Thông tin tài liệu
LỜI CẢM ƠN! Trong suốt trình thực đề tài em nhận đƣợc giúp đỡ nhiệt tình từ thầy giáo viên hƣớng dẫn, chị, bạn gia đình Để có đƣợc kết nhƣ ngày hơm nay, em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Vũ Văn Hạnh – ngƣời trực tiếp bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi suốt trình thực đề tài Bên cạnh em xin gửi lời cảm ơn đến TS Vũ Kim Dung tạo điều kiện cho em đƣợc thực tập Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam Cơ tận tình giải đáp thắc mắc, khó khăn suốt q trình em thực đề tài Cũng xin gửi lời cám ơn đến chị, bạn cán công nhân viên chức thuộc phòng chất chức sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ, tận tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cám ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ, chỗ dựa vức cho em an tâm thực đề tài Do thời gian có hạn, lực cịn nhiều hạn chế nên khó tránh khỏi thiếu sót Vì vậy, em kính mong nhận đƣợc bảo ý kiến góp ý quý thầy cô, bạn bè bạn đọc để báo cáo đƣợc hoàn thiện Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2018 Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực PGS.TS Vũ Văn Hạnh Quách Thị Huyền Trang TS Vũ Kim Dung DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT B licheniformis Bacillus licheniformis CS Cộng VN Việt Nam DD Dung dịch MT Môi trƣờng KĐT Khô đậu tƣơng KLTN Khóa luận tốt nhiệp PTN Phịng thí nghiệm DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế tác động amylase lên tinh bột Hình 1.2 Cơ chế tác động cellulase lên endocellulose Hình 1.3 Vi khuẩn B.licheniformis (A) giai đoạn bào tử (B) 18 Hình 1.4 Khuẩn lạc B licheniformis hình thành mơi trƣờng thạch máu đĩa peptri Hình 1.5 Khuẩn lạc B licheniformis hình thành mơi trƣờng thạch đĩa (nhiệt độ 22oC) 19 Hình 1.6 Khuẩn lạc B licheniformis hình thành mơi trƣờng thạch đĩa (nhiệt độ 37oC) 20 Hình 3.1 Khuẩn lạc B licheniformis hình thành mơi trƣờng thạch LB 37 Hình 3.2 Hình dạng tế bào chủng B.licheniformis 37 Hình 3.3 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) glucose bƣớc sóng 540nm 38 Hình 3.4 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) cellulose bƣớc sóng 540nm 38 Hình 3.5 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) tyrosine bƣớc sóng 660nm 39 Hình 3.6 Ảnh hƣởng độ ẩm (%) giống (%) đến hàm lƣợng amylase 41 Hình 3.7 Ảnh hƣởng độ ẩm (%) giống (%) đến hàm lƣợng cellulase 42 Hình 3.8 Ảnh hƣởng độ ẩm (%) giống (%) đến hàm lƣợng protease 42 Hình 3.9 Mẫu thu mơi trƣờng HT sau lên men theo 45 Hình 3.10 Vịng phân giải tinh bột amylase thu MT HT nồng độ pha lỗng 500, 1000, 2000 lần 46 Hình 3.11 Vịng phân giải CMC cellulase thu MT HT nồng độ pha lỗng 500, 1000, 2000 lần 46 Hình 4.2 Vòng phân giải casein protease thu MT HT nồng độ pha loãng 500, 1000, 2000, 3000 lần 46 19 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Tỉ lệ bổ sung chất dựng đƣờng chuẩn glucose 30 Bảng 2.3 Tỉ lệ bổ sung chất dựng đƣờng chuẩn maltose 31 Bảng 2.4 Tỉ lệ bổ sung chất dựng đƣờng chuẩn tyrosine 31 Bảng 2.5 Tỉ lệ bổ sung chất dung xác định hoạt độ amylase 32 Bảng 2.6 Tỉ lệ bổ sung chất dùng xác định hoạt độ cellulase 32 Bảng 2.7 Ảnh hƣởng tỉ lệ chất đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 33 Bảng 2.8 Ảnh hƣởng nguồn muối khoáng đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 34 Bảng 2.9 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 35 Bảng 2.10 Ảnh hƣởng sau sấy đến hàm lƣợng enzyme 35 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng tỉ lệ chất đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 40 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nguồn muối khoáng đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 44 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp đa enzyme 44 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng sau sấy đến hàm lƣợng enzyme 45 Bảng 3.5 Số lƣợng khuẩn lạc thu đƣợc sau nuôi cấy nồng độ tƣơng ứng 47 MỤC LỤC CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan enzyme 1.1.1 Giới thiệu enzyme 1.1.1.1 Giới thiệu amylase 1.1.1.2 Giới thiệu cellulase 1.1.1.3 Giới thiệu protease 1.1.2 Tính chất 1.1.2.1 Tính chất amylase 1.1.2.2 Tính chất cellulase 1.1.2.3 Tính chất protease 1.1.3 Ứng dụng 1.1.3.1 Ứng dụng amylase 1.1.3.2 Ứng dụng cellulase 1.1.3.3 Ứng dụng protease 10 1.1.4 Nguồn thu nhận enzyme 10 1.1.4.1 Nguồn thu nhận amylase 11 1.1.4.2 Nguồn thu nhận cellulase 11 1.1.4.3 Nguồn thu nhận protease 12 1.1.5 Một số mơi trƣờng ni cấy kích thích vi sinh vật sinh enzyme (amylase, cellulase, protease) 13 1.1.6 Một số nghiên cứu enzyme (amylase, cellulase, protease) giới nƣớc 15 1.1.6.1 Nghiên cứu enzyme amylase 15 1.1.6.2 Nghiên cứu enzyme cellulase 16 1.1.6.3 Nghiên cứu enzyme protease 16 1.2 Tổng quan vi khuẩn Bacillus licheniformis 17 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu loài 17 1.2.2 Đặc điểm phân loại phân bố 17 1.2.3 Đặc điểm hình thái 17 1.2.4 Bào tử khả tạo bào tử 18 1.2.4.1 Bào tử 18 1.2.4.2 Khả tạo bào tử 18 1.2.5 Đặc điểm sinh hóa 19 1.2.6 Bộ gen 21 1.2.7 Bệnh học 21 1.2.8 Ứng dụng 22 CHƢƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.3 Vật liệu nghiên cứu 24 2.3.1 Vi sinh vật 24 2.3.3 Hóa chất 24 2.3.4 Thiết bị dụng cụ 25 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Phƣơng pháp nuôi cấy, hoạt hóa, giữ giống bảo quản vi khuẩn 25 2.4.1.1 Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn 25 2.4.1.2 Phƣơng pháp hoạt hóa B licheniformis 26 2.4.1.3 Phƣơng pháp giữ giống bảo quản 26 2.4.1.4 Phƣơng pháp nhuộm Gram 26 2.4.2 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 28 2.4.3 Nghiên cứu sinh tổng hợp đa enzyme từ chủng B licheniformis 29 2.4.4 Phƣơng pháp thu nhận, chiết tách xác định hoạt tính enzyme 29 2.4.5 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng yếu tố lí hóa, dinh dƣỡng đến khả sinh tổng hợp enzyme chủng Bacillus licheniformis 33 2.4.6 Phƣơng pháp thu thập xử lý số liệu 35 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Một số đặc điểm sinh học Bacilus licheniformis 37 3.2 Ảnh hƣởng yếu tố tới trình sinh tổng hợp enzyme 38 3.2.1 Dựng đƣờng chuẩn 38 3.2.1.1 Dựng đƣờng chuẩn glucose 38 3.2.1.2 Dựng đƣờng chuẩn maltose 38 3.2.1.3 Dựng đƣờng chuẩn tyrosine 39 3.2.2 Ảnh hƣởng yếu tố đến sinh tổng hợp enzyme 39 3.3 Xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 47 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 3 LỜI MỞ ĐẦU Trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học cơng nghệ sản xuất enzyme ngành quan trọng Enzyme chất xúc tác sinh học xúc tác cho phản ứng xảy thể sống, mà sau tách khỏi hệ thống sống, điều kiện định chúng giữ đƣợc hoạt tính xúc tác (Phạm Thị Trân Châu cs, 2007) Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng sản phẩm enzyme đƣợc nhiều quốc gia triển khai, đặc biệt nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, Đức, Nga, Trung Quốc đem lại lợi nhuận lớn Ở Việt Nam, công nghệ enzyme đƣợc nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vức nhƣng chƣa thực phát triển Các sản phẩm thƣơng mại có nguồn gốc enzyme chủ yếu theo đƣờng nhập nội vào VN với giá thành cao Enzyme amylase, cellulose protease nhóm enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nhƣ công nghệ sản xuất rƣợu bia, công nghệ thực phẩm, y học, sản xuất thức ăn chăn ni… Vai trị chủ yếu enzyme amylase, cellulase, protease thủy phân tinh bột, cellulose thủy phân liên kết peptide protein Những enzyme đƣợc trích ly từ nguồn động vật, thực vật, vi sinh vật, vừa mang nguồn gốc tự nhiên vừa không độc với ngƣời nên đƣợc ƣa chuộng sử dụng rộng rãi Trong ba nguồn kể sản xuất enzyme từ vi sinh vật tối ƣu cả, nguồn gốc dễ kiếm, dễ phân lập, số lƣợng tăng nhanh thời gian ngắn, môi trƣờng tăng sinh sản xuất enzyme dễ kiếm, rẻ tiền (Nguyễn Đức Lƣơng, 2008) Do tơi thực đề tài “Nghiên cứu số đặc tính sinh học tối ưu điều kiện ni cấy kích thích chủng Bacillus Licheniformis sinh tổng hợp đa enzyme (amylase, cellulase, protease) cao” nhằm tạo nguồn sản phẩm enzyme dồi dào, có chất lƣợng tốt phục vụ cho chăn nuôi CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan enzyme 1.1.1 Giới thiệu enzyme Enzyme (hay gọi men) chất xúc tác sinh học có thành phần protein Trong trình sống sinh vật xảy nhiều phản ứng hóa học, với hiệu suất cao, điều kiện bình thƣờng nhiệt độ, áp suất, pH Sở dĩ nhƣ có diện chất xúc tác sinh học đƣợc gọi chung enzyme Nhƣ vậy, enzyme protein xúc tác phản ứng hóa học Trong phản ứng này, phân tử lúc bắt đầu trình đƣợc gọi chất, enzyme biến đổi chúng thành phân tử khác Tất trình tế bào cần enzyme Enzyme có tính chọn lọc cao chất Hầu hết phản ứng đƣợc xúc tác enzyme có tốc độ cao nhiều so với không đƣợc xúc tác Có 4000 phản ứng sinh hóa đƣợc xúc tác enzyme Hoạt tính enzyme chịu tác động nhiều yếu tố Chất ức chế phân tử làm giảm hoạt tính enzyme, yếu tố hoạt hóa phân tử làm tăng hoạt tính enzyme 1.1.1.1 Giới thiệu amylase Amylase hệ Enzyme phố biển giới sinh vật Các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide với tham gia nƣớc (Trần Bích Lam cs, 2009) Hình 1.1 Cơ chế tác động amylase lên tinh bột Amylase thủy phân tinh bột, glycogen dextrin thành glucose, maltose dextrin Các enzyme amylase có nƣớc bọt (cịn đƣợc gọi ptyalin), dịch tiêu hóa ngƣời động vật, hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men vi khuẩn Trong nƣớc bọt ngƣời có ptyalin nhƣng số loại động vật có vú khơng có nhƣ ngựa, chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng q trình hồn tất ruột non nhờ amylase tuyến tụy (còn đƣợc gọi amylopsin) Amylase malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm chất cho trình lên men nấm men Amylase loại enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi công nghiệp, y tế, nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm (Trần Bích Lam cs, 2009) 1.1.1.2 Giới thiệu cellulase Cellulose thành phần tế bào thực vật Vì vậy, có mặt loại rau quả, nguyên liệu, phế liệu ngành trồng trọt, lâm nghiệp Tuy nhiên ngƣời động vật khơng có khả phân hủy cellulose Nó có giá trị làm tăng tiêu hóa, nhƣng với lƣợng lớn trở nên vơ ích hay cản trở tiêu hóa Cellulase phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β 1-4 -glucoside cellulose thành đƣờng (Barkalow cs, 2014) Cellulase enzyme đƣợc sản xuất chủ yếu nấm, vi khuẩn protozoa xúc tác cho tan tế bào, phân hủy cellulose số polysaccharide liên quan (Worthington Biochemical Corporation, 2014) Chế phẩm cellulase thƣờng dùng để tăng chất lƣợng thực phẩm, trộn thức ăn gia súc tăng hiệu suất trích ly chất từ nguyên liệu thực vật 1.1.1.3 Giới thiệu protease Protease (cịn đƣợc gọi proteinase hay peptidase) (EC.3.4) nhóm Enzyme thủy phân có khả cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) phân tử polypeptide, protein số chất khác tƣơng tự thành amino acid tự peptide phân tử thấp Trong phản ứng, protease khác có hƣớng xúc tác khác 1.1.2 Tính chất 1.1.2.1 Tính chất amylase Amylase nƣớc bọt (ptyalin): Chức phân giải tinh bột thành maltose dextrin Nó phân giải phân tử tinh bột lớn khơng hịa tan thành tinh bột hòa tan (amylodextrin, erythrodextrin, achrodextrin), tạo đoạn tinh bột nhỏ cuối maltose Ptyalin hoạt động mối liên kết α (1,4) glycosidic thẳng Amylase nƣớc bọt bị bất hoạt dày acid dày Trong dịch vị có pH 3,3, ptyalin bị bất hoạt hồn tồn vịng 20 phút 37°C Ptyalin cho vào pH 3.0 bất hoạt hoàn toàn 120 phút, nhiên, bổ sung tinh bột mức 0,1% có 10% enzym cịn hoạt động, bổ sung tƣơng tự tinh bột đến nồng độ 1,0% có khoảng 40% enzym hoạt động lại 120 phút (Trần Định Toại, Nguyễn Thị Văn Hân, 2005) Amylase tuyến tụy: amylase tụy phân cắt ngẫu nhiên liên kết α (1-4) glycosidic amylose tạo dextrin, maltose, maltotriose Nó thơng qua chế chuyển đổi với việc giữ cấu hình anomeric (Nguyễn Hữu Chấn, 1983) 1.1.2.2 Tính chất cellulase Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên dẫn xuất nhƣ carboxylmethyl cellulose (CMC) hydroxyethyl cellulose (HEB) Cellulase cắt liên kết β -1,4 glucosid cellulose, lichenin β - D - glucan ngũ cốc Bởi phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, việc tách cellulose tƣơng đối khó khăn so với phân hủy polysaccharides khác nhƣ tinh bột (Barkalow cs) Độ bền nhiệt tính đặc hiệu chất khác Cellulase hoạt động pH từ 3-7, nhƣng pH tối thích khoảng 4-5 Nhiệt độ tối ƣu từ 40-50oC Hoạt tính cellulase bị phá hủy hồn tồn 80oC 10-15 phút Cellulase bị ức chế sản phẩm phản ứng nhƣ glucose, cellobiose bị ức chế hoàn toàn Hg Ngoài ra, cellulase bị ức chế ion kim loại khác nhƣ Mn, Ag, Zn nhƣng mức độ nhẹ (Nguyễn Hữu Chấn, 1983) 3.2 Ảnh hưởng yếu tố tới trình sinh tổng hợp enzyme 3.2.1 Dựng đường chuẩn 3.2.1.1 Dựng đường chuẩn glucose Hình 3.3 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) glucose bước sóng 540nm 3.2.1.2 Dựng đường chuẩn maltose Hình 3.4 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) maltose bước sóng 540nm 38 3.2.1.3 Dựng đường chuẩn tyrosine Hình 3.5 Kết đo giá trị mật độ quang (OD) tyrosine bước sóng 660nm 3.2.2 Ảnh hưởng yếu tố đến sinh tổng hợp enzyme - Ảnh hƣởng tỉ lệ cám gạo, cám ngô, khô đậu tƣơng Tỉ lệ chất ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp đa enzyme + Cám gạo (hay đƣợc gọi gạo mịn, gạo bóng số nƣớc) bao gồm aleurone, lớp vỏ gạo với vài chất nội nhũ đƣợc sản sinh trình nghiền gạo cám gạo Bao gồm 10-14% protein, 15-35% tinh bột tỉ lệ cao dầu (12-20%), chất sợi (6-14%) Lee cộng (2010) nhận thấy cám gạo nguồn carbon tốt cho tăng trƣởng tế bào sản xuất cellulase Bacillus subtilis subsp subtlis A-5 (Kim JY cs, 2005) Jo et al Mayende et al, cho biết thân vỏ gạo cám gạo sinh khối nông nghiệp tốt cho sản xuất CMCase B amyloliquefaciens DL-3 Bacillus sp CH 43, tƣơng ứng + Ngô thức ăn giàu lƣợng chất dinh dƣỡng, ngơ có lƣợng cao loại ngũ cốc: 3300 - 3450 Kcal/kg, có 8-10% protein thô, 2% xơ, 4,5% lipid, 0,1 % canxi, 0,3 % phospho tổng số 39 + Khơ đậu tƣơng: Có tỷ lệ protein cao, hạt 36-39%, khô dầu 4447%; hạt tỷ lệ dầu 14%, khô dầu 1,1-2% Có tỷ lệ dầu cao nên hạt có lƣợng trao đổi cao 3380-3400 Kcal/kg, khô dầu 2250-2850 Kcal/kg Đỗ tƣơng có tỷ lệ lyzin cao 2,9-3% Tiến hành nuôi chủng B.licheniformis công thức môi trƣờng NT HT có tỉ lệ cám gạo: cám ngơ: KĐT nhƣ sau NT: 80% cám gạo : 10% cám ngô : 10% KĐT HT: 45% cám gạo : 45% cám ngô : 10% KĐT Kết đƣợc ghi lại bảng 3.1 hình 3.2 Bảng 3.1 Ảnh hưởng tỉ lệ chất đến khả sinh tổng hợp đa enzyme Hoạt độ Amylase Hoạt độ Cellulase Hoạt độ Protease (U/g) ± SE (U/g) ± SE (U/g) ± SE NT 1187,5 ± 5,2 1291,67 ± 10,5 431,5 ± 3,4 HT 1200 ± 8,8 1666,67 ± 7,2 552,5 ± 5,3 CTTN Qua số liệu thu đƣợc nhƣ bảng 3.1 cho thấy: Mơi trƣờng có bổ sung thành phần cám gạo 45%, cám ngơ 45%, KĐT 10% thích hợp cho khả sinh enzyme Khi tăng hàm lƣợng cám ngô lên 35% đồng thời giảm lƣợng cám gạo 35% so với CT lại; hàm lƣợng amylase, cellulase, protease MT HT lần lƣợt (1200 ± 8,8; 1666,67 ± 7,2; 552,5 ± 5,3U/g), hàm lƣợng enzyme MT NT lần lƣợt (1187,5 ± 5,2; 1291,67 ± 10,5; 431,5 ± 3,4 U/g) Mơi trường có thành phần cám gạo 45%, cám ngô 45%, KĐT 10% thích hợp cho sản sinh enzyme chủng B licheniformis - Ảnh hƣởng độ ẩm chất tỉ lệ giống lên men xốp + Độ ẩm chất môi trƣờng lên men xốp yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp enzyme từ B.licheniformis Độ ẩm 40 ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển vi khuẩn mà ảnh hƣởng đến khả tạo bào tử Nếu mơi trƣờng q khơ kìm hãm phát triển vi khuẩn, môi trƣờng ƣớt gây ức chế sinh trƣởng vi khuẩn làm giảm độ thống khí, giảm lƣu oxi mơi trƣờng làm giảm khả sinh tổng hợp enzyme + Tỉ lệ giống yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp đa enzyme, tỉ lệ giống cao hay thấp tốc độ chuyển hóa chất bị ảnh hƣởng, nhƣng bổ sung q nhiều gây lãng phí nguồn giống có canh tranh chất dẫn tới sinh tổng hợp đa không cao enzyme Trong lên men xốp, bổ sung giống phần bổ sung độ ẩm nên thí nghiệm đƣợc tiến hành đồng thời để xác định % độ ẩm tỉ tệ % giống thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme Thí nghiệm sử dụng mơi trƣờng HT với cám gạo 45%, cám ngô 45%, KĐT 10% Hình 3.6 Ảnh hưởng độ ẩm (%) tỷ lệ giống (%) đến hàm lượng amylase 41 Hình 3.7 Ảnh hưởng độ ẩm (%) giống (%) đến hàm lượng cellulase Hàm lƣợng giống (%) Hình 3.8 Ảnh hưởng độ ẩm (%) giống (%) đến hàm lượng protease Từ số liệu thu nhận đƣợc ta thấy rằng, độ ẩm % giống đƣợc bổ sung vào mơi trƣờng chất có ảnh hƣởng lớn đến khả sinh enzyme Đối với công thức độ ẩm khác hàm lƣợng enzyme thu đƣợc khác nhau, công thức độ ẩm thấp cho giá trị enzyme amylase, cellulase, protease lần lƣợt (514,3 ± 6,8; 325,9 ± 2.4; 1032 ± 3,4U/g); Công thức độ ẩm cao cho hoạt 42 độ enzyme lần lƣợt là1200 ± 11,1; 1291,8 ± 12,7; 525 ± 5,3 (U/g) Trong mơi trƣờng có hàm lƣợng nƣớc tăng dần % giống tăng dần enzyme thu đƣợc tăng lên nhƣng tăng độ ẩm lên 50% với % giống sau nuôi cấy có mùi thiu thối khó chịu, mơi trƣờng bị nhũn nhớt không áp dụng nghiên cứu cho độ ẩm trở lên Hàm lƣợng tăng tƣơng đối ổn định công thức Công thức độ ẩm thấp 20% với công thức bổ sung giống 10%, 15%, 20% có hàm lƣợng enzyme lần lƣợt nhƣ sau: Amylase 514,3 ± 6,8; 857,1 ± 6,2; 1011,4 ± 7,6 (U/g), Cellulase 352,9 ± 2,4; 617,6 ± 4,2; 776,5 ± 9,2(U/g), Protease (103,2 ± 3,4; 198.8 ± 5,5; 206,4 ± 4,2 U/g) Cơng thức có độ ẩm cao 40% với công thức bổ sung giống 10%, 15%, 20% có hàm lƣợng enzyme lần lƣợt nhƣ sau: Amylase 925,7 ± 6,2; 1045,7 ± 8,5; 1200,0 ± 11,1 (U/g), Cellulase705,9 ± 11,8; 1094,1 ± 13,5; 1291,8 ± 12,7 (U/g), Protease (321,6 ± 6,4; 423,3 ± 8,2; 552.5 ± 5,3 U/g) Lựa chọn môi trường độ ẩm 40 %, bổ sung 20% giống thích hợp cho sinh trưởng, sản sinh enzyme chủng B licheniformis - Ảnh hƣởng muối khoáng đến khả sinh tổng hợp enzyme Thành phần mơi trƣờng có ảnh hƣởng mạnh đến phát triển B.licheniformis, khơng thể bỏ qua đƣợc vai trị ngun tố khống Vì vậy, thí nghiệm nhằm xác định ảnh hƣởng nguồn muối khoáng sau: CaO, KH2PO4, MgSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, MnCl2, FeSO4.7H2O loại cho 0,2% CT đối chứng không bổ sung muối khoáng đến khả sinh tổng hợp enzyme môi trƣờng xốp sử dụng môi trƣờng chất HT, độ ẩm 40%, tỉ lệ giống 20% 43 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nguồn muối khoáng đến khả sinh tổng hợp đa enzyme Muối khoáng Amylase (U/g) ± Cellulase (U/g) ± Protease (U/g) ± SE SE SE CaO 1350,0 ± 3,3 2291,7 ± 12,6 372,0 ± 4,5 KH2PO4 437,5 ± 6,3 416,7 ± 4,8 138,3 ± 8,8 MgSO4.7H2O 1212,5 ± 7,6 1708,3 ± 6,6 489,1 ± 4,9 ZnSO4.7H2O 1225,0 ± 4,6 1750,0 ± 9,6 512,0 ± 6,4 MnCl2 1562,5 ± 5,0 1791,7 ± 7,6 573,5 ± 3,7 FeSO4.7H2O 1612,5 ± 8,0 2125,0 ± 6,1 794,5 ± 4,8 ĐC 1200,0 ± 8,8 1666,7 ± 7,2 552,5 ± 5,3 Từ kết bảng 3.2 ta thấy rằng: Sự có mặt ion kim loại Ca2+, Fe2+ hỗn hợp phản ứng kích thích hoạt động enzym, ion kim loại Mn2+, Zn2+làm cho chúng tăng lên cách vừa phải Hoạt tính bị ức chế mạnh ion K+ FeSO4.7H2O muối khống thích hợp cho sinh trưởng, sản sinh enzyme chủng B licheniformis - Ảnh hƣởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp enzyme Sử dụng môi trƣờng chất HT, độ ẩm 40%, tỉ lệ giống 20%, FeSO4.7H2O 0,2% chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy thời gian khác nhau: 24 giờ, 48 giờ, 72giờ, 96 nuôi tủ ấm Kết đƣợc ghi lại bảng 3.3 hình 3.9 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp đa enzyme Amylase (U/g) ± Cellulase (U/g) ± Protease (U/g) ± SE SE SE 24 705,9 ± 6,8 128,5 ± 7,3 48 977,1 ± 5,9 1500,0 ± 11,2 327,9 ± 4,6 72 1440,0 ± 6,7 1941,2 ± 9,5 615,3 ± 5,7 96 1612,5 ± 8,0 2125 ± 6,1 794,5 ± 4,8 Thời gian (giờ) 44 Hình 3.9 Mẫu thu mơi trường HT sau lên men theo Qua kết từ bảng hình ta thấy hoạt độ enzyme tăng theo giờ, hàm lƣợng enzyme từ 24 đến 96 lần lƣợt nhƣ sau: Amylase (0; 977,1 ± 5,9; 1440,0 ± 6,7; 1612,5 ± 8,0 U/g ), Celullase (705,9 ± 6,8; 1500,0 ± 11,2; 1941,2 ± 9,5; 2125 ± 6,1 U/g), Protease (128,5 ± 7,3; 327,9 ± 4,6; 615,3 ± 5,7; 794,5 ± 4,8 U/g) Nhìn hình 3.9 (từ trái qua phải, từ xuống dƣới) màu sắc chất biến đổi dần từ màu nâu vàng sang nâu đen chứng tỏ vi khuẩn hoạt động mạnh sản sinh enzyme chuyển hóa chất Như vậy, ni cấy B.licheniformis 96 cho lượng enzyme cao - Đánh giá thay đổi hàm lƣợng enzyme (amylase, cellulase, protease) sau sấy Sử dụng môi trƣờng chất HT, độ ẩm 40%, tỉ lệ giống 20%, FeSO4.7H2O 0,2% chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy ngày sau đƣợc đem sấy khơ Bảng 3.4 Ảnh hưởng sau sấy đến hàm lượng enzyme Hàm lƣợng enzyme (U/g) Mẫu tƣơi Mẫu khô Amylase (U/g) ± SE 1612,5 ± 8,0 1576,5 ± 7,2 Cellulase (U/g) ± SE 2125 ± 6,1 2003,67 ± 5,4 Protease (U/g) ± SE 794,5 ± 4,8 752,1 ± 6,9 Sau sấy khô, hoạt độ enzyme có giảm nhƣng khơng đáng kể chứng tỏ hoạt độ bị ảnh hƣởng nhiệt độ, nên cần bảo quản tốt sử dụng thời gian ngắn để tránh làm mát hoạt tính enzyme 45 3.2.3 Một số hình ảnh xác định hoạt độ enzyme phương pháp tạo vịng Halo mơi trường thạch với chất tương ứng sau ngày Hình 3.10 Vịng phân giải tinh bột Hình 3.11 Vịng phân giải CMC amylase thu MT HT nồng độ pha cellulase thu MT HT nồng độ pha loãng 500, 1000, 2000 lần lỗng 500, 1000, 2000 lần Hình 3.12 Vòng phân giải casein protease thu MT HT nồng độ pha loãng 500, 1000, 2000, 3000 lần 46 3.3 Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc Sau ngày nuôi cấy môi trƣờng xốp HT (45% cám gạo, 45% cám ngô, 10% KĐT) độ ẩm 40%, 20% giống có bổ sung FeSO4 0,2% tiến hành thu mẫu, pha loãng nồng độ khác nhau, hút 100 µl cho vào đĩa, theo phƣơng pháp cấy trải, đƣa vào buồng nuôi 37oC 24 Đếm số lƣợng khuẩn lạc tạo thành Bảng 3.5 Số lượng khuẩn lạc thu sau nuôi cấy nồng độ tương ứng Nồng độ pha lỗng Số lƣợng khuẩn lạc Trung bình ± SE 141 137 132 139,33 ± 1,25 56 51 64 58,00 ± 1,63 23 18 22 20,00 ± 1,63 11 9,67 ± 1,25 Mật độ tế bào 1g mẫu (CFU): 9,67 x10-9 ± 1,25 x10-9 Từ kết bảng 3.5 cho thấy mật độ tế bào có 1g mẫu thu đƣợc sau ngày ni cấy môi trƣờng HT (45% cám gạo, 45% cám ngô, 10% KĐT), độ ẩm 40%, giống 20% bổ sung 0,2% FeSO4.7H2O 9,67 x10-9 ± 1,25 x10-9 tế bào 47 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu đề tài rút đƣợc kết luận sau: - B licheniformis vi khuẩn Gram +, hình que ngắn đồng đều, bắt thành chuỗi với nhau, khuẩn lạc có rìa ngồi gợn sóng khơng đều, màu trắng đục tren môi trƣờng LB - Xác định đƣợc điều kiện thích hợp cho q trình sinh tổng hợp đa enzyme (amylase, protease, cellulase) chủng Bacillus licheniformis: Môi trƣờng xốp chất gồm 45% cám gạo + 45% cám ngô + 10% khô đậu tƣơng, độ ẩm 40%, 20% giống, bổ sung 0,2% FeSO4.7H2O thời gian nuôi 96 với hàm lƣợng enzyme thu đƣợc lần lƣợt (1612,5 ± 8,0; 2125 ± 6,1; 794,5 ± 4,8 U/g) 4.2 Kiến nghị Đề tài đƣa số kiến nghị sau: - Nghiên cứu tính chất xác định khối lƣợng phân tử đa enzyme thu đƣợc - Nghiên cứu ứng dụng đa enzyme số lĩnh vực 48 PHỤ LỤC - Kết dựng đƣờng chuẩn + Số liệu đo OD xây dựng đƣờng chuẩn glucose bƣớc sóng 540 nm Thứ tự Nồng độ glucose 1111,1 2222,2 3333,3 4444,4 5555,5 OD 0,219 0,312 0,378 0,419 0,458 0,571 + Số liệu đo OD xây dựng đƣờng chuẩn maltose bƣớc sóng 540 nm Thứ tự Nồng độ maltose OD 0 0,357 584,8 0,468 1169,59 0,696 1754,39 0,748 2339,18 0,804 2923,98 0,984 + Số liệu đo OD xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine bƣớc sóng 660 nm Thứ tự Nồng độ tyrosine OD 0 0,044 0,02 0,082 0,04 0,123 0,08 0,245 0,12 0,383 0,16 0,431 0,2 0,565 0,3 0,626 + Kết đo OD xác định ảnh hƣởng độ ẩm (%) giống (%) đến hàm lƣợng enzyme, Hoạt độ amylase (U/g ± SE) Độ ẩm (%) 20% 25% 30% 35% 40% + 514,3 ± 6,8 771,4 ± 7,5 874,3 ± 6,7 942,9 ± 12,4 925,7 ± 6,2 857,1 ± 6,2 925,7 ± 6,4 994,3 ± 13,8 1011,4 ± 7,4 1045,7 ± 8,5 1011,4 ± 7,6 1028,6 ± 7,1 1045,7± 10,2 1080 ± 14,4 1200 ± 11,1 Hoạt độ cellulose (U/g ± SE) Độ ẩm (%) 20% 25% 30% 35% 40% + Hàm lƣợng giống (%) 10% 15% 20% Hàm lƣợng giống (%) 10% 15% 20% 352,9 ± 2,4 405,9 ± 476,5 ± 9,4 529,4 ± 10,3 705,9 ± 11,8 617,6 ± 4,2 776,5 ± 9,2 564,7 ± 6,5 811,8 ± 11,4 600 ± 8,6 829,4 ± 6,5 758,8 ± 7,6 970,6 ± 6,3 1094,1 ± 13,5 1291,8 ± 12,7 Hoạt độ protease (U/g ± SE) Độ ẩm (%) Hàm lƣợng giống (%) 10% 15% 20% 25% 103,2 ± 3,4 157,8 ± 6,7 198,8 ± 5,5 231,9 ± 206,4 ± 4,2 278,3 ± 6,8 30% 201,6 ± 8,3 266,9 ± 3,9 305,4 ± 4,5 35% 243,1 ± 4,9 342,2 ± 6,5 456 ± 5,7 40% 321,6 ± 6,4 423,3 ± 8,2 552,5 ± 5,3 20% TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phạm Thị Trân Châu Phan Tuấn Nghĩa, Công nghệ sinh học tập 3, enzyme ứng dụng Nxb Giáo Dục, 2007 Nguyễn Hữu Chấn Enyme xúc tác sinh học, Nhà xuất Y học, 1983 Nguyễn Đức Lƣơng Công nghệ enzyme, Nhà xuất Đại học Quốc gia HCM, 2008 Ngô Xuân Mạnh, Nguyễn Thị Lâm Đồn, Võ Nhân Hậu, Ngơ Xn Dũng, Tạp chí khoa học phát triển: Tập VI, số 5: 460 – 466, 2008 Trần Định Toại, Nguyễn Thị Văn Hân Động lực trình xúc tác sinh học, Nhà xuất khoa học - kỹ thuật, 2005 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Barkalow, David G.; Whistler, Roy L "Cellulose" AccessScience, McGrawHill.2014 Fleming, Derek; Rumbaugh, Kendra P (2017) "Approaches to Dispersing Medical Biofilms" Microorganisms (2):15 doi:10.3390/microorganisms5020015 PMC 54 88086 PMID 28368320 Fleming, Derek; Chahin, Laura; Rumbaugh, Kendra (2017) "Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds" Antimicrobial Agents and Chemotherapy 61 (2): AAC.01998–16 doi:10.1128/AAC.01998-16 ISSN 1098- 6596 PMC 5278739 PMID 27872074 Kim JY, Hur SH, Hong JH Purification and characterization of an alkaline cellulase from a newly isolated alkalophilic Bacillus sp HSH-810 J Biotechnol Lett 2005; 27: 313–316 10 Lee BH, Kim BK, Lee YJ, Chung CH, Lee JW Industrial scale of optimization for the production of carboxymethylcellulase from rice bran by a marine bacterium, Bacillus subtilis subsp subtilis A-53 Enz Microb Tech 2010; 46:38–42 11 Pepe O., Blaiotta G., Moschetti G., Greco T., Villani F Rope-producing strains of Bacillus spp from wheat bread and strategy for their control by lactic acid bacteria Appl Environ Microbiol 2003; 69(4):2321-9 12 Pereira R., Martins J., Mateus C., Teixeira J A and Vicente A A Death Kinetics of Escherichia coli in Goat Milk and Bacillus licheniformis in cloudberry jam treated by Ohmic Heating 2006 13 Rey M.W., Ramaiya P., Nelson B.A., Brody-Karpin S.D., Zaretsky E.J., Tang M., Lopez de Leon A., Xiang H., Gusti V., Clausen I.G., Olsen P.B., Rasmussen M.D., Andersen J.T., Jorgensen P.L., Larsen T.S., Sorokin A., Bolotin A., Lapidus A., Galleron N., Ehrlich S.D., Berka R.M Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species Genome Biol 2004; 5(10):R77 Epub 2004 14 Salkinoja-Salonen S., Vuorio R., Andersson M.A., Kämpfer P., Andersson M.C., Honkanen-Buzalski T., and Scoging A.C Toxigenic Strains of Bacillus licheniformis Related to Food Poisoning.Appl Environ Microbiol 1999; 65(10): 4637–4645 15 Snoke J.E and Cornell N Protoplast Lysis and Inhibition of Growth of Bacillus licheniformis by Bacitracin J Bacteriol 1965; 89(2): 415–420 16 Veith, B., Herzberg, C., Steckel, S., Feesche, J., Maurer, K H., Ehrenreich, P., Bäumer, S., Henne, A., Liesegang, H., Merkl, R., Ehrenreich, A., Gottschalk, G (2004) The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential J Mol Microbiol Biotechnol 7(4):204211 17 Wecke T, Veith B, Ehrenreich A, Mascher T Cell envelope stress response in Bacillus licheniformis: integrating comparative genomics, transcriptional profiling, and regulon mining to decipher a complex regulatory network J Bacteriol 2006 Nov; 188(21):7500-11 Epub 2006 18 Worthington Biochemical Corporation (2014), Cellulase Accessed on 2014 TÀI LIỆU INTERNET 19 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genomeprj&cmd=Retrieve&dopt =Overview&list_uids=13082 20.https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_licheniformis 21 http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/ingredients/tech_docs/brad_006492.pdf 22 https://vi.wikipedia.org/ ... sinh tổng hợp đa enzyme (amylase, cellulase, protease) cao 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc tính sinh học vi khuẩn B licheniformi - Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố điều kiện nuôi cấy tới... tăng sinh sản xuất enzyme dễ kiếm, rẻ tiền (Nguyễn Đức Lƣơng, 2008) Do tơi thực đề tài ? ?Nghiên cứu số đặc tính sinh học tối ưu điều kiện ni cấy kích thích chủng Bacillus Licheniformis sinh tổng hợp. .. DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu xác định đƣợc số đặc tính sinh học chủng B licheniformis - Xác định đƣợc điều kiện ni cấy kích thích chủng B licheniformis sinh
Ngày đăng: 22/05/2021, 16:44
Xem thêm:
