Phần 2 của Cơ sở di truyền chọn giống thủy sản gồm có những nội dung chính sau: Di truyền qua tế bào chất và ảnh hưởng của dòng mẹ, biến dị và đột biến; di truyền học quần thể; giao phối cận thân và ưu thế lai; thuần hóa - di giống, bảo tồn nguồn gen của cá; kỹ thuật di truyền ứng dụng trong chọn giống cá. Mời các bạn cùng tham khảo.
Chương DI TRUYỀN QUA TẾ BÀO CHẤT VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA DÒNG MẸ Kể từ người ta xác định ADN nhiễm sắc thể nhân tế bào, thấy rõ vai trị ADN nhiễm sắc thể việc di truyền đặc điểm/tính trạng lồi, nịi, giống, qua hệ Thế hoạt động sống thể sinh vật lại diễn tế bào chất tế bào sinh tổng hợp protein, trao đổi chất, q trình sinh hố khác, Hơn người ta phát số dạng ADN có số nội bào quan tế bào chất tế bào, người ta gọi nhân tố hệ thống plasmagen Ty thể lạp thể bào quan có chứa vật chất di truyền (ADN), chúng có máy sinh tổng hợp protein riêng Có người ví von, xem vai trị ADN nhiễm sắc thể (hay nhân tế bào) phủ Trung ương điều hành hoạt động đất nước mà thành phần ADN tế bào chất thực giống vai trị quyền địa phương đất nước Trong phần xem xét vai trò tế bào chất di truyền Những đặc điểm di truyền tế bào chất Nhân tế bào chất tế bào thể thống tế bào sống Vật chất di truyền nằm nhân tế bào (>99%), nhiên thành phần tế bào chất có chứa vật liệu di truyền Vì cần rút đặc điểm di truyền tế bào chất để phân biệt tính di truyền ngồi nhân (trong tế bào chất) với tính di truyền nhân - Về bản, hợp tử thu nhận tế bào chất qua mẹ (tế bào trứng), phương pháp lai thuận nghịch cho phép ghi nhận ảnh hưởng di truyền tế bào chất Khi tiến hành lai thuận nghịch (dạng mẹ A bố B - lai thuận, dạng mẹ B với bố A - lai nghịch), sai khác kết biểu tính trạng lai cho phép nhận xét đánh giá ảnh hưởng dạng mẹ tới biểu tính trạng - Những tính trạng gen ty thể, lạp thể (và thể cộng sinh tế bào chất - vi khuẩn, virus) kiểm tra, di truyền theo hệ mẹ Chúng phân biệt với tính trạng nhân tố di truyền nhân kiểm soát nhờ phép lai thuận nghịch - Sự di truyền yếu tố di truyền tế bào chất khơng có quy luật rõ ràng yếu tố di truyền nhân kiểm sốt Vì q trình phân bào khơng có phân chia đồng thành phần bào quan tế bào chất cho giao tử trường hợp phân chia nhiễm sắc thể nhân tế bào Hình 6.1 Lá bị khảm Mirabilis jalapa - Trên sở đa bào xẩy trường hợp hình thành thể khảm theo biểu tính trạng gen tế bào chẩt kiểm tra Điều xẩy phân bố ngẫu nhiên 152 thành phần mang gen tế bào chất cho tế bào q trình phân bào, từ dẫn tới tượng bị khảm (hình 7.1) - Số lượng bào quan mang vật chất di truyền bào chất thường lớn biến động Khi xẩy đột biến bào quan bình thường loại, đột biến tế bào chất bị cách nhanh chóng - Nhiều chứng cho thấy, yếu tố di truyền tế bào chất có mối quan hệ mật thiết với yếu tố di truyền nhân tế bào Sử dụng phương pháp thay nhân thực nghiệm làm sáng tỏ ảnh hưởng tương đối nhân bào chất biểu kiểu hình tính trạng Sự di truyền lạp thể Nhiều dạng thực vật có dạng sọc, chúng xanh có xen kẻ vệt sọc trắng vàng Đó vùng mơ khơng chứa chứa lạp thể, hay lạp thể bị hỏng khơng có chlorophil Correns (1908) nhiều tác giả khác nghiên cứu di truyền đốm đặc biệt hoa phấn Mirabilis jalapa hoa mõm chó Antirrium majus Trên Mirabilis jalapa có chấm xanh nhạt hay chấm trắng, chí có cành có hồn tồn xanh có cành hồn thành sắc tố (màu trắng) Màu trắng (lá bạch tạng) lục lạp bị đột biến nên khả tạo thành diệp lục tố mà khơng thể có màu xanh tiếp xúc với ánh sáng Khi sinh sản hữu tính, hoa xuất từ cành có màu xanh cho hạt mà sau đem gieo mọc có xanh, hoa xuất từ cành có màu trắng cho hạt mà sau đem giao mọc có trắng có màu trắng nhanh chóng bị chết khơng quang hợp nên khơng có dinh dưỡng ni Hoa xuất từ cành có đốm cho hạt mà sau đem gieo mọc có đốm (xanh trắng xen kẽ) Khi có hoa ta tiến hành thụ phấn nhân tạo (tiến hành lai thuận nghịch), trường hợp hoa dạng bạch tạng làm mẹ thụ phấn hoa dạng bình thường hệ F1 xuất tồn dạng bạch tạng (sau thời gian chúng bị chết, chúng khơng có khả quang hợp) Khi tiến hành lai ngược lại, hoa dạng xanh làm mẹ thụ phấn dạng bạch tạng, thu toàn F1 thuộc dạng xanh bình thường Như màu sắc đời sau quy định dòng mẹ Trường hợp hoa dạng sọc làm mẹ thụ phấn dạng xanh, F1 hình thành dạng khác nhau: Xanh, sọc, bạch tạng Khi tiến hành lai ngược lại, thu toàn F1 thuộc dạng xanh Những kết trình bày ví dụ điển hình di truyền theo hệ mẹ, quan sát thấy sai khác tương phản rõ rệt kết lai thuận nghịch Ở thực vật bậc cao, tế bào chứa hàng chục lạp thể, chúng có dạng hình trứng hình đĩa, sinh sản cách phân chia Trong bóng tối lạp thể khơng có màu, khó phân biệt với bạch lạp vài lạp khác Khi ánh sáng lạp thể có màu xanh gọi lúc lạp Lạp thể bị đột biến khả tạo thành lục tố, khả trì ổn định hệ sau có phân chia nhiều lần lạp thể bị đột biến Do vậy, dù đột biến xẩy lạp thể làm xuất nhiều tế bào chứa hỗn hợp lục lạp bình thường lục lạp bị đột biến với tổ hợp khác "xanh" "trắng" phân chia độc lập lạp thể theo phương thức phân bào nguyên nhiễm Trong trình phân chia tế bào lạp thể phân bố vào tế bào cách thụ động 153 nên tỷ lệ xanh trắng tế bào vào tế bào thường xuyên thay đổi Kết cho tế bào gồm lạp thể trắng có lạp thể xanh, làm xuất vùng hoàn toàn trắng, hoàn toàn xanh đốm trắng xanh lẫn lộn ADN lạp thể Lạp thể có nhiều dạng khác (lục lạp, sắc lạp, bột lạp) Trong thể số loài, genom lạp thể giống Vì nghiên cứu genom lạp thể tập trung vào cấu trúc ADN lục lạp - dạng quan trọng nhóm lạp thể ADN lạp thể có dạng vịng gần giống với ADN vi khuẩn Ở thực vật bậc cao cp-ADN có kích thước từ 120-160Kb Ở tảo phạm vi biến động cp-ADN rộng hơn: từ 85-292Kb (1 Kb = 1.000 đơi nucleotit) Đặc biệt lồi tảo thuộc chi Acetabularia có cp-ADN lớn, khoảng 20.000Kb (song chưa rõ ADN có cấu trúc dạng thẳng hay dạng vịng) Các phân tích cp-ADN cho thấy, lục tạp thường chứa nhiều cp-ADN Trong lục tạp thực vật bậc cao thường có khoảng 30-60 cp-ADN Ở tảo, số sảo lục tạp tăng bào lông roi Eugbena gracilic chứa khoảng 15 lục tạp, lục tạp có khoảng 40 cp-ADN (1 cp-ADN dài 126Kb), tổng số thể có tới 6.000 Nhóm gen liên kết lục lạp thể giống nhau, gen cpADN xếp vào nhóm Những gen mã hoá thành phần máy sinh tổng hợp protein lục lạp: Các tiểu phần ARN-polymerase, ARN-riboxom (các riboxom lục lạp có cấu tạo tương tự roboxom sinh vật nhân sơ), tARN Như vậy, lục lạp có khả tự tổng hợp protein riêng cho Những gen quy định nhiều thành phần máy quang hợp: Các hệ quang hợp I H, chuỗi vận chuyển điện tử cp-ADN kiểm tra số q trình tạo màng lục lạp Ngồi lục lạp cịn có số gen chống chịu, Genom lục lạp thực vật bậc cao thường có kích thước 1/30 đến 1/20 genom lục lạp sinh vật nhân sơ (tảo lam) Như vậy, lục lạp thực vật bậc cao bị nhiều thông tin di truyền so với tổ tiên chúng trở nên phụ thuộc lớn vào gen nhân tế bào nhiều thành phần quan trọng Nhiều sản phẩm gen nhân kiểm tra vào lục lạp nhờ peptit transit Một số sản phẩm cấu tạo từ tiểu phần, chúng kiểm tra gen nhân lục lạp, VD enzy, RDP carboxilase, cấu tạo tiểu phần, tiểu phần gen nhân kiểm tra, tiểu phần lại gen lục lạp kiểm tra cp-ADN mã hoá cho nhiều hợp phần quan trọng hệ quang hợp I, H chuỗi vận chuyển điện tử Vì hiểu biết cấu trúc, chức cp-ADN quan trọng, cp-ADN khó tách để nghiên cứu so với ADN ty thể cp-ADN Marchantia polymonpha Nicotiana tabacum nghiên cứu kỹ, chúng có chiều dài tương ứng 121.024 155.884 đôi nucleotit với số lượng gen tương ứng 136 (ở M polymonpha) 150 (ở N tabacum) Theo gen đơn tổ chức genom lục lạp loài thực vật này, quan sát thấy giống đáng kể, chúng xa mức độ tiến hoá Những sai khác chủ yếu chúng tìm thấy vùng chứa gen trựng lặp rARN Nhiều nghiên cứu sử dụng enzym giới hạn cẳt cp-ADN với mục đích phân tích đa dạng di truyền lục lạp Kết cho thấy, lục lạp cá thể loài đồng di truyền VD: Panicum maximum cp-ADN thịt bao phấn 154 giống nhau, lục lạp khỏc hình dạng Như vậy, trình phân chia, lạp thể có xu ổn định tổ chức gen cp-ADN, hạn chế xẩy tái tổ hợp Các kết nghiên cứu chứng minh rằng, lạp thể đột biến biến đổi cấu trúc ADN lạp thể ADN lạp thể giống với ADN nhân thành phần cấu tạo, độc lập với ADN nhân khả phân ly khả tái sinh Tảo lục đơn bào Chlamydomonas Đây đối tượng thuận lợi cho việc nghiên cứu quy luật di truyền lạp thể Ở tảo Chlamydomonas reinhardtii tế bào chứa lục lạp Các tế bào tảo thường nhân lên theo sinh sản vơ tính (phân chia ngun nhiễm) Tuy nhiên, sinh sản hữu tính xẩy cách phối hợp hai tế bào phân biệt theo yếu tố "giới tính", yếu tố gen mt nhiễm sắc thể kiểm tra Dạng mt+ phối hợp với dạng mt hình thành hợp tử Sau giai đoạn chín, hợp tử tiến hành phân chia giảm nhiễm, kết hình thành tế bào đơn bội theo bốn hay tám tế bào, bào tử nang, chúng phát triển thành bào tử đơn bào Sager (1975) phát số gen khơng có chất kháng sinh số gen đột biến ADN lục lạp Chlamydomonas Để tiến hành phân tích di truyền lục lạp, người ta tiến hành phân lập dịng Chlamydomonas có yếu tố di truyền kiểm tra phối hợp sinh sản hữu tính (mt+, mt) Khi xẩy kiểu giao phối mt+ mẹ kháng streptomycin (sr), tất đời thể tính kháng Trường hợp ngược lại mt+ mẹ mẫn cảm với streptomycin (ss), thu đời mẫn cảm Như vậy, xẩy di truyền theo hệ mẹ, tính kháng streptomycin gen lục lạp kiểm tra Sở dĩ thu kết dạng mt+ giữ lại Tuy nhiên xẩy trường hợp ngoại lệ khoảng 1% hợp tử thu dạng lục lạp bố mẹ Bào chất chứa dạng ADN lục lạp gọi bào chất dị hợp Tần số thu dị hợp lên tới 50% sử dụng tia cực tím chiếu vào bào mang gen mt+ vào thời điểm trước xẩy phối hợp tế bào mt+ Bào chất dị hợp sử dụng phân tích di truyền gen lạp thể Bên cạnh đó, phát gen đột biến ac2 - kìm hãm trình quang hợp, dạng đột biến phát triển môi trường ni cấy có bổ sung axetat (gen ac1 - bình thường) Người ta sử dụng cặp gen ngồi nhiễm sắc thể lai phân tích nhằm phát cá thể tái tổ hợp Cho giao phối hai bố mẹ ac1ss x ac2sr, đời sử dụng thị (marker/indicator) để nhằm phân biệt kiểu phân ly gen lục lạp với kiểu phân ly gen nhiễm sắc thể Kết theo dõi cho thấy, hai cặp gen ac1/ac2 sr/ss phân ly, dẫn tới xuất dạng bố mẹ ac1ss, ac1rs dạng tái tổ hợp ac1cr, ac2ss Kết nhiều phân tích khác cho phép Sager (1975) thiết lập đồ nhóm gen liên kết dạng vịng lục lạp Chlamydomonas reinhardti Sự di truyền ty thể ADN ty thể Ty thể trung tâm cung cấp lượng cho hoạt động sống tế bào thông qua trình photphoril hố - oxy hố, vận chuyển điện tử, q trình oxy hố axit citric axit béo Phân tử ADN ty thể có dạng vịng (các ADN ty thể ký hiệu mt.ADN), có thành phần cấu tạo giống ADN nhân độc lập với ADN nhân phân chia tái sinh So với ADN lạp thể mt.ADN dễ dàng tách để nghiên cứu đặc điểm cấu trúc Ở sinh vật khác nhau, mt.ADN có kích thước biến 155 động lớn, từ 16Kb động vật trăm Kb thực vật bậc cao (VD ngơ mt.ADN có độ lớn 570Kb) Trong ty thể thường chứa nhiều mt.ADN VD Dịng tế bào ni cấy Hela người, tế bào có khoảng 800 ty thể, ty thể chứa tới 10 mt.ADN Số lượng ty thể khác tế bào thể, đặc biệt số lượng ty thể tăng mạnh tế bào trứng (để đảm bảo lượng cho trình phát triển hợp tử) tế bào hạt phấn (để đảm bảo cho nảy mầm phát triển ống phấn) VD tế bào trứng động vật có vú có số lượng ty thể lớn, mt.ADN chiếm tới 1/3 tổng lượng ADN tế bào Nấm men bánh mỳ saccharomycess cervisea đối tượng nghiên cứu kỹ ADN ty thể Cấu trúc mt.ADN động vật bậc cao thường biến động, cấu trúc mt.ADN thực vật bậc cao sinh vật bậc thấp nhân chuẩn đa dạng Ở người, chuột, động có sừng (trâu, bị) mt.ADN có độ dài tương ứng 16.569, 16275 16.336 đôi nucleotit, chúng vòng nhỏ Điều đáng lưu ý tổ chức gen loại mt.ADN nêu trên, giống nhau, mt.ADN chứa gen rARN, 22 gen tARN khoảng 13 gen mã hố protein Nấm men bành mỳ Saccharomycess cervisea có mt.ADN dài khoảng 84Kb, gần lần mt.ADN động vật có vú Tuy nhiên, tổ chức gen mt.ADN nấm men thể tương tự mt.ADN động vật có vú Độ dài mt.ADN nấm men tăng có mặt nhiều đoạn intron lớn VD Đoạn ADN chứa gen mã hoá cho cytochrom b tiểu phần cytocchrom ozydase có độ dài gần mt.ADN nguyên vẹn động vật có vú, vùng chứa đoạn intron dài Hơn nữa, mt.ADN nấm men tổ chức tARN phân tách nhiều đoạn gen, 16 gen tARN tổ chức thành cụm, 10 gen khác phân tán khắp genom Ngồi ra, số lượng gen mã hố protein mt.ADN nấm mem lớn so với mt.ADN động vật có vú, nhiên vấn đề chưa xác định rõ ADN ty thể tái độc lập, ty thể tái độc lập với chu kỳ phân bào, ADN ty thể mã hố cho số nhóm gen sau: Các thành phần may sinh tổng hợp protein ty thể có riboxom đặc trưng, t.ARN, enzym aminoxil-t ARN-synthetase Những gen mã hoá cho số sản phẩm khác, số cấu trúc mang ty thể (một phần nhỏ) tham gia vào chuỗi hô hấp số gen khác ARN polymerse ty thể thực mã (VD mt.ADN động vật có vú kích thước nhỏ) theo phương thức từ điểm khởi đầu ARN mã thành đơn vị liên tục, sau enzym endpnuclease phân cắt để hình thành nên phân tử tARN, rARN mARN (mã hoá protein) Như vậy, mt.ADN nguyên vẹn tương đương operon vi khuẩn Cấu trúc riboxom ty thể khác với riboxom tế bào chất, nhiên sinh vật khác cấu trúc riboxom ty thể biến động mạnh: Tiểu phần lớn riboxom có số lắng đọng 40S-60S (ở vi khuẩn lạp thể 50S, tế bào nhân chuẩn 60S), tiểu phần nhỏ có số lắng đọng 30S - 55S (vi khuẩn lạp thể 30S, tế bào chất tế bào nhân chuẩn 40S) Ty thể bào quan thực chức quan trọng phức tạp, chứa lượng lớn protein mt.ADN mã hoá cho lượng nhỏ protein (VD 13 loại mt.ADN động vật có vú) Vì thế, số lượng lớn protein ty thể gen nhân kiểm tra Các protein nhập vào ty thể để thực chức nhờ peptittranzit Một số protein có cấu trúc từ tiểu phần gen nhân ty thể kiểm tra VD enzym malatdhydrogenase cấu tạo từ tiểu phần, tiểu phần 156 gen nhân kiểm tra tiểu phần gen ty thể kiểm tra Cytochrom oxydase có tranh tương tự Đột biến khuẩn lạc nhỏ nấm mem bánh mỳ Nấm mem bánh mỳ Saccharomycess cervisea thể đơn bào, song chúng sống thành cụm tế bào gọi khuẩn lạc Các tế bào nấm men thuộc trạng thái đơn bội, chúng nhân lên theo phương thức "mọc chồi" từ tế bào mẹ tạo nên dịng vơ tính Tuy nhiên, đời sống mỡnh nấm men cịn xẩy sinh sản hữu tính cách phối hợp dạng tế bào khác tế bào đơn bội dung hợp thu tế bào lưỡng bội, tế bào tiếp tục nhân lên qua nguyên phân (giai đoạn nấm men sống pha lưỡng bội) tế bào lưỡng bội tiến hành phân chia giảm nhiễm, kết thu tứ tế bào Các bào tử đơn bội phát triển thành dịng đơn tính Hình 6.2 Phân tích bốn khả hơ hấp thể lai bào đơn bội kiểu (Pet+) với đột biến Pet có nguồn gốc nhân (A) với kiểu đột biến Pet nguồn gốc tế bào chất (B) Nghiên cứu Ephrussi cho thấy quần thể S cervisea sản sinh 1% khuẩn lạc lồi hình bộ, dạng mơi trường ni cấy có đường glucose tạo khuẩn lạc có kích thước nhỏ Đột biến khuẩn lạc nhỏ ký hiệu Pet (pet+ kiểu hoang dại, khuẩn lạc phát triển kích thước lớn bình thường) Phân tích cho thấy, dạng đột biến khuẩn lạc nhỏ bị thiếu hụt enzim hơ hấp cytochrom oxydase, điều chứng minh thay đổi ty thể Cũng có cá thể lai lưỡng bội loại đơn bội bình thường với đại diện khuẩn lạc bé nhỏ Về mặt enzim hô hấp thấy cá thể lưỡng bội bình thường hình thành bào tử đời đơn bội bình thường, quan sát kính hiển vi điện tử người ta thấy loại đơn bội bên cạnh ty thể bình thường cịn có ty thể hư hại đặc biệt Do cố chức hô hấp nên tế bào thiếu hụt nghiêm trọng lượng, chúng sinh sản có kích thước nhỏ dẫn tới hình thành khuẩn lạc nhỏ Tác nhân gây đột biến nhân tạo làm xuất khuẩn lạc bé nấm men, loại di truyền lại cho đời sau qua sinh sản vơ tính 157 Cho giao phối tế bào đơn bội Pet+ x Pet-, thu kiểu dại, hơ hấp bình thường Các kết phân tích di truyền bốn cho thấy, đột biến Pet- có đặc điểm di truyền khác (hình 7.2) Một số thể lai cho phân ly bình thường (2 Pet+ : Pet-), trường hợp thứ cho phân ly Pet+ : Pet- Rõ ràng trường hợp - đột biến khuẩn lạc nhỏ xẩy nhiễm sắc thể nhân tế bào, trường hợp trường hợp - xẩy bào chất, có khả liên quan tới ty thể Đột biến khuẩn lạc nhỏ có nguồn gốc tế bào chất phân lập khơng khó khăn, đột biến xuất tự nhiên với tần suất khoảng 1% Một số tác động nhiệt độ cao, acriphlavin, etidi bromit làm tăng xuất đột biến Trong trình cấy chuyền nhiều lần dạng khuẩn lạc nhỏ Pet- có nguồn gốc bào chất khơng quan sát thấy đột biến ngược xẩy (không thu dạng bình thường) Trong đó, dạng Pet- có nguồn gốc nhân thu dạng đột biến ngược Các phân tích ty thể dạng Pet- nguồn gốc bào chất cho thấy, mt.ADN có xẩy đoạn với độ dài khác làm cho ty thể khả thực chức năng lượng tế bào Trong tế bào dạng nấm men khuẩn lạc nhỏ có mt.ADN bị hỏng, mt.ADN tiếp tục tái ty thể khơng bình thường Điều chứng tỏ protein cần cho tái mt.ADN, không ghi mã mt.ADN Tế bào nấm men đối tượng thuận lợi cho nghiên cứu di truyền ty thể Ở mt.ADN phát nhiều gen thị khác, gen kháng chất nguyên sinh như: Cloramphenicol, erytromucin, (các kháng sinh ức chế tổng hợp protein vi khuẩn), gen kháng oligomixi (chất gây ức chế hô hấp) Trong số trường hợp, ty thể có nguồn gốc khác (được thu thập vào bào chất hợp tử) dung hợp với Hệ mạch mt.ADN dạng ty thể xẩy trao đổi vật chất di truyền cho nhau, dẫn tới đa dạng tổ hợp gen ty thể Điều cần lưu ý trao đổi vật chất di truyền mt.ADN xẩy khơng nhau, tính chất gọi tính hướng cực tái tổ hợp di truyền Sự di truyền qua tế bào chất tác nhân kiểu virus Theo Leritie, ruồi dấm có dịng nhạy cảm với CO2, ruồi bình thường sống CO2 tinh khiết hàng giờ, song ruồi mẫn cảm chết bị bại liệt sau tiếp xúc với CO2 vài giây Khi cho tạp giao ruồi dấm bình thường với ruồi dấm mẫn cảm, đặc tính mẫn cảm đời phụ thuộc vào tế bào chất dịng gốc Vì cho tạp giao ruồi đực mẫn cảm với ruồi bình thường, hệ sinh có bị mẫn cảm Nếu tất nhiễm sắc thể có ruồi dịng mẫn cảm thay nhiễm sắc thể dịng bình thường, cá thể khơng tính mẫn cảm Điều cho thấy yếu tố gây nên tính mẫn cảm thay nhiễm sắc thể dịng bình thường, cá thể khơng tính mẫn cảm Như yếu tố gây nên tính mẫn cảm liên quan đến thành phần nằm tế bào chất, người ta gọi yếu tố xích ma (δ) Yếu tố δ truyền cho đời chủ yếu qua tế bào chất tế bào trứng Tuy nhiên tách từ tế bào Khi ghép buồng trứng ruồi bình thường vào ruồi nhạy cảm cao, tế bào trứng ruồi bình thường bị nhiễm yếu tố δ truyền lại cho đời sau Người ta chứng minh yếu tố δ plasmagen có khả thích nghi với kiểu gen tế bào 158 Hiện tượng tiền định tế bào chất Ốc Linea pregra có vỏ xoắn phải gen trội D điều khiển, xoắn trái gen lặn d điều khiển Khi tiến hành tạp giao dịng ốc có hướng xoắn khác nhau: bố xoắn trái mẹ xoắn trái x bố xoắn phải P mẹ xoắn phải x dd dd DD DD ↓ ↓ F1 100% xoắn phải 100% xoắn phải Dd Dd F2 100% xoắn phải 100% xoắn phải DD: 2Dd : dd DD: 2Dd : dd ↓ ↓ xoắn phải : xoắn trái xoắn phải : xoắn trái F3 Trong phép lai có trường hợp đặc biệt: - Khi cho lai ốc xoắn trái với ốc đực xoắn phải hệ F1 thu 100% ốc xoắn trái, không tuân theo kiểu gen Dd - Cả kiểu lai hệ F2 thu 100% ốc xoắn phải, không tuân theo kiểu gen dd - Đến hệ F3 phân ly kiểu hình kiểu gen phù hợp với quy luật di truyền Mendel (1 : : : 1) Hình 6.3 Sự di truyền tính trạng xoắn phải xoắn trái ốc Người ta giải thích rằng, trường hợp kiểu gen Dd F1 cho kiểu hình xoắn trái kiểu gen dd F2 cho xoắn phải chúng chịu tác động yếu tố tế bào chất dịng mẹ Con mẹ dd trứng d, con dự Dd bị ảnh hưởng "vai trò" d tế bào trứng nên có kiểu hình xoắn trái Trong trường hợp F1 có kiểu gen Dd sinh 100% ốc F2 xoắn phải ảnh hưởng yếu tố "D" mẹ có sẵn tế bào chất tế bào trứng, nên kiểu gen dd xoắn phải Ảnh hưởng dòng mẹ Các đặc tính hoạt động tế bào chất gen trực tiếp kiểm soát, ảnh hưởng gen tế bào chất thường bền vững, muốn có tác động gen để hình thành đặc tính hay hoạt động cần phải có thời gian Với điều kiện vậy, để tạo thay đổi ảnh hưởng gen phải làm thay đổi đặc tính tế bào chất phải trải qua vài hệ tế bào xuất cảnh tượng 159 đặc biệt di truyền tế bào chất đặc tính đảo ngược tạm thời tế bào chất Đời (giao tử hợp tử) ln nhận tồn tế bào chất tế bào từ mẹ nên tất nhiên chúng có nhiều đặc điểm giống mẹ, gọi ảnh hưởng theo dòng mẹ Hiện tượng phổ biến “mẫu khuynh” (matroclimic) số trường hợp tạp giao cho hệ F1 đặc điểm giống mẹ Mauux khuynh biểu rõ tạp giao cá loài khác loài Cơ sở mẫu khuynh nhận biết qua tượng: ♦ Sự có mặt tế bào chất cấu trúc có chứa ADN (trước hết ty thể) điều khiển tổng hợp số protein đặc biệt Sự di truyền gen nhân diễn theo đường mẹ, qua tế bào chất trứng di truyền vững theo mẹ ♦ Sự tích lũy tế bào chất nỗn hồng trứng chín lượng lớn sản phẩm từ hoạt động NST mẹ (mARN, protein) Điều dẫn đến ưu phát triển đặc điểm mẹ giai đoạn đầu (phơi) Cần nói thêm rằng, nhiều gen từ bố cá bắt đầu hoạt động tổng hợp protein từ giai đoạn phơi nang, chí muộn Ảnh hưởng mẹ phát tạp giao cá chép nhà với cá chép dai Amua, chép Rôpsa với cá chép Ucrain, cá chép với cá diếc ♦ Thụ tinh tinh trùng bình thường với tế bào trứng không giảm phân (lưỡng bội) thu phôi tam bôi với 2/3 NST mẹ 1/3 bố Các thể tam bội với ưu tính trạng mẹ lặp lai tạp giao xa số loài cá Trong đa số trường hợp di truyền “theo mẹ” cá thực chất tác động từ kiểu gen mẹ Hiện tượng di truyền số tính trạng giống mẹ thường giới hạn hệ đời thứ cac hệ sau Các tượng di truyền ngồi nhân anh hưởng dòng mẹ phát động thực vật, có động vật thủy sản TĨM TẮT CHƯƠNG Chương cung cấp cho người học kiến thức yếu tố vật chất di truyền nhân (trong tế bào chất): Cấu trúc ADN đặc trưng ADN nhân Người học biết yếu tố di truyền nằm quan tử (ty thể, lạp thể) di truyền theo quy luật Lai thuận nghịch cách để giúp cho ta phát tính trạng điều khiển yếu tố di truyền nhân hay nhân, đồng thời lai thận nghịch giúp xác định vai trò dòng mẹ lai tạo Ngồi động vật tiền định yếu tố di truyền, di truyền tác nhân kiểu virus, giúp hiểu thêm trường hợp ảnh hưởng dòng mẹ thể tính trạng CÂU HỎI Vì lại phải quan tâm nghiên cứu di truyền yếu tố nhân (trong tế bào chất) Các yếu tố di truyền tế bào chất có đặc trưng gì? Hãy trình bày đặc trưng di truyền yếu tố di truyền nằm lạp thể Hãy trình bày đặc trưng di truyền yếu tố di truyền nằm ty thể Thế di truyền qua tế bào chất tác nhân kiểu virus? Thế tượng tiền định tế bào chất? Dịng mẹ có vai trị di truyền tính trạng đời sống sinh vật nói chung? Hãy cho biết ứng dụng ảnh hưởng dòng mẹ chọn giống lai tạo giống Để nghiên cứu di truyền yếu tố di truyền tế bào chất vai trò dòng mẹ, phải sử dụng phương pháp nghiên cứu gì? 160 Chương BIẾN DỊ VÀ ĐỘT BIẾN Biến dị sinh vật ba yếu tố tiến hoá sinh vật thường tính phức tạp Biến dị sở để chọn lọc sinh vật có khả thích ứng với điều kiện sống Người ta cho rằng, biến dị ruột trình phản ánh mối liên hệ sinh vật ngoại cảnh Trên quan điểm di truyền biến dị kết phản ứng kiểu gen điều kiện mơi trường bên ngồi q trình phát triển cá thể Mối liên hệ thể với ngoại cảnh thể qua sơ đồ sau: Quá trình phát triển cá thể Kiểu gen ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯→ Kiểu hình ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ Các yếu tố ngoại cảnh Khái niệm phân loại biến dị Biến dị biến đổi mà thể sinh vật thu tác động tố ngoại cảnh trình tái tổ hợp di truyền Darwin người phân chia biến dị làm nhóm: (l) Biến dị khơng di truyền - thường biến (biến dị không xác định) (2) biến dị di truyền - đột biến (biến dị xác định) Những biến dị không di truyền ngày gọi thường biến, chúng biến đổi đặc điểm, tính trạng sinh vật phát sinh trình phát triển thể ảnh hưởng yếu tố ngoại cảnh bên ngồi, khơng di truyền lại cho hệ sau sinh sản hữu tính Biến dị di truyền tất biến đổi đặc điểm, tính trạng sinh vật, khơng bị q trình sinh sản hữu tính di truyền từ đời qua đời khác Như vật đặc điểm, tính trạng sinh vật bị biến đổi đặc điểm, tính trạng cũ đi, đặc điểm, tính trạng xuất Các biến đổi cho dù mức độ nào, dù có di truyền hay không di truyền chúng nguyên nhân tạo đa dạng, phong phú sinh vật Tính đa dạng phong phú sinh vật hình thành tính di truyền lại làm cho sinh vật giống (bảo thủ) từ hệ qua hệ khác Những nguyên nhân rào làm cho sinh vật xây biến dị, chế để tạo dạng biến dị nào, làng để tạo biến dị có lợi ngăn ngừa biến dị có hại, người sử dụng dạng biến dị phục vụ cho kinh tế, xã hội nào? Đây nội dung nghiên cứu di truyền học biến dị sinh vật Phân loại biến dị Biến dị nói chung biến đổi đa dạng sinh vật, chúng phân theo nhóm sau đây: Biến dị khơng di truyền: Đó biến dị liên quan đến kiểu hình, khơng liên quan đến vật chất di truyền Những biến đổi gọi thường biến Biến dị di truyền: Đó biến đổi có liên quan đến vật chất di truyền thể Trong phân nhóm: (a) biến dị đột biến - biến đổi có tính chất hố học vật liệu di truyền (b) biến di tái tổ hợp - tổ hợp xếp gen mà đời thu khác với bố mẹ phân ly độc lập trao đổi chéo gen 161 qua chép ngược Bên cạnh đó, gen ngắn, đơn giản thu nhận phương pháp tổng hợp hoá học Hai phương pháp đầu có sơ đồ khái qt hình 11.1 Tách đoạn ADN từ genom Đây phương pháp sử dụng rộng rãi kỹ thuật ADN Ở genom sinh vật bậc cao ADN có khối lượng lớn (ví dụ động vật có vú, ADN genom chứa khoảng 3.109 đôi nucleotit) Mỗi phân tử ADN genom cắt làm nhiều mảnh nhờ enzym giới hạn Một phân tử ADN điển hình chứa khoảng 3.106 đôi nucleotit cắt từ hàng trăm tới hàng nghìn mảnh nhỏ Tồn ADN nhân động vật có vú cắt thành hàng triệu mảnh Hai phương pháp thu nhận gen trình bày sơ đồ hình 11.4 Những đoạn cắt ADN phân tách phát phương pháp điện di gen gels Những đoạn ADN mạch đơn có đánh dấu phóng xạ Những đoạn ADN phân lập cách sử dụng kỹ thuật tạo khối lai phân tử Kỹ thuật khái quát sau: - Sử dụng màng lọc nitroxenlulose, nạp đoạn ADN mạch đơn có đánh dấu phóng xạ, đoạn phân bố màng lọc vệt băng Những mẫu ADN thử (probe) đoạn ADN biết trước kích thước cấu trúc chúng - Các đoạn ADN gen gels tách đơn kiềm, sau chúng thấm trượt sang màng lọc cho gels màng lọc áp sát Ở màng lọc, ADN ảo tương đồng với đoạn thử, chúng tạo khối lai phân tử Sau đó, màng lọc rửa Như vậy, nhờ tạo khối lai phân tử người ta tách đoạn ADN cụ thể hỗn hợp nhiều đoạn cắt Mô bào ↓ ↓ ⎯⎯⎯⎯ Chiết xuất ⎯⎯⎯ mARN ↓ Sao chép ngược ↓ c-ADN ADN genom ↓ Cắt hay nhiều loại enzym giới hạn ↓ Phân tách đoạn ADN Tạo ADN có khả gắn với plasmid vector⎯⎯→Tách nhân dịng ADN Hình 11.4 Sơ đồ phương pháp thu nhận gen Phương pháp thấm (trượt) sang màng lọc nitroxenlulose, nạp mạch đơn ADN thử (mạch đơn) lần Southern E.M đề xuất vào năm 1975 đặt tên Southern blots (thấm tích Nam) Cũng theo nguyên lý này, màng nạp đoạn thử ARN, nhà nghiên cứu đặt tên cho lối "chơi chữ" Nothern blots (thấm tích Bắc) màng có nạp protein - Western blots (thấm tích Tây) 281 Các đoạn ADN phân cắt tách dòng- nạp vào plasmid để nhân lên Tập hợp đoạn ADN (đã tách dòng) gen genom loài sinh vật gọi ngân hàng ADN genom hay thư viện ADN genom loài Thu nhận gen từ mARN gen tương ứng Phương pháp thu nhận ADN từ mạch đơn ADN thực nhờ sử dụng enzym chép ngược Enzym có tên gọi đầy đủ ARN-denpendent ADN-polymerase hay reverse transcriptase - gọi ngắn gọn reverse (sao chép ngược) Lần enzym phát nghiên cứu chép ADN retrovirus Về chiết tách mARN gen riêng biệt không phức tạp phân tách đoạn ADN từ gen genom Nhờ enzym chép ngược, gen tổng hợp có mARN gen Ở sinh vật bậc cao, mARN tách từ hỗn hợp loại ARN nhờ cấu trúc chuỗi poly-A có đầu 3' Người ta nạp đoạn poly-dT vào cột cellulose hay agarose Khi qua, mARN giữ lại nhờ liên kết chuỗi poly-A với poly-dT Sau rửa đoạn mARN tách Quá trình chép ngược bao gồm hai giai đoạn (hình 11.4) đoạn mồi sử dụng đoạn olygo-dT, kết cặp với poly-A, từ xẩy tổng hợp mạch ADN đơn bổ sung theo sợi mARN khuôn (complementary ADN đơn - c-ADN đơn) xúc tác enzym chép ngược Tiếp theo mạch tách tiếp tục tổng hợp thành c- ADN mạch kép (c-ADN) nhờ enzym ADN-polymerase Các c-ADN thu nhân dòng cách gắn chúng vào vector (plasmid) Tập hợp c-ADN thu từ tất loại mARN tế bào chun hố lồi sinh vật gọi ngân hàng c-ADN hay thư viện c-ADN lồi Cần lưu ý rằng, sinh vật nhân chuẩn, gen có cấu trúc khơng liên tục, có vùng exon, intron xen kẽ Ở mARN thành thục, đoạn intron bị cắt bỏ, có đoạn exon nối lại với nhau, c-ADN gen khơng có intron Các đoạn ngân hàng ADN genom đoạn ngẫu nhiên tất ADN genom loài sinh vật, chúng không phụ thuộc vào loại tế bào dùng để lấy ADN Ngược lại, tế bào thuộc mơ chun hố khác thể bậc cao có loại mARN khác (do hoạt động gen khơng giống mơ chun hố) Vì thế, ngân hàng c-ADN thu phụ thuộc vào tế bào sử dụng Do tính chun hố này, nên việc xác định gen mong muốn từ ngân hàng gen dựa vào c-ADN dễ dàng nhiều Bằng đường này, người ta thu nhận nhiều gen giá trị người, động vật bậc cao, gen globin, ovalbumin, fibroin, protein, thủy tinh thể mắt bò, interferon, Hiện nay, số lượng mẫu ngân hàng ADN genom ngân hàng c-ADN thu ngày tăng Ví dụ, năm 1992 Mỹ tạo dịng c-ADN 2.375 gen não người Tổng hợp gen phương pháp hoá học Bên cạnh hai phương pháp thu nhận gen nêu trên, người ta tổng hợp gen phương pháp hố học Gen tổng hợp nhân tạo gen mARN alamin nhóm nghiên cứu Khorana thu năm 1969 Gen gồm 77 cặp bazơ khơng có vùng điều hòa Để tổng hợp nhân tạo gen, cần phải biết trình tự nucleotit nó, từ người ta thiết kế hệ thống tổng hợp ADN ống nghiệm Một gen ngắn thu nhận tổng hợp hố học Ví dụ, người ta tổng hợp gen mã hoá cho hormon sinh trưởng somatostatin động vật có vú (peptit hormon có 14 a.a) Gen hoạt 282 động tế bào E coli gắn vào plasmid có bổ sung cho đoạn khởi động (promotor) Kết sản sinh hormon tăng trưởng Một gen kiểm tra hormon khác tổng hợp nhân tạo Tạo vector chuyển gen Những đòi hỏi vector chuyển gen Một gen muốn chuyển vào tế bào nhận chủ định, cần đưa vào đơn vị định hướng (vector) nhằm: Bổ sung cho gen thành phần điều hoà (và vùng chức khác), giúp cho gen bảo tồn tính (hoạt tính mã dịch mã), Nhân lên thành nhiều bản, Có thể nạp cách hiệu vào nhiễm sắc thể tế bào nhận Vector chuyển gen phân tử ADN có khả tự tái tồn độc lâp tế bào mang gen cần chuyển Với mục đích nêu trên, vector chuyển gen cần thoả mãn yêu cầu sau: - Có trật tự khởi đầu chép (trật tự ori) để tiến hành trình tái - Có trật tự nhận biết đặc hiệu cho enzym giới hạn thực cắt tạo đầu hở để thực gắn gen cần chuyển (gen lạ) vào vector Các trật tự thường nằm cách xa điểm khởi đầu chép (ori) - Có vùng khởi động (promotor) bổ sung cho gen lạ để đảm bảo hoạt tính mã Khi cần thiết, vector cịn bổ sung thành phần khác cho gen lạ, ví dụ: Bổ sung trật tự điểm gắn với riboxom để dịch mã (điểm rbs), … - Vector phải chứa gen thị để dễ dàng phát chọn lọc chúng có gen lạ gắn vào - Vector có gen lạ (ADN tái tổ hợp) tồn ổn định tế bào chủ trạng thái độc lập gắn vào nhiễm sắc thể tế bào nhận Một số loại vector a Các plasmid Plasmid - nhân tố di truyền nhiễm sắc thể, phân tử ADN vòng, nhỏ phát thấy tế bào chất vi khuẩn, có khả tái độc lập với tái ADN nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn Plasmid chứa số gen khác nhau, dựa vào gen mà người ta phân nhóm plasmid tự nhiên Ví dụ: plasmid R chứa số gen đề kháng thuốc kháng sinh, , plasmid F chứa yếu tố giới tính vi khuẩn Plasmid có chất quan trọng, đáp ứng yêu cầu vector chuyển gen Tuy nhiên, thực nghiệm người ta (hoặc khơng) sử dụng plasmid tự nhiên, mà chúng kiến tạo lại hoàn thiện, phức tạp hơn, đa chuyên dụng hơn, phục vụ cho mục đích sử dụng khác - Một plasmid cấu tạo phức tạp sử dụng rộng rãi hơn, plasmid pBR 322, có độ dài 5.000 cặp bazơ Bình thường, plasmid tồn theo 20-30 tế bào chủ vi khuẩn Tuy nhiên, điều kiện ni cấy xác định số khuyếch đại tới 1.000 tế bào - Nguồn gốc pBR 322 plasmid nhỏ Col E1 bổ sung thêm đoạn ADN plasmid khác Nó gắn gen kháng thuốc: TelR - kháng tetracycline, ampR - kháng ampicilin, có trật tự cắt enzym giới hạn nằm hai gen (hình 11.5) Khi gen lạ xen vào vị trí cắt làm cho hai gen khỏng bị bất hoạt, điều tạo thuận lợi cho việc chọn lọc plasmid có gen lạ (plasmid tỏi tổ hợp) Ví dụ, cắt plasmid 283 enzym BamH1 - gen lạ xen vào chỗ cắt vùng gen telR, làm cho tế bào vi khuẩn có khả kháng với ampicillin Người ta chọn lọc chúng môi trường ni cấy có kháng sinh - Các plasmid đa chuyên dụng: Đó plasmid thiết kế theo kiểu phân bố trật tự xếp liên tục tạo thành khối để thuận lợi cho việc sử dụng loại enzym giới hạn khác Loại enzym giới hạn chọn lọc nhằm tạo đầu cắt có hiệu tốt cho gắn gen lạ cụ thể Có nhiều plasmid thuộc nhóm này, ví dụ plasmid thuộc gia đình pUC, gia đình Gemini (hình 11.6) Hình 11.5 Plasmid 322 Trên ADN plasmid vị trí cắt enzym giới hạn Hình 11.6 Plasmid thuộc gia đình Gemini khối điểm cắt Các plasmid thường dùng làm vector chuyển gen tế bào sinh vật nhân sơ Ở thực vật bậc cao sử dụng Ti-plasmid vi khuẩn A tumefaciens làm viector chuyển gen b Phage λ Các thực khuẩn thể (phage) - (virus sống tế bào vi khuẩn) sử dụng làm vector Vector phage λ thường sử dụng rộng rãi để tách dòng ADN việc thiết lập ngân hàng gen, mang đoạn ADN lớn (15 - 23 ngàn đôi nucleotit), dễ bảo quản dễ tách để phân tích Hơn nữa, phage λ cịn có hệ thống tự xâm nhập sản sinh tế bào vi khuẩn với hiệu cao nhiều so với xâm nhập plasmid Ngoài ra, phage M13 - dạng phage thể sợi, có ADN mạch đơn, dùng làm vector để nhân dòng mẫu ADN thử (ADN mạch đơn), sử dụng vào mục đích chuyên dụng khác C Một số dạng vector khác Trong việc thiết kế vector, người ta gắn plasmid với đoạn ADN phage, ví dụ: - Cosmid: Đây vector cấu tạo từ plasmid có gắn thêm gen phage Gen cosmid giúp cho ADN phage nối đầu lại với tạo dạng vịng Cosmid có khả mang đoạn ADN lại dài tới 45 ngàn đơi bazơ, sử dụng việc tạo thư viện genom cấu tạo từ plasmid có gắn thêm đoạn ADN mạch đơn phage M13 284 Tạo Plasmid tái tổ hợp Như trình bày phần trên, vector ADN thể mang dùng để gắn đoạn ADN lạ vào, phục vụ cho mục đích chuyển gen Plasmid gắn với ADN gọi plasmid tái tổ hợp Ở mục cần giải đáp vấn đề ADN lạ gắn vào plasmid theo chế nào? Có nhiều phương pháp gắn ADN lạ vào vector Phản ứng ghép nối giai đoạn cuối thực nhờ enzym ligase Enzym ligase xúc tác phản ứng nối cách tạo liên kết photphodiester để tạo đầu nối nucleotit kề Phản ứng nối đầu dính (có trình tự bổ sung) có hiệu cao 50-100 lần so với phản ứng nối đầu tù Hai enzym sử dụng phổ biến ADN-ligase vi khuẩn E.coli ADN-ligase phage T4 a Sự gắn ADN lạ vào vector sử dụng đầu dính Vector cắt enzym giới hạn (ví dụ: EcolR1) tạo hai đầu dính với trình tự đặc thù Khi ADN genom khác cắt enzym loại tạo đoạn cắt có đầu dính với trật tự tương đồng (bổ sung) với đầu dính vector Enzym ligase xúc tác cho phản ứng nối đoạn ADN có đầu dính với hiệu cao Phương pháp ứng dụng rộng rãi việc tạo plasmid tái tổ hợp b Phương pháp dùng đoạn nối (linkers) Như biết, enzym ligase xúc tác phản ứng nối ADN đầu tù, với hiệu thấp Đối với đoạn ADN cắt đầu tù, c-ADN, người ta thường dùng mẫu oligonucleotit ngắn để làm cấu trúc đầu nối theo kiểu đầu dính Các mẫu nối thiết kế cho chúng có trật tự đặc hiệu với enzym giới hạn cắt vector Sau thực trình cắt enzym giới hạn (EcoR1), ta thu đầu dính tương đồng ADN lạ vector Chúng nối lại với cách hiệu nhờ E coli ADN-ligase (hình 11.7) Hình 11.7 Sơ đồ gắn đoạn ADN lạ vào vector chuyển gen nhờ nối đầu dính Khi vi khuẩn nhiễm vào tế bào chủ (thực vật mầm), Ti-plasmid vi khuẩn chuyển Ti-ADN vào nhân tế bào chủ Ở đó, nhóm gen Ti-ADN biểu nhờ hệ thống sinh tổng hợp protein tế bào chủ để tạo sản phẩm phục vụ cho hoạt động ký sinh vi khuẩn Đó là: 285 - Nhóm 1: Gồm gen mã hoá enzym tham gia vào việc tổng hợp số a.a bất thường gọi opines Các opines sử dụng chất dinh dưỡng vi khuẩn A Tumefaciens nhờ nhóm gen khác có mặt Ti-plasmid (tham gia vào phân giải opines) - Nhóm 2: bao gồm gen iaaM iaaH mã hố enzym có vai trị việc hình thành auxin Gen thứ iptZ mã hố enzym tham gia vào việc hình thành phytohormon thứ hai Hai loại phytohormon cảm ứng phân chia tế bào gia tăng chỗ bị nhiễm vi khuẩn chủ, từ tạo thành khối u lớn Hình 11.8 Sơ đồ dùng đoạn nối để gắn ADN vào vector Ngồi ra, Ti-plasmid cịn có gen mã hoá protein tham gia vào trình tách chuyển T-ADN vào nhân tế bào chủ Như nói trên, hoạt động gen T-ADN nguyên nhân gây bệnh khối u, gen tham gia vào chuyển T-ADN coi gen gây hại, người ta đặt tên cho chúng vir-gen (vir-viruslence) b Cơ chế chuyển T-ADN từ plasmid vi khuẩn vào tế bào chủ Các vir-gen kích thích hoạt động chất gây cảm ứng (chất tạo tế bào chủ bị nhiễm vi khuẩn) Sau sản phẩm gen vir-gen tham gia vào việc tách T-ADN khỏi Ti-plasmid chuyển vào tế bào chủ Ở hai đầu T-ADN Ti-plasmid có hai trật tự đặc biệt, dài 25 đơi bazơ trật tự bờ phải (RB) trật tự bờ trái (LB) T-ADN tách từ hai bờ Quá trình gồm hai bước: Ở bờ phải xẩy cắt vị trí bazơ 3-4 sau cắt thứ hai xẩy trật tự bờ trái đoạn T-ADN mạch đơn tách T-ADN chuyển vào tế bào chủ chế tiếp hợp hai vi khuẩn (hình 11.8) Trên Ti-plasmid đoạn đơn T-ADN tổng hợp hồi phục Có thể có nhiều đoạn T-ADN chuyển vào tế bào chủ Ở nhân tế bào chủ (có xẩy phân bào - tái ADN) đoạn T-ADN mạch đơn gắn vị trí ngẫu nhiên sợi ADN mạch đơn nhiễm sắc thể chủ Tuy nhiên, hiểu biết chế cịn 286 Hình 11.9 Cơ chế chuyển T-ADN từ Ti-plasmid A tumefacienns vào tế bào chủ Ti-plasmid thiết kế vector chuyển gen Như trình bày Ti-plasmid có tính chất quan trọng lây nhiễm tế bào thực vật từ người ta sử dụng để thiết kế kiểu vector cho việc chuyển gen a Phương pháp tạo vector hợp Đây vector phức tạp, hình thành qua bước: Hình 11.10 Sơ đồ trình tạo vector hợp A tumefaciens để chuyển gen 287 - T-ADN gắn vào plasmid chuẩn, sử dụng phổ cập vi khuẩn E coli, pBR322 tạo thành vector trung gian (hình 11.10) Bên cạnh cấu phần vector (điểm tái bản, gen thị để chọn lọc vi khuẩn -AmpR, ) plasmid đưa vào gen thị dùng cho việc chọn lọc sản phẩm chuyển nạp, gen NPTII kiểm tra tính kháng với kanamixil (kanR) Vector gắn với gen cần chuyển nạp - Chuyển vector trung gian vào tế bào E coli, sau việc chọn dịng, tiến hành chuyển vào tế bào vi khuẩn A Tumefaciens có Ti-plasmid nguyên thủy theo chế tiếp hợp tế bào vi khuẩn (hình 10.10) Ở A tumefaciens hai plasmid tiếp hợp với theo đoạn tương đồng T-ADN Từ xẩy trình tái tổ hợp, kết thu vector hợp chất, bao gồm Ti-plasmid, T-ADN, gen cần chuyển hệ thống di truyền khác, A tumefaciens có vector hợp cho lây nhiễm tế bào thực vật chuyển gen b Phương pháp tạo hệ thống vector kép chuyển gen Theo hệ thống này, tế bào A tumefaciens đồng thời tồn plasmid: (1) Tiplasmid nguyên thủy thực chức trợ giúp; (2) plasmid chuẩn (có thành phần cần thiết vector chuẩn) gắn vào trật tự bờ trái phải (LA, RB) Tiplasmid gen cần chuyển (plasmid thứ gọi plasmid thiết kế (hình 11.10) Hình 11.11 Sơ đồ hệ thống vector kép chuyển gen polygalacturonase (PG) vào tế bào cà chua nhờ hệ thống vector 288 Chức trợ giúp Ti-plasmid nguyên thủy thể chỗ cung cấp protein tham gia vào việc tách chuyển T-ADN (do vir kiểm tra) Các protein thực việc cắt hai trật tự bờ (LB, RB) plasmid thiết kế Như vậy, phận ADN hai bờ (LB, RB) có mang gen cần chuyển đưa vào tế bào thực vật Hình 11.11 trình bày sơ đồ chuyển gen ngược nghĩa polygalacturonase (PG) vào tế bào cà chua nhờ sử dụng hệ thống vector kép Từ mARN gen PG người ta thu nhận cADN, tách dịng dạng ngược nghĩa (antisense) Tiếp theo gắn với vùng khởi động virus khảm hoa (CaMV) đưa vào plasmid thiết kế để chuyển vào tế bào cà chua (thông qua hệ thống vector kép A tumefaciens) Ở tế bào chuyển gen, mARN gen PG ngược nghĩa kết cặp với mARN gen PG khởi thủy, kết mARN không thực trình dịch mã riboxom thiếu hụt enzym polygalacturonase làm cho cà chua chậm chớí, bảo quản lâu c Một số thuận lợi sử dụng A tumefacientrong việc chuyển gen thực vật A tumefacien dùng để thực lây nhiễm cho tế bào thuộc nhóm hai mầm, có hiệu cao sử dụng để chuyển gen nhóm Vật liệu cho lây nhiễm đa dạng: Các tế bào trần, tế bào callus, đỉnh sinh trưởng, loại mô khác có khả tái sinh cây, mơ dễ thực Sau lây nhiễm, tiến hành chọn lọc tế bào chuyển gen theo biểu gen thị có hệ thống chuyển nạp, ví dụ chọn lọc tế bào kháng thuốc trừ cỏ Kanamixin, Các tế bào chuyển nạp tái sinh tiếp tục phát gen cần chuyển nạp Ở đối tượng dễ nuôi cấy thuốc lá, khoai tây, cà chua, … trực tiếp sử dụng mầm lây nhiễm A tumfaciens tái sinh Các mẫu vô trùng, cắt rời thành mảnh nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn A tumfaciens (có hệ thống vector chuyển gen) Sau mẫu đưa vào môi trường nuôi cấy Các vi khuẩn thâm nhập vào tế bào chủ tạo tế bào chuyển gen Chúng chọn (bằng gen kháng kanamixin, β-glucuronidase, …) cho tái sinh Một số phương pháp chuyển gen khác thực vật a Sử dụng vector chuyển hoá virus Một số virus thực vật làm vector chuyển gen, ví dụ: Virus gây khảm vàng cà chua (TGMV) ADN virus dễ tách thành hai phân tử A phân tử B Chỉ phân tử A thực nhân tế bào chủ, phân tử B cần thiết cho lây truyền Trong thiết kế vector chuyển gen, người ta sử dụng phân tử A cắt bỏ phần ADN mang gen tạo vỏ virus, thay vào gen thị (gen NPT II) để chọn lọc sản phẩm chuyển nạp, lắp thêm trật tự bờ LB, RB gắn thêm gen cần chuyển Sau thiết kế, vector đưa vào A tumfaciens có Ti- plasmid nguyên thủy Cho vi khuẩn lây nhiễm vào tế bào cần chuyển gen Sự chuyển nạp được diễn theo chế hoạt động hệ thống vector kép trình bày phần Ngoài TGMV, Cauliflower mosaie virus (CaMV) dùng làm vector chuyển gen thực vật b Chuyển gen trực tiếp vi bắn (microprojectile bombarment) Đối với lồi thực vật thuộc nhóm mầm khó thực chuyển gen lây nhiễm A tumfaciens, người ta sử dụng số phương pháp chuyển gen trực tiếp, có phương pháp vi bắn Một gen cần chuyển (đã gắn với promotor) tách dịng vector Vật liệu chuyển gen phủ lên bề mặt hạt nhỏ (đạn) làm vàng hay 289 wolfram có đường kính 1mm, nhờ kết dính CaCl2 sperimidine PEG Súng bắn thiết bị đặc biệt, có đủ sức nén (tốc độ bắn hạt 430 m/s) để bắn vi hạt vào tế bào cần chuyển gen (hình 11.12) Mật độ bắn hạt cần điều chỉnh cho hợp lý để không làm tổn thương nặng tế bào Sau đó, tế bào ni cấy, chọn lọc tế bào có gen chuyển nạp tái sinh Hình 11.12 Sơ đồ chuyển trực tiếp ADN vào tế bào vi bắn Các hướng tạo cá chuyển gen Hầu hết tài liệu công bố kết chuyển gen mô tả giản đơn biểu gen chuyển, thực chất việc biểu gen vấn đề lớn Người ta cho ADN tạo dòng vật liệu tốt để đạt biểu gen, đặc điểm nhân tạo phân tử c-ADN hay tương tác đoạn promotor từ lồi khơng phải cá tạo nên biểu tốt gen cá thể nhận Một khía cạnh khác vấn đề biểu gen chuyển thành phần đoạn đưa vào, không gen đưa vào mà gen đưa vào theo tình tự Hơn nữa, biểu phân hóa tế bào đặc điểm phổ biến việc sản xuất protein thể đa bào, kể cá Sẽ khơng có ý nghĩa việc đưa gen sản xuất amylase vào cá để biến chúng thành dạng ăn thực vật enzym sản xuất não khơng phải sản xuất tụy Một điểm đặc điểm tương tác đa hiệu gen phổ biến với gen sửa chữa khác tạo nên chế điều khiển bên chức hình thái thể phức tạp Do đó, hệ quan trọng xuất protein không dễ tạo nên biểu tiêu chuẩn 290 Bảng 11.1 Một số thành tựu chuyển gen hormon sinh trưởng vào cá Loại cá Promotor Cá chép (Cyprinus carpio) MT chuột Cá diếc (C auratus) (P asoltus L.) MT chuột Cá chạch (M anguillicaudatu) Cá rơ phi (Oreochromis.sp ) MT chuột Cá chó (Esoxlucius) Cá hồi Atlantic (Salmo salar) Cá hồi bạc (Oncorhynchus kisutch) Cá rô phi (Oreochromis niloticus) Cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvelenus alpinus L.) Cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mkyss) Cá chép (Cyprinus carpio) Cá chạch (Misgurnus mizolepis) Cá rohu (Laveorohita) RSV RSV CMV AFP cá hồi đại dương RSV AFP cá hồi Đại cương MT cá hồi mắt đỏ AFP cá hồi đ dương AFP cá hồi đ dương MT cá hồi mắt đỏ MT cá hồi mắt đỏ H3 cá hồi mắt đỏ GH2 cá hồi Đại Tây Dương b-actin cá chép b-actin chạch cá CMV ?actin cá chép Nguồn gen GH Tổ hợp gen Gen GH người Gen GH c-ADN cá hồi cầu vồng Gen GH người Gen GH c-ADN cá hồi bạc Gen GH người Gen GH cDNA cá rô phi Gen GH cDNA cá hồi vua Gen GH cDNA bò Gen GH cDNA cá hồi trắng (Chinook salmon) GH minigene mMThGH Gen GH cDNA cá hồi mắt đỏ Gen GH cDNA cá hồi trắng Gen GH cDNA cá hồi trắng Gen GH cDNA cá hồi mắt đỏ Gen GH cDNA cá hồi mắt đỏ Gen GH cDNA cá hồi mắt đỏ GH2 cá hồi Đại Tây Dương GH gen GH cDNA cá chép đỏ GH cá chạch GH rohu Phương pháp Sinh trưởng tăng (lần) Vi tiêm 1.1 Tài liệu 1,7 Zhu, 1992 Cui, 1996 Zhang, 1990 Chen,1993 Zhu, 1992 1,2 Dunham,1992 3-4 Zhu,1986 1,81 0-1,12 Martinez, 1996 Maclean, 1995 Gross,1992 OPAFPcsG H "toàn cá" 2-6 Du,1992 mMThGH1 "toàn cá" OPAFPcsG H"toàn cá" OPAFPcsGH "toàn cá" OPAFPcsG H "toàn cá" OPAFPcsG H "toàn cá" OPAFPcsG H 1"toàn cá" OnH3GH1 "toàn cá" SsGH2 "toàn cá" 3-10 Hew,1992 11 Dvelin,1994 10 Devlin,1995 Rahman, 1999 Rahman, 1998 Pitkanen, 1999b Pitkanen,1999 b Pitkanen,1999 b 1,2-1,4 mMThGH mMThGH Vi tiêm Vi tiêm 2,0 pCAgcGH pCAgcGHc "toàn cá" pm b-actGH chuyển gen đồng loài CMV-rGH, grβ-actGHrGH 14 14 Vi tiêm Xung điện 35 Zho,1992 Wang,2001 Guo,2003 Nam, 2001 4-5,8 Venugopal Tạo cá có tốc độ sinh trưởng nhanh Hướng tập trung vào việc chuyển gen GH nhằm tạo cá có tốc độ sinh trưởng nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao Nhiều nghiên cứu chứng minh “ảnh hưởng gen GH đến tốc độ sinh trường cá tăng cường chuyển hóa thức ăn” Trong số nghiên cứu này, lúc dầu dùng gen GH động vật có vú từ người, sau từ lồi cá khác Bảng 11.1 giới thiệu số công trình làm theo hưởng Ở Việt Nam, kỹ thuật chuyển gen vào cá tiến hành từ năm 1995 cá vàng (Carassius al~ratus) (Nguyễn Văn Cường cộng sự, 1995); chạch (Misgurunus anguillicaudatus) (Nguyễn Văn Cường cộng sự, 2002) gần cá chép 291 (Cyprinus caprio) (Thẩm Thị Thu Nga, 2004) Kết cho thấy gen ngoại lai xen vào hệ gen cá Các cá chuyển gen có tốc độ sinh trưởng lớn đối chứng Tạo cá có khả chịu lạnh Trong tự nhiên, cá phân bố hầu hết vực nước thuộc vùng khí hậu khác Ở vùng này, nhiệt độ thay đổi theo ngày theo mùa Qua q trình tiến hóa, cá có chế sinh lý thích ứng với điều kiện nhiệt độ thay đổi Trong điều kiện mơi trường q lạnh, vài lồi cá tiến hóa theo hướng chịu điều kiện nhiệt độ thấp nhờ protein chống lạnh AFP (antifreeze protein) Cấu trúc chức protein cho phép cá bảo vệ thể cách làm giảm điểm đơng, thay đổi ngăn chặn tốc độ đóng băng, ức chế kết tinh, bảo vệ màng tế bào khỏi nhiệt độ thấp Đã phát gen mã hóa protein chống lạnh AFP số loài cá Việc chuyển gen vào loài cá khác hy vọng mở rộng khả sống cá vào mùa đông vùng nước lạnh Người ta vi tiêm gen AFP cá bơn mùa đơng vào cá hồi khơng có gen chứng minh có mặt gen ngoại lai cá hồi chuyển gen có biểu bước đầu (Heo C.L cs., 1999) Oang cs., 1995 vi tiêm gen AFP cá lon chạch lớn (Macrozoarces americanus) vào trứng cá vàng (Carassius auratus) chứng minh biểu gen AFP cá vàng Cá vàng chuyển gen có khả chịu lạnh tốt đối chứng đưa vào môi trường có nhiệt độ thấp Tạo cá chuyển gen có khả kháng bệnh Với mục đích tăng khả kháng bệnh cá nuôi, người ta sử dụng công nghệ antisense ARN tạo sản phẩm bổ sung với ARN virus làm vơ hiệu hóa ARN virus Cơng nghệ ribozyme sử dụng để phá hủy ARN virus, virus IHNV (infectious haematopoetic necrosis virus) gây bệnh làm chết nhiều lồi thuộc họ cá hồi Gen mã hóa glycoprotein, IHNV với promotor cytomegalovirus (CMV) chuyển vào cá hồi Atlantic Kết cá chuyển gen có khả kháng bệnh tốt Tạo cá chuyển gen có màu sắc đẹp, ngoại hình đa dạng Một số gen mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh, màu đỏ hay màu vàng chuyển vào cá mú vằn (Danio rerio) hay cá medaka tạo cá có màu sắc khác (Gong Z cs., 2003; Tanaka M cs., 2001) Hướng nghiên cứu dễ dàng xâm nhập vào thị trường so với nghiên cứu cá chuyển gen làm thực phẩm Các hướng tạo cá chuyển gen khác Một số gen mã hóa protein làm tăng khả chịu mặn, gen có khả phát nhiễm nước, gen sản xuất yếu tố đông máu, v.v chuyển vào cá để xem xét biểu chúng Từ kỷ XX đến sinh học phân tử phát triển nhanh đến mức phát minh kỳ diệu, thành tựu to lớn liên tục xuất Các ứng dụng di truyền phân tử vi sinh vật học, y học, nông nghiệp (trước hết trồng vi sinh vật), v.v mang lại lợi ích to lớn cho người Di truyền nhiễm sắc thể phân tử cá nói riêng sinh vật thủy sản nói chung tiến hành nghiên cứu số nước, phần lớn kết nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng phản ánh phần trước riêng nước ta nhà khoa học có nhiều cố gắng xâm nhập sinh học 292 phân tử, sinh hóa, kỹ thuật gen, kỹ thuật nhiễm sắc thể cá có hàng chục cơng trình cơng bố với kết luận đề xuất có giá trị tham khảo Ví dụ, kết nghiên cứu đa hình di truyền số lồi cá ni kinh tế, ứng dụng kỹ thuật chuyển đổi giới tính cá rơ phi hormon sinh học, phát triển số thị phân tử (marker) liên quan đến bệnh tơm cá, tính trạng sinh trưởng, v.v Việc đầu tư nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền (gen), nhiễm sắc thể vô cần thiết để đuổi kịp nắm bắt kết ứng dụng công nghệ sinh học giới vào nghiên cứu chọn giống cá nước ta Nhưng cá nhiều vật nuôi khác, thân tính trạng kinh tế (đa phần tính trạng số lượng) quy định đa gen chịu chi phối nhiều yếu tố ngoại cảnh khác nhau; với nghiên cứu sớm để nói ''ứng dụng' cơng nghệ di truyền vào chọn giống được”, nói cách khác mức thăm dị hướng Vì vậy, theo nên tập trung thực tốt việc ứng dụng phương pháp chọn giống truyền thống đối tượng thủy sản Việt Nam Cụ thể vấn đề lai giống, phương pháp chọn lọc, vấn đề cận huyết ưu lai, v.v Những năm qua, có số kinh nghiệm bước đầu chọn giống cá chép, ý vào việc cải tạo chất lượng di truyền loài cá kinh tế quan trọng cá tra, cá rô phi, cá trắm cỏ, cá Mrigan hóa số đối tượng ni khác Nếu trang bị vật chất, kỹ thuật tốt áp dụng đắn phương pháp chọn giống truyền thống với hỗ trợ phần sinh học phân tử định mang lại kết tốt, góp phần quan trọng việc phát triển nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam tương lai TÓM TẮT CHƯƠNG Thế kỷ XXI kỷ công nghệ sinh học Ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tiễn, đặc biệt thực tiễn sản xuất nông nghiệp (cây trồng) đem lại nhiều thành tựu Công nghệ sinh học-di truyền phân tử với kỹ thuật PCR, chuyển ghép gen, ứng dụng chúng để tạo nên giống cá có khả chống bệnh, tạo cá có tốc độ sinh trưởng nhanh, tạo cá có khả chịu lạnh, tạo lồi cá có màu sắc đẹp, hướng đem lại nhiều hiệu cho sản xuất Đó nội dung chương cuối chương trình sơ di truyền chọn giống trồng mà muốn đưa đến cho người học CÂU HỎI Hãy trình bày khái niệm kỹ thuật di truyền Enzym giới hạn gì? Hãy cho biết tính chất enzym giới hạn Phương pháp RELP (Restriction Fragment Length Polymorphism) gì? REFL có ứng dụng nào? Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR - Polymerase Chain Reaction) gì? Hãy trình bày hiểu biết Taq polymerase thành phần khác phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp) có đặc điểm gì? Hãy trình bày ý nghĩa ứng dụng PCR Hãy trình bày khái niệm thu nhận gen phương pháp thu nhận gen Vector chuyển gen gì? Vector chuyển gen có địi hỏi gì? 10 Hãy nêu trình bày điểm loại vector chuyển gen 11 Kỹ thuật tạo ARN ngược nghĩa gì? Làm để điều khiển biểu gen? 293 12 Hãy trình bày hướng tạo cá chuyển gen 13 Hãy phân tích khía cạnh khác sản phẩm (lương thực, thực phẩm) chuyển gen 294 10 11 12 13 14 15 16 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Ân, Hoàng Dán, Lê Viết Ly, Nguyễn Thiện, Trần Xuân Thọ; Di truyền học động vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1983 Hồng Dán, Trần Đình Miên; Di truyền học gia súc, tập I II Trường ĐH Nông nghiệp II, Hà Bắc 1971 Douglas Tave: Genetics for Fishery Managers; AVI Publishing Company, Inc Westport Connecticut, 1986 Dubinin N.P.: Di truyền học đại cương, người dịch: Trần Đình Miên, Phan Cự Nhân, NXB Nông nghiệp NXB Mir Mat va, 1981, Nguyễn Kim Đường: Bài giảng Di truyền học, dùng cho ngành nông nghiệp, chăn nuôi thú y, nuôi trồng thủy sản, Trường ĐH Nông Lâm Huế, 1998 Nguyễn Kim Đường: Cơ sở di truyền chọn giống thủy sản, tài liệu tham khảo, Trường ĐH Vinh, 2002 Nguyễn Kim Đường: Cơ sở di truyền chọn giống trồng, tài liệu tham khảo, Trường ĐH Vinh, 2002 Nguyễn Kim Đường, Trần Đình Miên, Nguyễn Tiến Văn: Chọn giống nhân giống gia súc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1992 Falconer D.S.: Introduction to Quantitative Genetics, second edition, Longman London and New York, 1981 Nguyễn Minh Hoàn, Nguyễn Kim Đường, Phạm Khánh từ: Di truyền học động vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2000 Hutt F.B.: Di truyền học động vật, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1978 Klug W.S., Cummingham M.R.: Concepts of Genetics, Scott, Foresmen, and Company Glenview, Illinois, London England, 1986 Đặng Hữu Lanh, Trần Đình Miên, Trần Đình Trọng: Cơ sở di truyền chọn giống động vật, NXB Giáo dục, 1999 Lê Đình Lượng, Phan Cự Nhân: Cơ sở di truyền học, NXB Giáo dục, 1994 Nguyễn Hồng Minh: Di truyền học, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1999 De Robertis E.D.P, Nowinski W.W., Saez F.A.: Biologia Celular, sexta edicion totalmente renovada, Edicion Revolucionada, Instituto del Libro, Vedado Habana, Cuba, 1965 Trần Đình Trọng, Đặng Hữu Lanh, Cơ sở di truyền chọn giống cá, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2005 295 ... Các yếu tố di truyền tế bào chất có đặc trưng gì? Hãy trình bày đặc trưng di truyền yếu tố di truyền nằm lạp thể Hãy trình bày đặc trưng di truyền yếu tố di truyền nằm ty thể Thế di truyền qua... lần 25 10 300 30 39 20 1-9 Thời gian sốc kéo dài (phút) 3-7 1-5 20 1 10 7 45 Nhiệt độ (0C) 34 34 26 37 36 29 31- 32 31- 32 0 -2 Tỉ lệ cá tam, tứ bội thể (%) 33 - 52 2-14(4n) 100 >40 >10 (4n) 21 24 ... đồ H2O → H+ + OH-, gốc tự hố hợp theo phản ứng: H+ + H+ → H2 OH + OH → H2O2 → H2O + O Nếu môi trường chiếu xạ có nhiều oxy, cịn xẩy số phản ứng dẫn tới lượng H2O2 tăng sau: H+ + O2 → HO2+ HO2+