Nghiên cứu khu hệ nấm rễ và đánh giá tác động của việc sử dụng chế phẩm nấm rễ lên năng suất và chất lượng của cây thuốc bạch chỉ (angelica dahurica (fisch ex hoffm ) benth et hook f ) ​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -  - ĐỖ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU KHU HỆ NẤM RỄ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA VIỆC SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM RỄ LÊN NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG CỦA CÂY THUỐC BẠCH CHỈ (ANGELICA DAHURICA (FISCH EX HOFFM.) BENTH.ET HOOK F.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn HÀ NỘI – 2015 VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -  - ĐỖ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU KHU HỆ NẤM RỄ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA VIỆC SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM RỄ LÊN NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG CỦA CÂY THUỐC BẠCH CHỈ ANGELICA DAHURICA (FISCH EX HOFFM.) BENTH.ET HOOK F Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ NHƯ HẰNG Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn HÀ NỘI – 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, nhận nhiều giúp đỡ thầy cơ, anh chị gia đình Với tất lịng chân thành, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Như Hằng người tận tình giúp đỡ, bảo, hướng dẫn tơi thực nghiên cứu, góp ý sửa chữa để tơi hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Trường Đại Học Thái Ngun tận tình truyền đạt cho tơi kiến thức suốt năm học tập, tảng cho tơi q trình nghiên cứu luận văn, hành trang quý báu theo suốt đời Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Mai Hương tập thể cán công tác phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hố học Hợp chất thiên nhiên giúp đỡ trình hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình thân yêu tôi, người bên tôi, ủng hộ động viên chỗ dựa vững để tơi n tâm học tập hồn thành khóa học Cuối tơi xin kính chúc q Thầy, Cơ, Anh, Chị gia đình dồi sức khỏe, thành cơng nghiệp! Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2015 Tác giả luận văn Đỗ Hồng Hải Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, chưa sử dụng cho bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho hoàn thành luận văn cảm ơn Các thơng tin, tài liệu trình bày luận văn ghi rõ nguồn gốc./ Tác giả luận văn Đỗ Hồng Hải Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG, BIỂU ix MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Giới thiệu khu hệ nấm cộng sinh đất rễ 1.2 Phân loại khu hệ nấm cộng sinh đất rễ 1.2.1 Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza) 1.2.2 Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza) 1.2.3 Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza) 1.3 Tính chuyên hóa khu hệ nấm cộng sinh đất rễ .8 1.4 Vai trò khu hệ nấm cộng sinh đất rễ chủ .9 1.4.1 Tăng khả hấp thụ P dinh dưỡng trồng .10 1.4.2 Hình thành chất kích thích sinh trưởng 10 1.4.3 Nâng cao sức chống chịu thích nghi với môi trường trồng 11 1.4.4 Cải thiện môi trường xung quanh 12 1.4.5 Tăng khả kháng bệnh trồng 12 1.5 Những nghiên cứu ứng dụng khu hệ nấm cộng sinh đất rễ 13 1.5.1 Trên giới 13 1.5.2 Ở Việt Nam 14 1.6 Tình hình phát triển dược liệu Việt Nam [1] 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii 1.7 Cây bạch (Angelica dahurica (Fisch ex Hoffm.) Benth.et Hook f.) 18 1.7.1 Tên khoa học .18 1.7.2 Nguồn gốc, phân bố 18 1.7.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái .19 1.7.4 Sản lượng 19 1.7.5 Hoạt tính sinh học (Tác dụng dược lý) .19 1.7.6 Thành phần hóa học 21 1.7.7 Hoạt chất imperatorin 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Đất rễ Bạch 24 2.1.2 Hóa chất thiết bị thí nghiệm 24 2.1.2.1 Hóa chất 24 2.1.2.2 Thiết bị phịng thí nghiệm .24 2.1.3 Môi Trường 25 2.1.3.1 Môi trường phân lập nấm vùng rễ 25 2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy, lên men giữ giống 25 2.1.3.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme 26 2.1.3.4 Mơi trường đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát khó tan .26 2.1.3.5 Mơi trường đánh giá khả sinh IAA 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp phân lập 26 2.2.1.1 Thu thập mẫu 26 2.2.1.2 Phân lập chủng nấm 27 2.2.2 Tuyển chọn chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử nghiệm 27 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv 2.2.2.1 Xác định hoạt khả hoà tan phosphat canxi chủng nấm phân lập 27 2.2.2.2 Xác định hoạt tính phân giải phốt phát khó tan chủng nấm lựa chọn 28 2.2.2.3 Đánh giá khả sinh tổng hợp Indole-3-acctic acid (IAA) chủng nấm lựa chọn 28 2.2.2.4 Xác định khả đối kháng chủng nấm lựa chọn 29 2.2.3 Định danh chủng nấm sinh học phân tử .29 2.2.4 Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng nấm lựa chọn 30 2.2.4.1 Xác định mơi trường ni cấy thích hợp chủng nấm lựa chọn 30 2.2.4.2 Xác định khoảng pH mơi trường ni cấy thích hợp chủng nấm lựa chọn 30 2.2.4.3 Xác định khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp chủng nấm lựa chọn 30 2.2.5 Tạo chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm 31 2.2.5.1 Lên men chủng nấm lựa chọn tạo sinh khối vi sinh vật 31 2.2.5.2 Quy trình phối trộn tạo chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm 32 2.2.6 Thử nghiệm chế phẩm bạch 32 2.2.6.1 Nghiên cứu tác động chế phẩm đến suất bạch 32 2.2.6.2 Nghiên cứu tác động chế phẩm đến hàm lượng chất imperatorin rễ củ bạch sau thu hoạch .35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Phân lập chủng nấm 38 3.2 Tuyển chọn chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử nghiệm 38 3.2.1 Khả hoà tan phosphat canxi chủng nấm phân lập 38 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 3.2.2 Xác định hoạt tính phân giải phốt phát khó tan chủng nấm lựa chọn 39 3.2.3 Đánh giá khả sinh tổng hợp Indole-3-acctic acid (IAA) chủng nấm lựa chọn 40 3.2.4 Xác định khả đối kháng chủng nấm lựa chọn 42 3.3 Định danh chủng nấm sinh học phân tử 42 3.4 Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng nấm lựa chọn để tạo chế phẩm 44 3.4.1 Ảnh hưởng môi trường lên men 44 3.4.2 Ảnh hưởng pH môi trường lên men 46 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men .47 3.5 Tạo chế phẩm thử nghiệm 48 3.6 Thử nghiệm chế phẩm .49 3.6.1 Tác động chế phẩm đến suất bạch 49 3.6.2 Tác động chế phẩm đến hàm lượng chất imperatorin rễ củ bạch sau thu hoạch 55 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 4.1 KẾT LUẬN .63 4.2 KIẾN NGHỊ 64 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN VĂN .65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 TIẾNG VIỆT 66 TIẾNG ANH 67 TRANG WEB 71 PHỤ LỤC 72 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT 10 11 12 13 14 15 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii 16 Gallo M.B.C., Guimarase D O., Luciano da S Momesso, Monica T Pupo (2008), “Natural Products from Endophytic Fungi”, Microbial Biotechnology, pp 139-168 17 Grenville D.J, Piche Y., Peterson R.L (1985), “Sclerotia as viable sources of mycelia for the establishment of ectomycorrhizae”, Canadian Joural of microbiology, 31, pp 1085-1088 18 Guhardja E., “Rainforest ecosystems of East Kalimanta” (2000), 19 Harvey, Linda M., (1991) “Cultural Techniques for Production of Ectomycorrhizal Fungi” Biotechnology Advances Vol 9, pp 1229 20 Hartnett, D.C and Wilson, G.W.T (1999) Mycorrhizae influence plant community structure and diversity in tall grass prairie Ecology 80, pp 1187-1195 21 Huda S.M.S., Uddin M.B., Haque M.M., “Horizontal distribution of ectomycorrhizal infection in Dipterocarpus turbinatus plantations of Bangladesh”, 17(1), pp 47-49 22 J Kang, L Zhou, J Sun, J Han, D.-A Guo (2008), Chromatographic fingerprint analysis and characterization of furocoumarins in the roots of Angelica dahurica by HPLC/DAD/ESIMSn technique, J Pharm Biomed Anal, 47(4-5), pp 778-785 23 James M Trappe (2010), “Fungus associates of ectotrophic mycorrhizae”, Botanical Review, pp 538-606 24 Jan-Erik Nylund (1978), “ The ectomycorrhizal infection zone and its relation to acids polysaccharides of cortical cell walls”, New Phytologist, 106, pp 505-516 68 25 Lakshman, H.C and Raghavendra, S (1990) Occurrence of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi in medicinal plants In: Proceedings of the Second National Conference on Mycorrhiza, Bangalore, 21-23 November, 1990 pp 21-23 26 Marx C., Dexheimer J., Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S (1982),“Enzymatic Studies on the Metabolism of Vesicular- Arbuscular mycorrhizas”, New Phytologist, 90(1), pp 37-43 27 Mei-ling XU, Jiao-jun ZHU , Hong-zhang KANG, Jin-xin Zhang, Feng-qin Li (2008), “Optimun conditions for pure culture of maijor ectomycorrhizal fungi obtained from Pinus Sylvestris var Mongolica platation in southeastern Keerpin sandy lands, China”, Journal of Forestry Research , Springer, pp 113-118 28 Misra and Kaushik B.D (1989), “Growth promoting substances of Cyanobacteria II”, Detection of amino acids, sugar and auxins, Proc India Natn Sci Acad, 55, pp.499-504 29 Redecker D., Kodner R., Graham L.E.2000, “Glomalean fungi from the Ordovician”, Science, 289, pp 1920-1921 30 Robson A.D., Abbott L.K., Malajczuk N (1994), “Management of mycorrhizas in agriculture horticulture and forestry”, Kluwer Academic, pp 112-124 31 Russell J., Rodriguez Regina S redman Joan M Henson (2005), “ Symbiotic Lifestyle Expression by Fungal Endophytes and the Adaption of plants to Stress: Unraveling the Complexities of Intimacy”, Taylor & francis Group, LLC 34, pp 683-695 32 S.E Smith and D.J Read (1997), “Mycorrhizal Symbiosis” (2nd Edition) Academic Press: London, UK, 2, pp 605 69 33 Selvaraj, T and Subramanian, G (1990) Incidence of vesicular arbuscular mycorrhizal fungi in medicinal plants In-Proceedings of the Second National Conference on Mycorrhiza, Bangalore, 21-23 November, 1990 pp 34-35 34 Shela G., Olga M.B., Elen K., (2003), “Comparison of the contents of the main biochemical”, Journal of nutritional Biochemistry, 14, pp 154-159 35 Simard, S.W., Perry, D.A and Jones, M.D., (1997) Net transfer of carbon between ectomycorrhizal tree species in the field Nature 388, pp 579-582 36 Tejavathi, D H., Anitha, P., Savitha M Murthy and Nijagunaiah, R (2011) Effect of AM fungal association with normal and micropropagated plants of Andrographis paniculata Nees on biomass, primary and secondary metabolites International Research Journal of Plant Online International Interdisciplinary Research Journal, {BiMonthly}, Volume-II, Issue-II, Mar-Apr2012 Science Vol 2(12) pp 338-348 37 Tian Chengming, Yang Junxiu, Liang Yingmei, Mo Yande (1995), “the Pharmaceutical fungi Resources and Ecological distribution in the Qingling mountain”, Journal of northwest forestry college, pp 04-05 38 Trappe, J.M (1987) Phylogenetic and ecological aspects of mycotrophy in the angiosperms from an evolutionary stand point In: Ecophysiology of VA mycorrhizal plants (Eds), Safir, G.R., Academic Press, New Yark pp 5-25 39 Turmel M.S.,(2004) “Exposing the Mycorrhizaes in Agriculture” University of Manitoba, Winnipeg, MB R3T 2N2 70 40 Vanden B.D.A., Vlietlinck A.J.,(1991), “Methods in Plant Biochemistry”, Academic press , NewYork 41 Vestberg M., Saari K., Kukkonen S., Hurme T., (2005) ”Mycotrophy of crops in rotation and soil amendment with peat influence the abundance and effectiveness of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi in field soil” Mycorrhiza 15(6), pp 447-458 42 Y Chen, Y Jin, Y Chen, Y Jin, X Liu, L Wang (2009) A Novel HPLC Method to Analyze Imperatorin and Isoimperatorin of Angelica dahurica Oils Obtained by Supercritical Fluid Extraction, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 32(16), pp 2384-2395 43 Warner, A and B Mosse (1980) Independent spread of Vesicular Arbuscular Mycorrhizal fungi in soil, Trans British Mycol Soc., 74, pp 407-410 44 Zhao, Z.W., Qin, X.Z., Li, X.W., Cheng, L.Z., Sha, T and Wang, G.H., (2001) Arbuscular mycorrhizal status of plants and the spore density of arbuscular mycorrhizal fungi in the tropical rain forest of Xishuangbanna, southwest China Mycorrhiza 11, pp 159-162 TRANG WEB 45 http://www.oiirj.org/oiirj/mar2012/12.pdf 46 http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/imperatorin#sectio n=Biological-Test-Results 71 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Hình ảnh phân lập chủng nấm Hình ảnh đối kháng chủng nấm 72 Hình ảnh xác định điều kiện nuối cấy tối ưu 73 PHỤ LỤC Cây phân loại chủng SH3 0.02 Phomopsis longicolla_HQ333500 Diaporthe melonis_FJ889447 50 Phomopsis cuppatea_AY339322 100 Phomopsis dauci_FJ889451 Diaporthe 65 57 angelicae_AY196779 93 Diaporthe stewartii_FJ889448 Phomopsis subordinaria_GQ92251964 58 SH3_ Diaporthe sojae_KJ590720 51 Diaporthe phaseolorum_JF896458 Diaporthe lusitanicae_EU814477 89 58 Diaporthe helianthi_EU878427 Diaporthe ambigua_AF230767 95 Phomopsis sclerotioides_AF439626 Diaporthe strumella var longispora_FJ889449 Diaporthe perjuncta_AY485785 87 74 Diaporthe neotheicola_EU814480 Diaporthe hickoriae_FJ889446 Diaporthe hongkongensis_KC343119 78 Diaporthe eres_EU805539 Diaporthe perniciosa_HQ908492 54 100100 Phomopsis co 57 82 Diaporthe medusaea_JQ807444 100 Diaporthe viticola_AY485750 Leucostoma cinctum_AF191170 Vị trí phân loại chủng SH3 với lồi có quan hệ họ hàng gần 74 Cây phân loại chủng SH4 0.01 Stemphylium tomatonis_AY329229 59 Stemphylium sedicola_AY329232 57 Stemphylium vesicarium_AF442803 50 Stemphylium alfalfae_AF442775 71 Stemphylium herbarum_AY329169 Stemphylium astragali_AF442779 60 Pleospora gigaspora_AY329177 56 61 Stemphylium majusculum_AY329228 92 Stemphylium triglochinicola_AY329175 58 paludiscirpi_AY329231 66 Stemphylium Stemphylium loti_AY32927 70 Stemphylium trifolii_AY329218 80 Stemphylium callistephi_AF442783 76 Stemphylium lancipes_AY329203 100 Stemphylium lycopersici_JF417683 Stemphylium xanthosomatis_AY329206 99 Stemphylium subglobuliferum_AY751454 100 SH4 Curvularia papendorfii_KJ90977 Vị trí phân loại chủng SH4 với lồi có quan hệ họ hàng gần 75 PHỤ LỤC Bảng theo dõi động thái sinh trưởng bạch Ngày theo dõi 27/1/2015 Ngày trồng 28/2/2015 28/3/2015 28/4/2015 28/5/2015 28/6/2015 Thu hoạch 76 Bảng theo dõi động thái sinh trưởng rễ củ bạch Ngày theo dõi 27/1/2015 Ngày trồng 28/2/2015 28/3/2015 28/4/2015 28/5/2015 28/6/2015 Thu hoạch 77 Phổ sắc ký đồ mẫu chất chuẩn imperatorin nồng độ 500µg/ml (a) dịch chiết MeOH mẫu rễ củ bạch BC1 nồng độ 10mg/ml (b) 78 Phổ sắc ký đồ mẫu chất chuẩn imperatorin nồng độ 500µg/ml (a) dịch chiết MeOH mẫu rễ củ bạch BC2 nồng độ 10mg/ml (b) 79 PHỤ LỤC Hình ảnh thử nghiệm 80 ... phẩm nấm rễ lên suất chất lượng thuốc bạch (Angelica dahurica (Fisch ex Hoffm. ) Benth. et Hook f .). ” Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tác động chế phẩm nấm rễ lên suất hàm lượng imperatorin thuốc Bạch. .. THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -  - ĐỖ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU KHU HỆ NẤM RỄ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA VIỆC SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM RỄ LÊN NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG CỦA CÂY THUỐC BẠCH CHỈ ANGELICA DAHURICA. .. Bạch (Angelica dahurica (Fisch ex Hoffm. ) Benth. et Hook f .) Nội dung nghiên cứu:   Khảo sát khu hệ nấm rễ bạch chỉ: Phân lập phân loại số chủng nấm rễ Tạo chế phẩm vi sinh  Thử nghiệm chế phẩm