần nhỏ mang của từ 10 –