Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi in vitro ở lợn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÊ THANH QUANG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 12/2015 i Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÊ THANH QUANG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 60 42 01 03 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VIỆT LINH HÀ NỘI, 12/2015 i Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Việt Linh, chủ nhiệm đề tài, người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán nghiên cứu Phịng Cơng nghệ Phôi đặc biệt TS Nguyễn Văn Hạnh, Ths Nguyễn Thị Hiệp, Ths Nguyễn Thị Nhung nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ góp ý để tơi hồn thành luận văn Luận văn hoàn thành với tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ quốc gia khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng giọt nỗn bào chất đơn tính lên hoạt hóa trứng phát triển phơi” mã số 106.12-2012.93 TS Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện thủ tục hành để tơi bảo vệ luận văn Cuối tơi xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, người sát cánh, ủng hộ suốt trình học tập thực luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 2015 11 tháng 12 năm Học viên Lê Thanh Quang Số hóa Trung tâm Học liệiu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC NỘI DUNG LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT PHẦN I MỞ ĐẦU PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Buồng trứng trình hình thành nang trứng 2.1.1.1 Đặc điểm buồng trứng 2.1.1.2 Quá trình hình thành phát triển nang trứng 2.1.1.3 Sự hình thành phát triển tế bào trứng 2.1.2 Sự thành thục tế bào trứng 2.1.3 Sự thụ tinh tế bào trứng động vật có vú 2.2 Sự thành thục trứng lợn in vitro (In vitro maturation – IVM) 2.3 Thụ tinh ống nghiệm nuôi phôi in vitro (In vitro fertilization, In vitro Culutre – IVF, IVC) 2.3.1 Thụ tinh ống nghiệm lợn Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii 2.3.2 Q trình ni phơi 15 2.4 Q trình ni phơi với tế bào đệm (co culture) 15 PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 20 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 20 3.3 Nội dung nghiên cứu tiêu theo dõi 20 20 3.4 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu nhận chất lượng tế bào trứng Phương pháp phân loại chất lượng trứng Phương pháp nuôi thành thục tế bào trứng lợn in vitro (In vitro maturation - IVM) Phương pháp đo nồng độ GSH nội bào Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi thành thục in vitro (IVM) Phương pháp thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng lợn với tinh trùng đông lạnh, giải đông Phương pháp nuôi phôi Phương pháp đánh giá chất lượng phôi nang Phương pháp xử lý số liệu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tn edu.vn iii PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phần I Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục nồng độ oxy khác tới khả thành thục tế bào trứng lợn Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục nồng độ oxy khác tới khả thành thục tế bào trứng lợn Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục nồng độ oxy khác tới nồng độ Glutahinone (GSH) tế bào trứng lợn Phần II Ảnh hưởng việc bổ sung tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 5.2 Đề nghị ẢNH MINH HỌA TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv DANH MỤC BẢNG Tên bảng Bảng Ảnh hưởng nồng độ cysteine lên thành thục in vitro tế bào trứng lợn nồng độ oxy 5% Bảng Ảnh hưởng nồng độ cysteine lên thành thục in vitro tế bào trứng lợn nồng độ oxy 20 % Bảng Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine tới nồng độ Glutathione tế bào trứng lợn sau nuôi thành thục in vitro nồng độ oxy 5% Bảng Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi tới nồng độ Glutathione trứng nồng độ 20% oxy Bảng Ảnh hưởng việc bổ sung tế bào đệm tới khả phân chia trứng lợn thụ tinh ống nghiệm Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới khả phát triển phơi vượt Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v qua giai đoạn 2-16 tế bào Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm đến giai đoạn phôi nang 38 Bảng Ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm đến chất lượng phôi nang DANH MỤC BIỂU ĐỒ Tên Biểu đồ Biểu đồ So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine mức nồng độ oxy khác tới khả thành thục tế bào trứng lợn Biểu đồ So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine mức nồng độ oxy khác tới nồng độ GSH tế bào trứng lợn Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới phân chia phát triển phôi tới giai đoạn 2-16 tế bào trứng lợn TTON Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới phân chia hình thành phôi nang trứng lợn TTON Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới phát triển phôi đến giai đoạn 2-16 tế bào hình thành phơi nang trứng lợn TTON Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới hình thành Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi 40 phôi nang chất lượng phôi nang trứng lợn TTON DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt FBS FM FSH GSH IVC IVF IVM LH MI MII MPN MEF NCSU 23 NCSU 37 NST Ống dẫn trứng pFF POEC PEEC PMSG TCM TN Kết thí nghiệm cho thấy, việc bổ sung tế bào đệm không ảnh hưởng tới chất lượng phôi nang Số tế bào phôi nang tương đương nhóm đối chứng nhóm ni kết hợp với tế bào sợi thai chuột, tế bào biểu mô ống dẫn trứng tế bào nội mạc tử cung lợn (26,6; 27,3; 29,9 32,3 tế bào/phôi, theo thứ tự) P>0,05 Tương quan ảnh hưởng tế bào đệm tới tỷ lệ hình thành phơi nang số tế bào/phôi nang thể biểu đồ Biểu đồ So sánh ảnh hưởng tế bào đệm tới hình thành phơi nang chất lượng phơi nang trứng lợn TTON Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 5.1.1 Ảnh hưởng việc bổ sung cysteine nồng độ oxy thấp (5%) việc bổ sung cysteine vào mơi trường nuôi không ảnh hưởng tới khả thành thục tế bào trứng lợn Ở nồng độ oxy cao (20%), bổ sung cysteine vào môi trường nuôi nồng độ 0,2 0,6 mM vào môi trường nuôi giúp tăng tỷ lệ thành thục tế bào trứng lợn Việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trứng làm tăng nồng độ GSH tế bào trứng Mức nồng độ GSH tế bào trứng cao (9,4 pmol/trứng) bổ sung cysteine nồng độ 0,6 mM 5.1.2 Ảnh hưởng tế bào đệm Tế bào biểu mô ống dẫn trứng lợn tế bào nội mạc tử cung lợn giúp giảm tỷ lệ phôi dừng lại giai đoạn 2-16 tế bào Nuôi kết hợp phôi với tế bào nội mạc tử cung lợn giúp tăng tỷ lệ hình thành phơi nang Tế bào biểu mô ống dẫn trứng tế bào nội mạc tử cung lợn có hiệu rõ rệt việc nuôi kết hợp với tế bào đệm 5.2 Đề nghị Trong nuôi thành thục tế bào trứng lợn, nên bổ sung cysteine vào môi trường nuôi nồng độ 0,6 mM Có thể dùng tế bào biểu mô ống dẫn trứng tế bào nội mạc tử cung lợn dùng nuôi kết hợp với phơi lợn in vitro Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 42 Tiếp tục có nghiên cứu sâu ảnh hưởng cysteine tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA Trứng lợn thu Trứng lợn ni in vitro 44-46 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 43 Trứng lợn thành thục (mũi tên thể cực thứ nhất) Trứng lợn thành thục (mũi tên dài nhân trứng, mũi tên ngắn nhân thể cực Phôi 2-4 tế bào Phôi nang Nuôi phôi (Đối chứng) Nuôi kết hợp với tế bào nội mạc tử cung lợn Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www .lrc.tnu.edu 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Đặng Nguyễn Quang Thành, Trần Thị Thơm, Nguyễn Thị Mến, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Dương Đình Long, Nguyễn Khắc Tích, Phan Ngọc Minh, Bùi Xuân Nguyên, (2008) “Nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa tổ hợp công nghệ ống nghiệm nhân vô tính” Tạp chí cơng nghệ sinh học, 6(4A), tr 625-635 Trần Tiến Dũng, Dương Đình Long, Nguyễn Văn Thanh (2002) Giáo trình sinh sản gia súc, Nhà xuất Nông nghiệp Tài liệu tiếng Anh Allworth A E., Albertini D F (1993) Meiotic maturation in cultured bovine oocytes is accompanied by remodeling of the cumulus cell cytoskelrton Dev Boil, 158; 101-112 Biggers JD, Gwatkin RB, Brinster RL (1962) Development of mouse embryos in organ cultures of fallopian tubes on a chemically defined medium Nauchni Tr Vissh Med Inst Sofiia, 194: 747–9 Bongso A., Soon-Chye N., Sathananthan H., Lian N.P., Rauff M., Ratnam S (1989) Improved quality of human embryos when co-cultured with human ampullary cells Human Reproduction, 4, 706–713 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 De Matos DG, Fumus CC (2000) The importance of having high glutathione (GSH) level after bovine in vitro maturation on embryo development: effect of beta-mercaptoethanol, cysteine and cystine Theriogenology 53: 761-771 Dobrinsky, Johnson LA, Rath D (1996) Development of a culture medium (BECM-3) for porcine embryos: Effects of bovine serum albumin and fetal bovine serum on embryo development Biol Reprod 55:1069–1074 Ellington J.E., Carney E.W., Farrell P.B., Simkin M.E., Foote R.H (1990) Bovine 1–2-cell embryo development using a simple medium in three oviduct epithelial cell coculture systems Biology of Reproduction, 43, 97–104 Eureau M, Mailey JL, Siirads MA ( 2000) Influence of oviductual cells and conditioned medium on porcine gametes Zygote, 8: 139-144 Eyestome, W H., J Vignieri and N L First (1987) Co-culture of early bovine embryos with oviductual epithelium Theriogenology 27: 228 Goto, K., Y Kajihara, M Koba, Y Nakanishi K Ogawa (1988b) Pregnancy in cattle after transfer of bisected blastocyst obtained from in vitro fertilization of oocytes matured in vitro Asian-Australian J Anim Sci 1: 153-156 10 Goto, K., Y Kajihara, S Kosaka, M Koba, Y Nakanishi and K Ogawa (1988a) Pregnancies after co-culture of cumulus cells with bovine embryos derived from in vitro fertilization of in vitro matured follicular oocyte J Reprod Fert 83: 573-578 11 Grupen C, Nagashima H, Nottle MB (1995) Cysteamine enhances in vitro development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro Biol Reprod 53: 173-178 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 46 12 Heidari B., Shirazi A., Naderi M.-M., Akhondi M.-M., Hasanpour H., Sarvari A., Borjian S (2013) Effect of various co-culture systems on embryo development in ovine Czech J.Anim.Sci., 58 (10), 443-452 13 Joo B.S., Kim M.K., Na Y.J., Moon H.S., Lee K.S., Kim H.D.K (2001) The mechanism of action of coculture on embryo development in the mouse model: direct embryo-to-cell contact and the removal of deleterious components Fertility and Sterility, 75, 193–199 14 Kątska-Książkiewicz L (2006) Pig embryo production by in vitromaturation and fertilization of ovarian oocytes A review Journal of Animal and Feed Sciences 15: 525–542 15 Kervancioglu M.E., Saridogan E., Atasü T., Camlibel T., Demircan A., Sarikamis B., Djahanbakhch O (1997) Human Fallopian tube epithelial cell co-culture increases fertilization rates in male factor infertility but not in tubal or unexplained infertility Human Reproduction, 12, 1253–1258 16 Kidson A, Schoevers E, Langendijk P, Verheijden J, Colenbrander B, Bevers M (2003) The effect of oviductal epithelial cell co-culture during in vitro maturation on sow oocyte morphology, fertilization and embryo development Theriogenology 59(9):1889–1903 17 Kidson A (2004) In vitro embryo development in the pig: impact of oocytes maturation milieu on blastocyst morphology and viabitility, Dissertation Utrecht University, Faculty of Veterinary Medicine 18 Kikuchi K, Naito K, Daen FP, Izaike Y, Toyoda Y (1995) Histone H1 kinase activity during in vitro fertilization of pig follicular oocytes matured in vitro Theriogenology 43:523–532 19 Kim NH, Funahashi H, Abeydeera LR, Moon SJ, Prather RS, Day BN (1996) Effects of oviductual fuild on sperm penetration and cortical Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47 granule exocytosis during fertilization of pig oocytes in vitro J Reprod Fertil, 107: 79-86 20 Koo DB, Kim NH, Lee HT, Chung KS (1997) Effects of fetal calf serum, amino acids, vitamins and insulin on blastocel formation and hatching of in vivo and IVM/IVF-derived porcine embryos developing in vitro Theriogenology 48:791– 802 21 Kuzan, F B and R W Jr Wright (1982) Blastocysts expansion, hatching and attachment of porcine embryos co-culutred with bovine fibroblast in vitro Anim Reprod Sci 5:57-63 22 Leibfried – Rutledge M.L., Critser E.S., Eyestone W.H., Northey D.L., and First N L (1987) Developmental potential of bovine oocytes matured in vitro or in vivo Biol Reprod 36 (2): 367-383 23 Leibfried L.and First N L (1979) Characterization of bovine follocular oocytes and their ability in vitro J Anim Sci 48; 76-86 24 Leibfried-Rutledge, M L., E S Critser, J.J Parrish and N L First (1989) In vitro matureation and fertilization of bovine oocytes Theriogenology 31: 61-71 25 Marcus S.F., Brinsden P.R (1996) In-vitrofertilization and embryo transfer in women aged 40 years and over Human Reproduction, 2, 459– 468 26 Meister A (1983) Selective modification of glutathione metabolism Science 220: 472-477 27 Nagai T Moor RM (1990) Effect of oviductual cells on the incidence of polyspermy in pig eggs fertilized in vitro Mol Reprod Dev, 26: 377-382 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 48 28 Nagai T (1996) In vitro maturation and fertilization of pig oocytes Anim Reprod Sci 42: 153-163 29 Orsi N.M., Reischl J.B (2007): Mammalian embryo co-culture: trials and tribulations of a misunderstood method Review Theriogenology, 67, 441– 458 30 Pushpakumara PG, Robinson RS, Demmers KJ, Mann GE, Sinclair KD, Webb R, Wathes DC (2002) Expression of the insulin-like growth factor (IGF) system in the bovine oviduct at oestrus and during early pregnancy Reproduction 123(6):859–868 31 Qian Y., Shi W Q., Ding J T., Liu J Y., Sha J H., Fan B., Q (2005) Effects of type and state of co-culture cells on in-vitro development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro Journal of Assisted Reproduction and Genetics, Vol 22, No 32 Rath D, Freitag K, Niemann H, Sieg B (1998) Continuous control of porcine embryo development in vitro Theriogenology 49:215 33 Rath D, Niemann H, Torres CRL (1995) In vitro development to blastocysts of early porcine embryos produced in vivo or in vitro Theriogenology 43:913–926 34 Rath D (1992) Experiments to improve in vitro fertilization techniques for in vivo matured porcine oocytes Theriogenology 37:885–896 35 Romar R., Coy P., Ruiz S., Gadea J., Rath D (2003) Effects of oviductual and cumulus cells on in vitro fertilization and embryo development of porcine oocytes fertilized with epididymal spermatozoa Theriology 59, 975-986 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 49 36 Romar R, Coy P, Campos I, Gadea J, Matas C, Ruiz S (2001) Effect of co-culture of porcine sperm and oocytes with porcine oviductual epithelial cells on in vitro fertilization Anim Reprod Sci, 68: 85-98 37 Smith S, Schmidt M, Purwantara B, Greve T(1992) Oviduct epithelialcell co-culture of early porcine embryos Acta Vet Scan 33:349–355 38 Stovsky P, Schatten G (1997) Depletion of glutathione during bovine oocyte maturation reversibly blocks the decondensation of the male pronucleus and pronuclear apposition during fertilization Biol Reprod 56: 1503-1512 39 Tanghe S., Van Soom A., Nauwynck H., Coryn M., De Kruif A (2002) Mini review: Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation, and fertilization” Mol Repord Dev (6); 414-424 40 Tatemoto H., Sakurai N., Muto N (2000) Protection of porcine oocytes against apoptoic cell death caused by oxidative stress during In vitro maturation: role of cumulus cells Biol Reprod 63; 805-810 41 Thompson JG (2000) In vitro and embryo metabolism of cattle and sheep embryos—a decade of achievement Anim Reprod Sci 60–61:263–275 42 Torres CRL, Rath D (1992) In vitro culture of porcine embryos to the blastocyst stage after in vivo and in vitro fertilization Theriogenology 37:283 43 Tucker M.J., Kort H.I., Toledo A.A., Morton P.C., Wrigh G., Ingargiola P.E., Sweitzer C.L (1995) Effect of coculture on subsequent survival and implantation of cryopreserved human embryos Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 12, 689–692 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 50 44 Voeke, S A., G F Amborski, K G Hill and R A Godke (1985) Use of uterine-cell monolayer culture system for micromanipulated bovine embryos Theriogenology 24: 271-281 45 Wetzels A.M.M., Bastiaans B.A., Hendriks J.C.M., Goverde H.J.M., van der Zalm A.P.E.M.P., Verbeet J.G.M., Braat D.D.M (1998) The effects of co-culture with human fibroblasts on human embryo development in vitroand implantation Human Reproduction, 13, 1325–1330 46 Wiemer K.E., Cohen J., Wiker S.R., Malter H.E., Wright G., Godke R.A (1989) Coculture of human zygotes on fetal bovine uterine fibroblasts: embryonic morphology and implantation Fertility and Sterility, 52, 503– 508 47 Wiemer, K E., R S Dennistion, G F Amborski, K L White and R A Godke (1987) A fetal fibroblast monolayer system of in vitro culture of bovine embryos J Anim Sci 65 (Suppl 1): 122 48 Xu J., Cheung T.M., Chan S.T., Ho P.C., Yeung W.S (2000) Human oviductal cells reduce the incidence of apoptosis in cocultured mouse embryos Fertility and Sterility, 74, 1215–1219 49 Yamauchi N, Nagai T Male pronuclear formation in denuded porcine oocytes after in vitro maturation in the presence of cysteamine Biol Reprod 1999; 61: 828-833 50 Yeung W.S., Ho P.C., Lau E.Y., Chan S.T (1992) Improved development of human embryos in vitroby a human oviductal cell co-culture system Human Reproduction, 7, 1144–1149 51 Yoshida M, Ishigaki K, Nagai T, Chikyu M, Pursel VG (1993) Glutathione concentration during maturation and after fertilization in pig Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 51 oocytes: relevance to the ability of oocytes to form male pronucleus Biol Reprod; 49: 89-94 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 52 ...VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÊ THANH QUANG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành:... tiến, kết tạo phơi lợn in vitro thấp so với hiệu suất tạo phơi lồi khác bị, cừu… khả tạo phơi thể Vì lý trên, tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu nâng cao hiệu hệ thống tạo phôi in vitro lợn? ?? với mục... trình thụ tinh in vitro trứng lợn Đối với hiệu suất tạo phôi lợn in vitro, số tác giả công bố thành công tượng mang thai tạo non lợn sau chuyển phôi lợn giai đoạn 2-4 tế bào tạo từ hệ thống IVM-IVF