Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài trần liên paphiopedilum tranlienianum bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o - ĐỖ NGỌC HÀ Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI TRẦN LIÊN (Paphiopedilum tranlienianum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K48 - CNSH Khoa : CNSH – CNTP Khoá học : 2015 – 2020 Giảng viên HD : ThS Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) phương pháp in vitro” Lời khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa ḷn tớt nghiệp này Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo ThS Nguyễn Thị Tình giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em thời gian thực hiện đề tài Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ tḥt viên phịng cấy mơ tế bào thực vật Khoa CNSH-CNTP đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn cho em suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và là chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập Trong quá trình thực tập, cũng là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn nên đề tài khơng thể tránh khỏi những sai sót Em mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này ii Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo nhà trường, khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn sinh viên có sức khoẻ, thành cơng cuộc sống Thái Nguyên, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện Đỗ Ngọc Hà iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau 14 ngày nuôi cấy) 34 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả tái sinh phôi lan 36 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh phôi Trần liên (sau tuần nuôi cấy) 38 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh phôi của lan Hài Trần liên 40 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả nhân nhanh giống (sau 30 ngày nuôi cấy) 42 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ lan hài Trần liên (sau tuần nuôi cấy) 45 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Trần liên (sau tuổi nuôi cấy) 47 Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả sinh trưởng phát triển của lan Trần liên 49 iv DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1: Hình ảnh về lan Hài Paphiopedilum tranlienianum 13 Hình 3.1 Quả lan Hài Trần Liên 23 Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu nhân giống loài lan Hài Trần liên 26 Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) lan Hài Trần Liên 35 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tái sinh phôi lan (%) 37 Biểu đồ 4.3 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA 39 Biểu đồ 4.4 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin 41 Biểu đồ 4.5 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin TDZ 43 Biểu đồ 4.6 Tỷ lệ mẫu rễ lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA 45 Biểu đồ 4.7 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với than hoạt tính 47 Biểu đồ 4.8 Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng của giá thể 49 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B5 : Gamborg cs, 1976 BAP : 6-Benzyl amino purine CS : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation – Hệ số biến động Đ/C : Đối chứng LSD : Least Singnificant DifferenceTest MS : Murashighe Skoog, 1962 MT : Môi trường GA3 : Gibberellic acid NAA : α-Napthalene acetic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế P : Paphiopedilum tranlienuanum tranlienuanum P malipoens : Paphiopedilum malipones WPM : Woody Plant Medium – Lioyd Mc Cown, 1980 vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu của đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về Lan Hài 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Sinh thái 2.1.4 Hiện trạng lan Hài Việt Nam 2.2 Tổng quan về Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) 11 2.2.1 Nguồn gốc sự phân bố của Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) ở Việt Nam 11 2.2.2 Hình Thái 12 2.2.3 Các điều kiện bản để ni trờng lồi lan Hài Trần Liên 13 2.3.4 Tổng quan về môi trường nuôi cấy thành phần dinh dưỡng sử dụng nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan Hài Trần Liên 14 2.4 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan hài thế giới và nước 19 vii 2.4.1 Trên thế giới 19 2.4.2 Trong nước 21 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 23 3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 23 3.1.2 Hoá chất sử dụng 23 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 24 3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 24 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 24 3.2.3 Thời gian nghiên cứu 25 3.3 Nội dung nghiên cứu 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 25 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giớng 26 3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 31 3.5 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá 31 3.5.1 Thu thập số liệu 31 3.5.2 Các chỉ tiêu theo dõi 31 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả tạo vật liệu vô trùng 34 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả tái sinh phôi lan Hài Trần Liên 36 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số Cytokinine đến khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên 38 viii 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi của lan Hài Trần Liên 38 4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh phôi lan hài Trần Liên 40 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine, TDZ đến khả nhân nhanh giống 42 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA than hoạt tính đến khả rễ lan 44 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả rễ của lan 44 4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ của lan hài Trần liên 46 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả sinh trưởng phát triển của lan 48 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Lan Hài là loài hoa đẹp có giá trị thẩm mĩ và kinh tế cao Được người yêu hoa và ngoài nước tìm kiếm, điều này đã dẫn đến hầu hết loài lan hài thế giới cũng của Việt Nam rơi vào mức báo đợng nguy tụt chủng ngồi tự nhiên Hài Trần Liên (hài Bắc Thái) một số loài lan hài đặc hữu của Việt Nam, có khu phân bớ hẹp (khu vực Bắc Kạn Thái Nguyên), hiện lan hài Trần Liên được tìm thấy ở khu vực đệm của Hồ Ba Bể - nơi xuất hiện nhiều loài phong lan, địa lan có giá trị thẩm mỹ Hài Trần Liên được nhiều nhà sưu tầm lan quan tâm bởi kiểu dáng độc đáo với điểm nhấn cánh môi của hoa ́n cong giớng hình chiếc hài hai cánh bên lượn sóng, màu đỏ thẫm, hấp dẫn người chơi lan Hài Trần Liên tái sinh phôi nếu kết hợp được với lồi nấm cợng sinh, khả tái sinh tự nhiên thấp, là ngun nhân thứ khiến lồi hoa có giá trị này được liệt kê vào phụ lục của công ước CITES danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006 Xuất phát từ thực tiễn em tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) phương pháp in vitro” 1.2 Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần liên từ phôi phương pháp in vitro 47 Bảng 4.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả rễ lan hài Trần liên (sau tuổi nuôi cấy) Công thức CT Nồng độ Số mẫu Tổng số Nồng độ Tỷ lệ mẫu NAA nuôi cấy chồi rễ THT (g/l) rễ (%) (mg/l) (mẫu) (chồi) 0,0 30 73,33 20 Chất lượng rễ Ngắn, mập 0,5 30 24 80 Ngắn mập 1,0 30 27 90 Dài mập CT 1,5 30 26 86,67 Dài nhỏ CT 2,0 30 23 78 Dài nhỏ CT 0,5 CT LSD05 5,5 CV (%) 6,2 100 90 90 80 86.67 80 78 73.33 70 60 50 Tỷ lệ mẫu rễ (%) 40 30 20 10 CT CT CT CT CT Biểu đồ 4.7 Hệ số nhân chồi (lần) lan chịu ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp với than hoạt tính Từ kết quả nghiên cứu cho thấy : Ở chỉ tiêu số lượng rễ: Với giá trị LSD05 đạt 5,5% các cơng thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa ở mức đợ tin cậy 95% Số lượng rễ thấp ở công thức đối chứng với 20 rễ, số lượng rễ cao bổ sung THT 1,0 g/l (CT3) với 27 rễ Khi tăng dần hàm lượng THT thì đồng thời số lượng rễ giảm 48 dần xuống Nguyên nhân là THT g/l tạo điều kiện cho sinh trưởng tốt nên tạo nhiều rễ nhất, nhiên hàm lượng THT tăng cao vượt quá ngưỡng cần thiết sẽ ức chế sinh trưởng và phát triển nên số lượng rễ sinh thấp Tỷ lệ rễ với giá trị LSD05 đạt 5,, Cặp CT2 và CT5 có sự sai khác khơng có ý nghĩa ở mức đợ tin cậy 95%, các công thức khác thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức đợ tin cậy 95% Các cơng thức có bở sung than hoạt tính đều có tỷ lệ mẫu rễ cao công thức đối chứng không bổ sung than hoạt tính (CT 1) Ở CT3 với hàm lượng than hoạt tính 1,0 g/l cho tỷ lệ mẫu rễ cao là 90% Tăng dần hàm lượng than hoạt tính từ 1,5 – 2,0 g/l tương ứng với CT4, CT5 thì tỷ lệ mẫu rễ có xu hướng giảm dần Ở chỉ tiêu chất lượng rễ: Các CT1, CT2, CT5 cho chất lượng rễ ngắn, mập Ở CT3 và CT4 tương ứng với hàm lượng than hoạt tính 1,0 ; 1,5 g/l cho rễ dài và mập Ở công thức đới chứng khơng bở sung than hoạt tính có số mẫu rễ ít Ở các công thức có bở sung than hoạt tính, hàm lượng than hoạt tính tăng thì khả rễ cùa cũng tăng, số lượng rễ tăng THT 0,5 g/l (CT2) tạo điều kiện tối kích thích chồi rễ nhiều CT1 (công thức Đ/c) Ở CT3 môi trường nuôi cấy có THT 1,0 g/l, ở hàm lượng này, THT thúc đẩy rễ nhanh và mạnh Tuy nhiên tăng dần hàm lượng THT lên 1,5 g/l (CT4) và g/l (CT5) thì ánh sáng không thể chiếu tới rễ mọc các bình nuôi cấy nên sẽ hạn chế sự phát triển của rễ, đồng thời THT ở hàm lượng cao sẽ ngăn cản quá trình trao đổi chất của chồi nên cũng hạn chế sự hình thành rễ của chồi 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể tới khả sinh trưởng và phát triển lan Đưa ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với điều kiện thay đổi của nhiệt độ, độ ẩm, sự nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Việc lựa chọn giá thể phù hợp để ngoài vườn ươm là một khâu phải thực hiện tỉ mỉ thận trọng Giá thể phù hợp giá thể cho tỉ lệ sống cao, sinh 49 trưởng, phát triển tớt.Vì vậy, thành cơng của giai đoạn này có ý nghĩa quan trọng quyết định tới hiệu quả nhân giống Để nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả sinh trưởng phát triển của lan , tiến hành nghiên cứu trên loại giá thể khác nhau: sơ dừa, dớn, đất, than, vỏ thông Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8: Bảng 4.8 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể tới khả sinh trưởng phát triển lan Trần liên Công thức (CT) CT CT CT CT CT5 Loại giá thể Đất Than Sơ dừa Dớn Vỏ thông LSD05 CV% 30 Tỷ lệ sống (%) 28 16 21 13 Số Số sống (cây) (cây) 30 30 30 30 30 28 21 16 13 Số Tỷ lệ chết chết (cây) (%) 18 17 23,33 70 93,33 53,33 43,33 7,5 9,1 28 25 21 20 16 15 10 13 CT CT CT CT Tỷ lệ sống (%) Biểu đồ 4.8 Tỷ lệ sống lan ảnh hưởng giá thể CT5 Chiều cao (cm) 5,5 4 50 Bảng kết quả ảnh hưởng của giá thể đến khả sinh trưởng và phát triển của con: Với giá trị LSD05 đạt 7,5% các cơng thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa ở mức đợ tin cậy 95% Giá thể sơ dừa cho tỷ lệ sống đạt 93,33%, chiều cao là 5,5 cm; giá thể còn lại cho tỷ lệ sống là 53,33%, 43,33%, 70%, 23,33%; chiều cao đạt cm từ thấy giá thể sơ dừa ảnh hưởng đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của in vitro ngồi vườn ươm thì chỉ tiêu tỷ lệ sớng là quan trọng 51 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau một thời gian nghiên cứu và thử nghiệm nuôi cấy lan hài Trần Liên Trong khuôn khổ thí nghiệm chúng đưa một số kết quả sau: - Dung dịch H2O2 25%, thời gian ngâm mẫu 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt cao là 65,55% - Môi trường tốt cho tái sinh phôi lan là môi trường MS với tỷ lệ tái sinh 66,67% - Hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng tốt cho giai đoạn nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên là: 2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l Kinetin+1,0mg/l TDZ bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho hệ số nhân đạt 2,83 lần - Hàm lượng NAA và THT tốt cho giai đoạn rễ là 0,5mg/l NAA+ 1g/l THT tỷ lệ rễ là 90%, chất lượng rễ dài và mập - Gíá thể thích hợp để đưa vườn ươm là giá thể sơ dưà 93,33% với chiều cao là 5,5cm 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hợp chất hữu và hàm lượng đường, agar và một số thành phần khác đến khả tái sinh, nhân nhanh lan 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp(2008), Lan Hài Việt Nam, Nxb Giao thơng Vận tải TP Hờ Chí Minh Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp II Dịch từ tiếng nước ngoài Nguyễn Tiến Hiệp, Phan Kế Lộc và Averyanov L V (1999),”Một vài số liệu mới về loài Pinopsida ở dải Bắc Trường Sơn, Hợi thảo về đa dạng sinh học phía Bắc Trường Sơn, Đại học Quốc gia Hài Nội, trang 104-108 Phan Kế Lộc, Averyanov L V., Nguyễn Tiến Hiệp và Nguyễn Quốc Bình,(1999),”Số liệu mới về hệ thực vật khu vực Ngọc Lĩnh và các vùng lân cận ở huyện Đắk Glei, tỉnh Kon Tum”, Tạp chí Lâm nghiệp Việt Nam (Hà Nội), số 12, trang 35-37 Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp và Averyanov L V (1999a), “Một số loài và quần xã thực vật bị đe doạ dãy núi đá vôi của tỉnh Cao Bằng cần được bảo vệ khu bảo tồn mới được đề xuất”, Tạp chí Lâm nghiệp Việt Nam (Hà Nội), số 12, trang 35-36 III Tiếng Anh Bubeck S.K (1973), A suty of Paphiopedilum meristem culture Ph.D Thesis, Rutgers University Microfilm International, Ann Arbor, Mivhigan, The USA, p.109 Chen T Y., Chen J T., Chang W C (2002), “Multiple shoot formation and plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev Biol Plant 38, p 595-597 53 Chen T Y., Chen J T., Chang W C (2004), “Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf culture of Paphiopedilum orchids”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 76, p 11-15 10 Hong P I., Chen J T., Chang W C (2008), “ Plant regeneration via protocorm-like body formation and shoot multiplication from seed-derived callus of a maudiae type slipper orchid”, Acta Physiol Pant 30, p 755-759 11 Huang L C (1988), “A procedure for asexual multiplication of Paphiopedilum in vtro, American Orchid Society Bulletin 57, p 274-278 12 Huang L C., Lin C J., Kou C I., Huang B L., Murashige T (2001), “Paphiopedilum cloning in vitro”, Scientia Horticulturae 91, p 111-121 13 Koopowitz H., Hasegawa N (1987), “An introduction to slipper orchids, in Koopowitz H., Hasegawa N (Eds), Novelty slipper orchids, breeding and cultivating Paphiopedilum hybirds”, Harper & Colloins publisher, Inc, New York, the USA, p 19-31 14 Liao Y J., Tsai Y C., Sun Y W., Lin R S., Wu F S (2011), “In vitro shoot induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum orchids”, In vitro Cell, Dev Biol plant 47, p 702-709 15 Lin Y.H., Chang c., Chang W.C (2000), “Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybird”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 62, P.21-25 16 Nieman D (1980), “Plantlet formation of Paphiopedilum flower stem”, American Orchid Society Bulletin 49, p 372-373 17 Nhut D T, Thuy D T T., Don N T., Luan V Q., Hai N T., Tran Thanh Van K., Chinnappa C C (2007), “In vitro stem elongation of Paphiopedilum delenatiii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture”, Propagation of Ornamental Plants 7, p 29-36 18 Nhut D T, Thuy D T T., Luan V Q., Don N T., Khiem D V., Tran Thanh Van K (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilum delenatii via stem node 54 culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology & BioSystem Engineering, p 184-190 19 Nhut D T., Trang P T T., Vu N H., Thuy D T T., Khiem D V., Binh N V., Tran Thanh Van K (2005), “ A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental Plants 5(3), p.156-161 20 Sampolinski J (1983), “Formation of plantlets on Paphiopedilum flower stem”, Orchid Review 91, p 229 21 Stewart J., Button J (1975), “Tissue culture studies in Paphiopedilum”, American Orchid Society Bulletin 44, p 591-599 22 Van Staden J, stewart J (1975), “Cytokinins in banana fruit”, Zpflanzenphysiol, 76: 280-283 23.phụ lục của công ước CITES danh mục Thực vật rừng, Đợng vật rừng nguy cấp, q hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ –CP ngày 30/3/2006 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN HÀI TRẦN LIÊN (paphiopedilum tranlienuanum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO Hình ảnh tạo vật liệu vơ trùng Hình ảnh tái sinh phơi lan sau tuần nuôi cấy Ảnh nhân nhanh chồi lan hài Trần Liên sau tuần nuôi cấy Ảnh rễ lan hài Trần liên sau tuần nuôi cấy Cây lan Hài Trần Liên PHỤ LỤC 2: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bảng 1: Môi trường MS Stock Bottle Component Solution (g/l) I II III IV V Amount to take preparation (ml) Final concentratic (mg/l) NH4NO3 82,5 KNO3 95 MgSO4.7H2O 37 MnSO4.4H2O 2,23 ZnSO4.7H2O 1,058 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 KI 0,083 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 KH2PO4 17 170,0 H3BO4 0,62 Na2MoO4.2H2O 0,025 FeSO4.7H2O 2,784 Na2EDTA.2H2O 3,724 20 1.650,0 1.900,0 370,0 10 10 10 22,3 10,6 0,83 6,2 0,25 10 27,85 37,25 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 30.0000,0 Agar 5.500,0 pH 5,6-5,8 Bảng 2: Thành phần môi trường B5 (Gamborg cs, 1976) Đa lượng Vi lượng Các chất hữu Ḿi khống Nờng dộ (mg/l) (NH4)2SO4 134 CaCl2.2H2O 150 MgSO4.7H2O 246 KNO3 2.258 MnSO4.2H2O 10 KI 0.75 Na2MoO4.2H2O 0.25 Na2H2PO4.2H2O 150 ZnSO4.7H2O 2.0 Na2EDTA.2H2O 37.2 H3BO3 CoCl2.6H2O 0.025 CuSO4.5H2O 0.025 FeSO4.7H2O 27.8 Myo- inositol 100 Nicotinic acid Pyrodoxine HCl Thiamine Đường 10 30 Bảng 3: Thành phần môi trường WPM (Woody Plant Medium Lioyd Mc Cown, 1980) Vi lượng Đa lượng Các chất hữa Muối khống Nờng đợ (mg/l) CuSO4.5H2O 0.25 Na2EDTA.2H2O 37.2 H3BO3 6.20 MnSO4.H2O 22.30 FeSO4.7H2O 27.8 ZnSO4.7H2O 8.6 CaCl2.2H2O 96 Ca(NO3)2.4H2O 556 KH2PO4 170 K2SO4 990 MgSO4.7H2O 370 NH4NO3 400 NaMoO4.2H2O 0.25 Myo – inositol 100 Pyridoxine HCl 0.5 Glycine 2.0 Nicotinic acid 0.5 Thiamine HCl 1.0 Agar Đường 30 ... tài: ? ?Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên (Paphiopedilum tranlienianum) phương pháp in vitro? ?? 1.2 Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh giống lan hài trần. .. trình nghiên cứu sau của lan 38 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ một số Cytokinine đến khả nhân nhanh lan Hài Trần Liên 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân. .. 4.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh phôi lan Hài Trần liên (sau tuần nuôi cấy) Kinetin (6-furfurolaminopurrine) một chất kích thích sinh trưởng