Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - PHÙNG KHẮC HUY CHÚ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ CHỨA DIOXIN CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE Chuyên ngành: Kỹ thuật mơi trường Mã số: 9.52.03.20 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MƠI TRƯỜNG Hà Nội, 2018 Cơng trình hồn thành tại: Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà Người hướng dẫn khoa học 2: Phản biện 1:……………………… Phản biện 2:……………………… Phản biện 3:………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án Tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi… giờ……ngày…… tháng………năm …… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ; - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Trong năm gần đây, nhiễm loại hóa chất có chất hữu khó phân hủy (POPs) người tạo nên ngày tăng, gây nên nhiều hệ lụy cho sức khỏe người môi trường Ở nước phát triển Việt Nam, việc sử dụng xả thải hóa chất nơng nghiệp, cơng nghiệp, y dược ngành sản xuất khác khả kiểm sốt gây nên hậu nghiêm trọng với mơi trường người Ngồi chất diệt cỏ chứa dioxin tồn lưu từ chiến tranh sau 40 năm chất dioxin hình thành q trình phát triển cơng nghiệp tiếp tục gây nhiều hậu nghiêm trọng cho môi trường sinh thái người Việt Nam Việt Nam nước nhiệt đới có đa dạng sinh học nằm top 10 giới, đặc biệt đa dạng vi sinh vật Có nhiều lồi vi sinh vật sinh tổng hợp loại enzyme khác Hai họ oxidoreductive peroxidase bao gồm loại enzyme có nhiều ứng dụng mang hiệu cao lĩnh vực kinh tế bảo vệ sức khỏe người Trong laccase khơng có hoạt tính cao mà cịn có khả hoạt động mạnh cần oxy tự với hỗ trợ chất gắn kết hay hệ chất gắn kết (mediator) laccase quan tâm nhiều Chính vậy, đề tài nghiên cứu nghiên cứu sinh với tên “Nghiên cứu khả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính phân hủy chất diệt cỏ/dioxin vi sinh vật sinh enzyme laccase” tiến hành 2 Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn vi sinh vật có khả sinh laccase, laccaselike từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì, đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Biên Hòa; Đánh giá khả phân hủy chất diệt cỏ chứa dioxin loại màu thuốc nhuộm hoạt tính laccase, laccase-like chủng VSV lựa chọn nhằm định hướng áp dụng hoạt động quốc phòng Nội dung thực Phân lập, phân loại nấm, xạ khuẩn có khả sinh laccase laccase-like có tiềm cao từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng Nai; Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm, xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp laccase, laccase-like cao; Tách chiết tinh laccase, laccase-like từ đại diện nấm, xạ khuẩn có hoạt tính cao phân lập; Nghiên cứu đặc tính hóa-lý, hóa sinh laccase, laccase-like tinh sạch; Đánh giá hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp, thuốc nhuộm hoạt tính laccase, laccase-like thân chủng VSV sinh tổng hợp laccase, laccase-like; Đánh giá khả phân hủy chất diệt cỏ 2,4D, 2,4,5-T tinh khiết có đất nhiễm sân bay Biên Hịa laccase, đơn chủng hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase; Đánh giá hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD đơn chủng hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase; CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Laccase, laccase-like vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like 1.1.1 Giới thiệu chung laccase Laccase quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm với nội dung: nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, cấu tạo phân tử chế hoạt động xúc tác, nghiên cứu gene, protein đặc điểm hóa - lý laccase Qua cho thấy laccase đối tượng nghiên cứu chi tiết Đến thời điểm nay, có cơng trình sử dụng tổ hợp nhiều chủng vi sinh tổng hợp laccase xử lý nhiễm mơi trường nói chung thuốc nhuộm, chất nhiễm hữu khó phân hủy nói riêng, việc lựa chọn tổ hợp nhiều vi sinh vật sinh tổng hợp laccase có khả cao khơng đơn giản nghiên cứu địi hỏi nhiều cơng sức Đây hội cho nghiên cứu nhằm tìm kiếm đường để tạo nên cơng nghệ xử lý nhiễm mơi trường nói chung công nghệ xử lý nước thải dệt nhuộm môi trường ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin nói riêng Kết nghiên cứu khả laccase cần tiếp tục thực để bổ sung sở khoa học, sở liệu mức độ đa dạng chủng vi sinh vật sinh tổng hợp laccase nói chung phương diện địa lý, hệ sinh thái khác nói riêng 1.1.2 Giới thiệu laccase-like Trong trình sinh trưởng mình, chủng nấm khả sinh tổng hợp enzyme có chất protein chúng cịn có khả khác sinh tổng hợp số tác nhân sinh học có khối lượng phân tử thấp, tên gọi chất phụ thuộc vào nguồn gốc sinh Các tác nhân có khả oxy hóa giống laccase đặc điểm hóa-lý khác Các hợp chất khơng có cấu tạo protein mà đoạn peptides có hoạt tính oxy hóa cao Một số nghiên cứu Việt Nam phát chất có hoạt tính sinh học sinh tổng hợp từ chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Biên Hòa, nhiên nghiên cứu chi tiết để tìm hiểu đặc tính hóa-lý khả ứng dụng chúng loại màu thuốc nhuộm, phân hủy hợp chất hữu mạch vòng cơng bố Vì vậy, để phân biệt với tên gọi thuật ngữ nghiên cứu trước thuận tiện việc gọi tên nghiên cứu Luận án, hoạt chất gọi laccase-like 1.2 Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm công nghệ xử lý Phần nêu đặc điểm nước thải dệt nhuộm, công nghệ sử dụng để xử lý nước thải dệt nhuộm Trong tập trung tổng quan nghiên cứu ứng dụng laccase, vi sinh vật sinh tổng hợp laccase xử lý loại màu loại thuốc nhuộm 1.3 Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Việt Nam công nghệ xử lý Phần nêu trạng ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin "điểm nóng" Việt Nam, nhấn mạnh trạng ô nhiễm sân bay Biên Hịa Tổng hợp cơng nghệ thống kê giới Việt Nam xử lý môi trường ô nhiễm dioxin Tập trung tổng hợp nghiên cứu sử dụng enzyme ngoại bào nói chung laccase nói riêng xử lý hợp chất hữu hợp chất hữu khó phân hủy CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Chủng vi sinh vật Các chủng nấm đảm thu thập phân lập độ cao 600m từ rừng Quốc gia Ba Vì khu vực Ba Trại xung quanh khu vực chân núi Ba Vì thành phố Hà Nội; Các chủng xạ khuẩn thu thập từ lô xử lý sinh học đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin khu vực XĐ-1 sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng Nai; Các chủng xạ khuẩn thu thập từ đất ô nhiễm khu vực ô nhiễm Tây - Nam (Pacer Ivy) sân bay Biên Hòa tỉnh Đồng Nai; Chủng nấm đảm FBD154 phân lập từ khu vực rừng Quốc gia Bidoup-Núi Bà, Lâm Đồng nấm sợi FNBLa1 phân lập từ rơm mục Ninh Bình sưu tập giống nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học 2.1.2 Đối tượng thử nghiệm Các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T tinh khiết tiêu chuẩn phân tích (PA) Sigma đồng loại độc 2,3,7,8-TCDD; Đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin thu thập từ khu vực sân bay Biên Hồ, có độ độc trung bình khoảng 20.000 ngTEQ/kg; Một số thuốc nhuộm tổng hợp thuộc nhóm azo anthraquinone; Các loại thuốc nhuộm hoạt tính thương mại thu thập từ Nhà máy X20/Tổng Cục Hậu cần 2.1.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu Môi trường Gause M; Dịch chiết khoai tây (DCKT); Môi trường PDA/B; Môi trường Czapeck; Môi trường PDB-DT; Môi trường MEG; Môi trường Vis; Môi trường TSH1; 2.2 Phương pháp nghiên cứu Do thực nhiều thực nghiệm để xác định đặc tính, khả laccase, laccae-like thân chủng vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccae-like loại màu thuốc nhuộm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin nên sơ đồ thực nghiệm mơ tả sơ đồ Hình 2.1 Hình 2.1 Sơ đồ thực nghiên cứu 2.2.1 Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật 2.2.2 Phân loại vi sinh vật 2.2.3 Phương pháp hóa – sinh 2.2.4 Xác định khả loại màu thuốc nhuộm 2.2.5 Xác định khả phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 2.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu phân tích xử lý phần mềm Microsolf excel/Microsoft office 10 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Phân lập, tuyển chọn định tên chủng nấm xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp laccase, laccase-like 3.1.1 Phân lập lựa chọn để phân loại nấm đảm có hoạt tính laccase cao Đã thu thập 45 mẫu nấm đảm có tự nhiên đất có gỗ mục khu vực lấy mẫu Sau ngày nuôi cấy, 22 chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng bề mặt môi trường, hệ sợi nấm bơng xốp có màu trắng, mịn tạo vịng nâu đỏ mơi trường có chứa chất thị guaiacol Hoạt tính laccase in situ xác định sau mẫu nấm đưa phịng thí nghiệm tiến hành Kết thu chứng tỏ chủng có khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (MnP, LiP) oxidoreductase (laccase) Kết cho thấy có khoảng 16 mẫu nấm thu thập rừng Quốc gia Ba Vì sinh tổng hợp laccase Dựa vào kết đo hoạt tính laccase in situ khả sinh trưởng Dựa vào kết đo hoạt tính laccase in situ khả sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, chủng FBV40 lựa chọn để nghiên cứu phân loại, đặc tính enzyme, khả loại màu thuốc nhuộm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin Như xét đặc điểm mẫu, hình thái khuẩn lạc, bào tử trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng nấm FBV40 (đã đăng ký trình tự GenBank với mã số MG243365) xét vào chi Rigidoporus đặt tên Rigidoporus sp FBV40 Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loài chủng nấm FBV40 3.1.2 Phân lập phân loại xạ khuẩn có khả sinh trưởng môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin sinh tổng hợp laccase-like Từ nguồn đất ô nhiễm, chủng xạ khuẩn phân lập có chủng (XKBHN1, XKBHN2) từ đất khu vực Tây - Nam chủng XKBiR1, XKBiR2, XKBiR3, XKBiR4, XKBiR929 XKBiR930 từ đất nguyên thủy (trước xử lý khu vực Z1) ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin sân bay Biên Hòa Dựa đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử so sánh trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA, chủng XKBHN1, XKBiR929 xếp vào chi Streptomyces đặt tên Streptomyces sp XKBHN1 Streptomyces sp XKBiR929 Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loài chủng XKBHN1 XKBiR929 3.1.3.2 Sinh trưởng XKBHN1 XKBiR929 môi trường chứa chất hữu có clo hydrocacbon có vịng thơm (PAHs) Sau ngày ni cấy điều kiện 30ºC, lắc 120 vòng/phút, hai chủng XKBHN1 XKBiR929 có khả sinh trưởng 10 thấy khả oxy hóa ABTS sang màu xanh Đây chất trao đổi có khả tham gia phản ứng oxy hóa hợp chất hữu vịng thơm, để khẳng định điều cần nhiều nghiên cứu chi tiết để tìm hiểu rõ chất hóa học hoạt động xúc tác chất sinh tổng hợp chủng xạ khuẩn XKBiR929 3.2.3 Đặc tính hóa-lý laccase laccase-like tinh 3.2.3.1 Đặc tính hóa-lý laccase tinh a) Ảnh hưởng pH lên hoạt tính độ bền laccase Kết thu cho thấy, pH Lac1 Lac2 đạt hoạt tính cao Lac1 hồn tồn hoạt tính giá trị pH 1, 7, 8, 9, Lac2 pH Về độ bền hoạt tính laccase tinh sạch, Lac1 pH hoạt tính cịn lại 50% giá trị pH 3, hoạt tính cịn lại tương ứng 21 29% sau h Trong đó, Lac2 pH hoạt tính cịn lại 92% pH 3, 4, hoạt tính cịn lại tương ứng 54, 55 78% sau h Như vậy, thấy có khác pH mơi trường lên hoạt tính laccase isozyme từ chủng FBV40, đặc biệt ảnh hưởng tới độ bền b) Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính độ bền nhiệt Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính độ bền nhiệt Lac 1, Lac từ chủng FBV40 thực khoảng từ 35 đến 70oC thời gian khảo sát đến 140 phút Lac Nhiệt độ từ 30 đến 90oC độ bền nhiệt khảo sát từ 35 đến 70oC với thời gian kéo dài đến 180 phút Lac Kết thu được, Lac1 Lac2 đạt hoạt tính cao 60°C 11 Trong khoảng nhiệt độ từ 65 đến 70°C Lac1 giảm hoạt tính tương ứng từ 15 đến 23% Lac2 giảm hoạt tính từ 20, 32 75% nhiệt độ tương ứng 70, 80 90°C Hoạt tính Lac1 bền 35oC cịn 18% so với hoạt tính ban đầu sau 140 phút, hoạt tính Lac2 đạt 92% 90% ở 30oC 40oC sau 180 phút c) Cơ chất đặc hiệu Lac1, Lac2 oxy hóa chất đặc hiệu laccase ABTS, syringaldazine (Syrin), 2, 6-DMP guaiacol (Gua) Hoạt tính Lac1 với chất 2,6-DMP, guaiancol syringaldazine so với ABTS 76,5%, 0,54% 0,13%, tương ứng với Lac 74%, 0,3% 0,2% d) Ảnh hưởng chất ức chế ion kim loại Ảnh hưởng số chất ức chế protein điển lên hoạt tính Lac1, Lac nghiên cứu Kết tổng hợp sau: Chất ức chế SDS EDTA Cl- L-cystein Nhận xét mức độ bị ức chế Lac Lac Bị ức chế hoàn toàn bất Bị ức chế hoàn toàn kỳ nồng độ nồng độ 10 mM bị ức chế hồn 10 mM hoạt tính bị ức tồn; mM hoạt tính bị chế 92%, mM hoạt ức chế 65,5% mM tính bị ức chế 58,4% hoạt tính bị ức chế mM hoạt tính bị 28,5% ức chế 31,6% 10 mM bị ức chế hồn tồn; mM hoạt tính bị ức chế 72%; mM hoạt tính bị ức chế 9,4% mM 10 mM hoạt tính bị ức chế hồn tồn; 12 mM hoạt tính bị ức chế 54,5% Arginin - 10 mM hoạt tính bị ức chế 48%; mM hoạt tính bị ức chế 36,5; mM hoạt tính bị ức chế 28,5% Chú thích: "-" không thử nghiệm ion Cu2+ Mg2+ Ni2+ Mn2+ Co2+ Ảnh hưởng ion kim loại sau: Nhận xét mức độ ảnh hưởng Lac Lac Làm tăng 109% hoạt tính Làm tăng 112% đến nồng độ mM 184,6% hoạt tính nồng độ tương ứng từ 1,0 đến mM Ức chế hoạt tính tất Ức chế hoạt tính tất các nồng độ dao nồng độ dao động động khoảng khoảng 21,5 đến 78,95% 11,6% đến 27% tương tương ứng từ 0,5 mM đến ứng với từ 0,5 mM 5,0 mM đến 5,0 mM Ở 1,0 mM làm tăng 100,6% Ức chế hoạt tính tất hoạt tính, nồng độ cịn nồng độ lại ức chế dao động dao động từ 12,8% từ 5,3% đến 44,4% tương đến 30% với nồng độ ứng 0,5 mM đến mM từ 0,5 mM đến mM Ức chế hoạt tính tất Ức chế hoạt tính tất các nồng độ dao nồng độ dao động từ động từ 11,6% đến 21,1% đến 35% với nồng độ 18,9% với nồng độ từ từ 0,5 đến 5,0 mM 0,5 đến 5,0 mM Gây ức chế hoạt tính Ức chế hoạt tính tất tất nồng độ nồng độ dao động từ dao động từ 14,5% đến 15,5% đến 35,2% với nồng 32,3% với nồng độ từ độ từ 0,5 đến 5,0 mM 0,5 mM đến mM 13 Ức chế hoạt tính tất nồng độ dao động từ 95,9% đến Fe2+ 100% với nồng độ tương ứng từ 0,5 mM đến mM Ức chế hoạt tính tất Làm tăng 107% 128% nồng độ dao Ca2+ hoạt tính nồng độ 0,5 động từ 16,2% đến mM 23,3% với nồng độ từ 0,5 mM đến mM Kết thu từ nghiên cứu cho thấy, ảnh hưởng Ức chế hoạt tính tất nồng độ dao động từ 71,6% đến 93,3% với nồng độ từ 0,5 mM đến mM ion kim loại lên hoạt tính laccase sinh tổng hợp chủng FBV40 tương đồng với nghiên cứu cơng bố quốc tế, nhiên có khác biệt mức độ ức chế Lac1 Lac2 3.2.3.2 Đặc điểm động học laccase tinh Km Vmax Lac1 0,3 µM 200.000 µM/phút Trong với Lac2 0,4 µM Vmax 10.000 µM/phút 3.2.3.2 Đặc tính hóa-lý laccase thơ Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên hoạt tính laccase thơ thực Bảng 3.10 Tổng hợp yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính laccase thô/FBV40 Các yếu tố ảnh Sự thay đổi hoạt tính laccase hưởng Ảnh hưởng pH pH Hoạt tính cao pH Mất hoạt tính pH Hoạt tính cịn lại 65% sau 120 phút Ảnh hưởng nhiệt độ 30 đến 40oC Hoạt tính cao Bị ức chế 15% sau 160 phút 50oC, 60 đến 70oC 50oC 79% sau 40 phút 60oC đến 98% sau 20 phút 70oC 14 Các yếu tố ảnh hưởng Sự thay đổi hoạt tính laccase 30oC 40oC Sau 160 phút hoạt tính gần khơng bị ức chế Động học xúc tác Km 0,5 µM Vmax 25.000 µM/phút Ảnh hưởng chất ức chế Với mM bị ức chế hoàn toàn mM SDS bị ức chế 79% Với mM bị ức chế hoàn toàn mM L-lysis ức chế 86% Với mM bị ức chế 92% mM bị EDTA ức chế 10% Ảnh hưởng ion kim loại Ức chế hoạt tính tất nồng độ Co2+ dao động từ 44,7% đến 79,5% với nồng độ từ đến 10 mM Ức chế hoạt tính tất nồng độ Mn2+ dao động từ 47,3% đến 80,2% với nồng độ từ đến 10 mM Ức chế hoạt tính tất nồng độ K+ dao động từ 41,7% đến 80,7% với nồng độ từ đến 10 mM Ức chế hoạt tính tất nồng độ Na+ dao động từ 75,5% đến 94% với nồng độ từ đến 10 mM Ức chế hoạt tính tất nồng độ Mg2+ dao động từ 13,4% đến 79,1% với nồng độ từ đến 10 mM Ức chế hoạt tính tất nồng độ Ca2+ dao động từ 41,5% đến 68,5% với nồng độ từ đến 10 mM Ức chế hoạt tính tất nồng độ Fe2+ dao động từ 97% đến 97,9% với nồng độ từ đến 10 mM Ni2+ Ức chế hoạt tính tất nồng độ 15 Các yếu tố ảnh hưởng Sự thay đổi hoạt tính laccase dao động từ 2,7% đến 88,3% với nồng độ từ đến 10 mM Ức chế hoạt tính tất nồng độ Cu2+ dao động từ 48,1% đến 76,2% với nồng độ từ đến 10 mM Kết thu cho thấy, có tương đồng khả có khác biệt lớn mức độ ảnh hưởng yếu tố lên hoạt tính laccase thơ laccase tinh chủng FBV40 Kết nghiên cứu cho thấy, để ứng dụng laccase tinh hay laccase thô xử lý ô nhiễm môi trường cần phải nghiên cứu tổng thể chi tiết để xác định yếu tố mức độ ảnh hưởng để qua nâng cao hiệu ứng dụng chúng 3.2.3.3 Đặc tính hóa-lý laccase-like tinh Laccase-like tinh có hoạt tính cao pH 1, giảm nhanh hoạt tính gần khơng xác định pH Hoạt tính laccase-like tinh chủng XKBiR929 không giảm đun sôi thời gian tới Thậm chí, chưng cất thiết bị cất quay nhiệt độ 800C áp suất 0,8 atm, hoạt tính laccase-like chủng không thay đổi Như vậy, laccase-like tạo từ chủng XKBiR929 bền nhiệt Dựa kết nghiên cứu ảnh hưởng chất lên khả oxy hóa laccase-like, tính tốn giá trị động học với giá trị Vmax 142.857 µM/phút Km 0,43 µM Khi so sánh với giá trị động học laccase chủng nấm FBV40 thấy vận tốc phản ứng laccase-like thấp Lac1 (200.000 µM/phút) cao gấp khoảng 14 lần Lac2 (10.000 µM/phút) lấn laccase thơ (25.000 µM/phút) Với giá trị Vmax Km 16 vây cho thấy khả oxy cao laccase-like đặc biệt giá trị pH thấp Đây đặc tính đáng lưu ý hoạt chất mà luận án tìm thấy xạ khuẩn Chất ức chế hoạt tính laccase-like mạnh L-lys, nồng độ 10 mM hoạt tính laccase-like cịn lại 14%, tiếp đến EDTA hoạt tính cịn lại 66,7% SDS có ảnh hưởng với hoạt tính laccase-like cịn lại 83,6% Trong số cation kim loại thử nghiệm với hoạt tính laccase-like, cation Fe2+ gây ức chế hoạt tính mạnh tất nồng độ khảo sát So với ảnh hưởng ion kim loại laccase chủng FBV40 cho thấy đặc tính đặc biệt laccase-like từ chủng XKBiR929 Kết thu luận án liên quan đến đặc tính laccasee-like xạ khuẩn tạo ra, kết thu khảo sát đặc tính protein cho thấy đặc điểm bật laccase-like 3.3 Loại màu thuốc nhuộm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 3.3.1 Loại màu thuốc nhuộm laccase, laccase-like 3.3.1.1 Loại màu thuốc nhuộm tổng hợp laccase thô Laccase chủng FBV40 có khả cao loại màu gốc azo NY1 NY7 màu có gốc anthraquinon NY5 có mặt khơng có mặt chất gắn kết Kết kết khả loại màu NY1, NY5 NY7 nấm thuộc chi Rigidoporus phân lập từ rừng tự nhiên Việt Nam 3.3.1.2 Loại màu hoạt tính sử dụng quân đội laccase thô a) Khả loại màu số thuốc nhuộm hoạt tính Laccase thơ chủng FBV40 cho thấy khả loại màu hoạt tính thương mại sử dụng để nhuộm vài may quân 17 trang cho quân đội Khả loại màu tốt thuốc nhuộm MN.FBN 92,17% với thuốc nhuộm NN.SG 91,84% sau 3,5 h b) Lựa chọn thuốc nhuộm hoạt tính bị loại màu cao So sánh khả loại màu laccase thô chủng FBV40 với thuốc nhuộm MN.FBN cao đạt 92,67%, với thuốc nhuộm NN.SG 91,84% Tốc độ loại màu MN.FBN đạt 85% với thuốc nhuộm NN.SG đạt hiệu suất 17% sau 0,25 h Đặc biệt khơng có CGK laccase giảm hoạt tính 62,9% loại màu thuốc nhuộm MN.FBN 91,4% NN.SG sau 3,3 4h Chính thuốc nhuộm MN.FBN lựa chọn để nghiên cứu c) Khả loại màu thuốc nhuộm MN FBN laccase thô với có mặt D-glucose Sau 138 h, với nồng độ 50 mg/L thuốc nhuộm MN.FBN, laccase thô chủng FBV40 loại màu 99% 97,6% với có mặt 0,1g 0,05g D-glucose 3.3.1.3 Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN Lac1 Sau 24h, có mặt ViO 500 µM, Lac chủng FBV40 loại 91% màu thuốc nhuộm MN.FBN với nồng độ ban đầu 50 mg/L Kết rõ ràng cho thấy vai trò khả cụ thể laccase chủng FBV40 loại màu thuốc nhuộm nói chung màu hoạt tính thương mại Nhà máy X20/Tổng cục Hậu cần nói riêng 3.3.1.4 Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN laccaselike tinh Ở pH 1, laccase-like tinh chủng XKBiR929 có mặt chất gắn kết ViO loại 76,3% màu MN.FBN sau 18 23h, sau h laccase-like loại 75,8% với nồng độ thuốc nhuộm ban đầu 100 mg/L Khi sử dụng CGK khác HBT, khả loại màu sau 23h đạt 54,7% sau 5h đạt 54,0% Vai trò CGK ViO laccase-like chủng XKBiR929 loại màu thuốc nhuộm không lớn (chỉ tăng hiệu suất thêm 22%), với CGK HBT làm tăng hiệu suất loại màu không đáng kể Kết nghiên cứu mở hướng nghiên cứu ứng dụng laccase-like xử lý loại hợp chất hữu khác điều kiện pH thấp 3.3.2 Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính chủng FBV40 3.3.2.1 Khả loại màu số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để nhuộm vải may quân trang Chủng FBV40 có hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN cao 99% sau ngày nuôi cấy Đối với màu thuốc nhuộm MY.EG MY.BES hiệu suất loại màu thuốc nhuộm đạt thấp xác định từ đến 8% Quan sát thể nấm sinh trưởng dung dịch màu thuốc nhuộm MY.EG MY.BES thấy có hấp phụ màu lên thể nấm, ngược lại màu thuốc nhuộm MN.FBN không thấy hấp phụ Từ tượng nhận định chủng FBV40 loại màu thuốc nhuộm MN.FBN chế phân hủy, chuyển hóa 3.3.2.2 Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN nồng độ khác Sau đến ngày nuôi cấy chủng FBV40 loại màu thuốc nhuộm MN.FBN có nồng độ 100 mg/L đạt từ 52,7 % đến 97,3 %, nồng độ thuốc nhuộm 50 200 mg/L hiệu suất loại màu đạt tương ứng từ 49,8 % đến 94,3% 35,2 % đến 97,1 % Như vậy, chủng nấm FBV40 có khả loại màu cao mơi trường có nồng độ thuốc nhuộm 100 mg/l 19 3.3.2.3 Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN có mặt D-glucose Sau ngày, hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN FBV40 đạt cao từ 31 đến 97%, cịn mơi trường khơng có D-glucose hiệu suất đạt 8% Kết thu luận án với nghiên cứu tác giả giới, D-glucose nguồn carbon chất cảm ứng CGK thích hợp để q trình loại màu thuốc nhuộm MN.FBN chủng nấm FBV40 đạt hiệu cao 3.3.2.4 Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN có mặt loại đường khác Sử dụng loại đường làm nguồn carbon D-glucose đạt hiệu suất loại màu cao 96%, Lactose đạt 90%, Sacharose đạt 87%, Mannose 74%, mẫu không bổ sung loại đường đạt 28% sau ngày Kết nghiên cứu trình bày lần khẳng định chứng minh rõ ràng vai trò nguồn carbon phù hợp nói chung chứng minh vai trò D-glucose loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN chủng FBV40 3.3.2.5 Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN có mặt nguồn nitơ khác (NH4)2SO4 môi trường nuôi cấy chủng FBV40 cho hiệu suất loại màu thuốc nhuộm đạt 67%, KNO3 57% NH4NO3 54% sau ngày nuôi cấy so với mẫu đối chứng 29% Kết thu luận án cho thấy, nguồn nitơ vô có ảnh hưởng lớn tới khả loại màu chúng đóng vai trị quan trọng q trình sinh tổng hợp laccase chủng nấm 3.3.3 Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin laccase nấm sinh tổng hợp laccase 3.3.3.1 Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin laccase thô 20 a) Phân hủy dịch chiết đất Sau 13 ngày thí nghiệm khả phân hủy 2,4-D 2,4,5-T tương ứng đạt 65,46% 85,71% cơng thức thí nghiệm với có mặt đệm acetate CGK ViO b) Phân huỷ 2,4,5-T tinh khiết Sau 20 ngày, laccase thô chủng FBV40 cho khả phân hủy 2,4,5-T mức độ khác khoảng từ 40,55 đến 98,45% tương ứng với hàm lượng 2,4,5-T cịn lại mẫu sau thí nghiệm 1,401 mg đến 0,037 mg c) Phân huỷ 2,4-D 2,4,5-T có đất nhiễm Sau 27 ngày, 2,4-D có đất ô nhiễm bị phân hủy 49,5% 2,4,5-T bị phân hủy 37,71% với nồng độ ban đầu đất ô nhiễm cao tương ứng 556,92 981,88 ppm 3.3.3.2 Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin nấm sinh tổng hợp laccase a) Phân huỷ 2,4,5-T có đất nhiễm sân bay Biên Hịa Hàm lượng 2,4,5-T có đất cao đạt 473,5 mg/kg, sau ngày ni cấy chủng FBV40 phân hủy 7% tương ứng với 36 mg/kg, tính hiệu suất xử lý/ngày khối lượng thí nghiệm FBV40 xử lý 0,045mg 2,4,5-T/ngày b) Phân huỷ 2,4-D 2,4,5-T đất ô nhiễm sân bay Biên Hòa đơn chủng hỗn hợp chủng nấm Hiệu suất phân hủy đơn chủng FBV40 2,4-D, 2,4,5-T đất ô nhiễm sân bay Biên Hòa 11,44 12,13% sau 10 ngày xử lý với hàm lượng ban đầu 62,95 mg/kg 63,5 mg/kg Còn sử dụng hỗn hợp chủng FBV40, FBD154 FNBLa1 với tỷ lệ 1:1:1 theo thể tích hiệu suất phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T tăng lên đáng kể đạt 56,08 36,06% 21 c) Phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD đơn hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase Sau 10 ngày, đơn chủng hỗn hợp chủng có khả phân hủy 2,3,7,8-TCDD với hiệu suất 44.68% độ độc ban đầu 2.000 ng-TEQ/L hỗn hợp chủng có tiềm cao với hiệu suất 92,89% sau 10 ngày nuôi cấy KẾT LUẬN Đã lựa chọn chủng FBV40 từ 22 chủng phân lập từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì, Hà Nội với hoạt tính laccase thơ cao 107.708U/l môi trường TSH1 sau ngày nuôi cấy Chủng FBV40 phân loại thuộc chi Rigidoporus tên Rigidoporus sp FBV40 Đã phân lập, phân loại hai chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces với tên Streptomyces sp XKBHN1 Streptomyces sp XKBiR929 sinh tổng hợp laccaselike môi trường chứa PAHs, 2,4-D, 2,4,5-T DCĐ Đã tinh xác định đặc tính laccase chủng FBV40 gồm isozyme Lac1 Lac2 có khối lượng phân tử 55 kDa 60 kDa, chúng có đặc tính riêng khác Sau 24h phản ứng, Lac1 loại 91% màu thuốc nhuộm thương mại MN.FBN nồng độ 50 mg/L Laccase-like tinh từ Streptomyces sp XKBiR929 bền nhiệt 1000C, vịng h hoạt tính khơng thay đổi; bị ảnh hưởng chất ức chế protein L-lys, EDTA, SDS khác so với laccase thật; loại 76% màu thuốc nhuộm MN.FBN nồng độ ban đầu 50 mg/L môi trường pH có mặt chất gắn kết ViO sau h Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp laccase thô FBV40 nồng độ 100 mg/L 82% sau 2,5h, 85% sau 4h 22 thuốc nhuộm tổng hợp azo NY1, NY7 70% sau 48h thuốc nhuộm anthraquinone NY5 Có mối quan hệ tỷ nghịch lệ mức độ giảm hoạt tính laccase với nồng độ chất gắn kết trình loại màu thuốc nhuộm tổng hợp Sau 138 h với có mặt 0,1g D-glucose, laccase thơ từ Rigidoporus sp FBV40 loại 99% màu thuốc nhuộm MN.FBN khơng có mặt D-glucose loại 44% Sau ngày nuối cấy Rigidoporus sp FBV40 môi trường chứa 100 mg/L thuốc nhuộm MN.FBN 0,5g D-glucose 97,2% màu bị loại Laccase thô FBV40 phân hủy 40,55 đến 98,45% 2,4,5-T tinh khiết công thức thí nghiệm với hàm lượng 2,5 mg Khi hàm lượng 2,4-D, 2,4,5-T lên tới 556,92 mg/kg 981,89 mg/kg, sau 27 ngày, laccase thô phân hủy 49,5 37,7% Sau đến 10 ngày nuôi cấy chủng Rigidoporus sp FBV40 phân hủy 11,44% (7,2 mg/kg) chất diệt cỏ 2,4-D với hàm lượng ban đầu 62,95 mg/kg 12,13% (7,7 mg/kg) 2,4,5-T với hàm lượng ban đầu 63,5 mg/kg Hỗn hợp nấm đảm nấm sợi FBV40, FBD154 FNBLa1 phân hủy 56,07% (35,29 mg/kg) 2,4-D 36,06% (22,89 mg/kg) 2,4,5-T Sau ngày nuôi cấy chủng FBV40 phân hủy 44,7% đồng loại 2,3,7,8-TCDD với độ độc ban đầu 2000 ng-TEQ/L, hỗn hợp chủng nấm đảm FBV40, FBD154 nấm sợi FNBLa1 phân hủy 92,9% Kiến nghị: Tiếp tục nghiên cứu phát triển khả laccase, laccaselike thân chủng vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccaselike để bước sáng tạo hồn thiện cơng nghệ xử lý 23 chất nhiễm hữu khó phân hủy nói chung chất diệt cỏ chứa dioxin nói riêng góp phần vào hồn thành chương trình Khắc phục hậu chất độc hóa học tồn lưu sau chiến tranh Việt Nam xử lý ô nhiễm bảo vệ mội trường NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Cơng trình nghiên cứu đặc tính laccase-like sinh tổng hợp chủng xạ khuẩn Streptomyces sp XKBiR929 khả laccase-like loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại MN.FBN; Chứng minh nấm đảm Rigidoporus sp FBV40 có hoạt tính laccase thơ lên tới 107.708 U/L tiềm cao loại màu thuốc nhuộm gốc azo, anthraquinone sử dụng quân đội; Khẳng định nấm đảm Rigidoporus sp FBV40 đồng thời có khả phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T đồng loại độc dioxin 2,3,7,8-TCDD Bên cạnh đó, làm sáng tỏ khẳng định hỗn hợp loài nấm khác (nấm đảm nấm sợi) có khả sinh tổng hợp laccase phân lập từ thiên nhiên Việt Nam không phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T mà phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD đạt hiệu suất cao sử dụng đơn chủng DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ Phùng Khắc Huy Chú, Đào Thị Ngọc Ánh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà, Phân lập, phân loại khảo sát khả sinh tổng hợp laccase-like số chủng xạ khuẩn từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai.Tạp chí Khoa học đại học Huế, (2015),110(11):29-41; 24 Phung Khac Huy Chu, Nguyen Hai Van, Dang Thi Cam Ha, Purification and characterization of laccase involved in the decolourization of synthetic dyes and 2,3,7,8-TCDD congener degradation by the white rot fungus isolated from bavi forest of Vietnam, Vietnam Journal of Science and Technology, (2017), 55 (4C), 180-185; Phùng Khắc Huy Chú, Đào Thị Ngọc Ánh, Đặng Thị Cẩm Hà, Nấm đảm sinh tổng hợp laccase có khả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để nhuộm vải may quân trang, Tạp chí Khoa học Công nghệ quân sự, (2017), 52:169-179 ... tên ? ?Nghiên cứu khả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính phân hủy chất diệt cỏ/ dioxin vi sinh vật sinh enzyme laccase? ?? tiến hành 2 Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn vi sinh vật có khả sinh laccase, laccaselike... thu khảo sát đặc tính protein cho thấy đặc điểm bật laccase- like 3.3 Loại màu thuốc nhuộm phân hủy chất diệt cỏ/ dioxin 3.3.1 Loại màu thuốc nhuộm laccase, laccase- like 3.3.1.1 Loại màu thuốc nhuộm. .. nhiên Vi? ??t Nam 3.3.1.2 Loại màu hoạt tính sử dụng qn đội laccase thơ a) Khả loại màu số thuốc nhuộm hoạt tính Laccase thơ chủng FBV40 cho thấy khả loại màu hoạt tính thương mại sử dụng để nhuộm vài