Luận Án Tiến Sĩ Đóng Góp Vào Việc Nghiên Cứu Hoá Học Một Số Cây Thuốc Chi EUPATORIUM (Họ Cúc) Ở Việt Nam

MỤC LỤC Trang Mỏ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ í PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Họ Cúc chi E upatorium 1.1.1 Vàì nét thực vật học hoá học họ Cức 1.1.2 Vài nét thực vật học hoá họơ chi Eupatorium 1.2 1.3 Đại cương hợp chất cumarin 10 Vài nét hợp chất thymol 18 1.4 Đại cương hợp chất flavonoit 20 1.5 Vài nét phương pháp sắc ký sử dụng nghiên cưủ 27 1.5.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 27 1-5.2 Phương pháp sác ký cột sắc ký cột nhanh 28 1.5.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao âp 34 PHẦN 2: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 2.1 Cây Mần tưới tía 37 2.1.1 Vài nét chung Mần tưới tía * 37 2.1.2 Tác dụng sinh học Mần tưới tía 38 2.1.3 38 Các hợp chất phát Mần tưới tía 2.1.4 N ghiẻn cúm dản xuất cumarin thymoquinon Mần tưới tía Việt Nam 2.2 40 Cây Mần tưới tráng 47 2.2.1 Vài nét chung Mần tưới trắng 48 2.2.2, Tác dụng sinh học Mần tưới trắng 48 2.2.3, Các nghiên cứu thành phần hoá học Mầntưới trắng 49 2.2.4 Nghiên cứu dẫn xuất axetophenon thymol Mần tưới trắng Việt Nam 49 2.3 60 Cây Cỏ lào 2.3.1 Vài nét chung Cỏ lào ỐI 2.3.2 Tác dụng sinh học cày c ỏ lào 61 2.3.3 Các nghiên cứu thành phần hoá học c ỏ lào 61 2.3.4 Nghiên cứu dẫn xuất ĩlaconoit c ỏ lào Việt Nam 62 PH ẨN 3: T H Ự C NGHIỆM 66 3.1 Các phương pháp tách sắc ký 66 3.1.1 Phương pháp sắ c k ý lớp mỏng 66 3.1.2 Phương pháp sác ký cột sác ký cột nhanh 67 3.1.3 Phương pháp sác ký lỏng cao áp 68 3.2 70 Các phương pháp phân tích chấttinh khiết 3.2.1 Phổ hồng ngoại 70 3.2.2 Phổ tử ngoại 70 3.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhủn proton 70 Phổ công hưởng từ hạt nhân 71 3.2.5 Phổ khối lượng 71 3.2.6 Một sô' phản ứng dịnh tính 72 3.2.7 Điểm chảy 72 3.3 72 Chuẩn bị mẫu 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.3.2 Địa điểm lấy mẫu 72 , 73 3.3.3 Tời điểm thu hái 3.3.4 Xử lý sơ 73 * 73 3.4 Chiết nguyên liệu 73 3.5 Cây Mần tưới tía 74 3.5.1 Xử lý dịch chiết cloroform 74 3-5.2 Tách ayapanin s 75 3.5.3 Tách ayapin 78 3.5.4 Tách thymoquinon 78 3.5.5 Tách thymoquinol dim etylete, m etylthym ylete 1-nitronaphthalen 80 t 3.6 Cây Mần tưới trắng 82 3.6.1 Xử lý dịch chiết cloroíorm 82 3.6.2 Tách cumarin 83 3.6.3 Tách ayapin 83 3.6.4 Tách axetophenon 84 3.6.5 Tách 8,10-epoxi-9-axetoxi-thym ol angelat 85 MỞ ĐẦ U VÀ ĐẶT VẤN ĐỂ H ỏa học hợp chất tự nhiên nói chung hợp chất cố hoạt tính sinh học nói riêng ngày thu hút ý nhiều nhà khoa học ứng dụng võ q giá linh vực y học, nơng nghiệp, cơng nghiệp Các cơng trình nghiên cứu điều tra thuốc Việt Nam cho thấy số lượng loại dùng làm thuốc lên tới 1850 loài, phân bố 244 họ thực vật [lb] Đã có chương trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật cấp nhà nước tiến hành 10 năm là: "Tạo nguồn nguyẽn liệu từ củy thuốc eho công nghiệp dược" Các tài liệu cho thấy 1/4 số thuốc lưu hành Mỹ có hoạt chất nguổn gốc từ thảo mộc [2] Trong hệ thực vật Việt Nam, họ Cúc ( Cornpositae ) phong phú, đa dạng măt chủng loại chiếm phần đáng kể toàn thảm thực vạt, đối tượng nhiều người quan tâm Trong cay họ Cúc cố tới 100 loài dùng làm thuốc chữa bệnh dạng ch ế phẩm thô sơ thuốc sắc, rượu thuốc, cao [7] Dùng nước để sắc thuốc chữa bệnh phương thức đơn giản phổ biến dân gian Bởi vạy, thành phần tan nước củc loại cay thuốc chắn tiểm ẩn phong phú chất có hoạt tính sinh học mà cơng trình nghiên cứu đối tượng trẻn giới nước cịn ỏi Trong chi Eupatorium (họ Cúc) phát ba cây: Mần tưới tía ( Eupatoriurn ayapana Vent.) Mần tưới tráng (.Eupatorium stoechadosm um Hance) cỗ lào {Eupatorỉum odoratum L.) Các trổng vườn thuốc m ọc m ọt số vùng đổi núi Việt Nam, Nhan đủn sử dụng chúng làm thuốc chữa bệnh đôi nơi đùng để diệt trùng [7] Xuất phát từ tình hình thực tiễn tầm quan trọng hợp chất tự nhiên nói chung hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng, đề tài luận án có tiêu để: "Đóng góp vào việc nghiên cứu hoá học số thuốc chi E u p a to riu m (họ Cức) Việt Nam" nhằm giải mục tiêu sau: - Xảc định thành phần tan nước Mần tưới tía cE ayapana Vent.), Mần tưới trắng (E stoechadosm um Hance) c ỏ lào (E odoratum L.) Phân lập chất tinh khiết có thành phán - Xác định cấu trúc hoạt tính chất phân lập - Đóng góp vào việc nghiên cửu tổng hợp chất cố hoạt tính sinh học Cũng đóng góp vào việc phân loại thực vật, vấn để nhiều nhà khoa học quan tâm PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 HỌ CỨC VÀ CHI EUPATORIUM 1.1.1 Vài nét thực vật học hoá học họ Cúc Họ Cúc {C om positae hay Asteraceae) họ lớn ngành thực vật hạt kín Đó họ quan trọng hệ thực vật giới hệ thực vật Việt Nam Theo M.E.BCirpiczniJtov (1981), họ Cúc có khoảng 1150-1300 chi với 20000 lồi, phan bố rộng rãi trơn tồn giới, vùng khí hạu Á nhiệt đới ôn đới Họ Cúc Việt Nam có phủn họ, 13 tơng, 114 chi 336 lồi [2] Trong 336 lồi 161 iồi biết giá trị kinh tế, chiếm gần 50% số loài: thuốc 96 loài, cảnh 28 loài, củy làm rau ăn 30 loài, củy cho tinh dẩu dầu béo 12 loài, làm phủn xanh loài, củy có tác dụng trừ sâu diệt cổn trùng lồi Các củy họ thường thuộc thảo, cay to, rẽ củy thường phổng lên thành củ, đơn thường mọc so le, mọc đối, có thành hình hoa thị, khơng có kèm Phiến nguyên, thường khía hay chia thuỳ Cụm hoa: đầu gổm nhiểu hoa mọc kẽ vảy bao bọc tổng bao bắc - Hoa đếu, hình ống hay khơng đều, hình lưỡi nhỏ Năm cánh hoa liển thành tràng hình ống hay hìnH lưỡi nhỏ Năm nhị dính liền bao phấn thành ống Hai ná nỗn, bầu hạ ổ đựng ruột nỗn vịi dài, đáu nhụỵ xẻ đơi, có lơng thu Một số có ống nhựa mủ, số lồi khác có ống tiết Chất dự trữ củ inulin [3] F.Bohlman cộng tác viôn [17] phủn iộp từ họ Cúc 2500 hợp chất xác định cấu trúc chúng Trong công việc nầy, ỏng nghièn cứu loài thực vạt thuộc họ Cúc có chau Âu, Trung Nam Mỹ vùng Nam Phi sử dụng phương pháp phan lap hiẻn đại kết hợp với phương pháp khảo sát phổ, người ta xác định cấu trúc thùnh phán chủ yếu lấy từ 50-200g nguyên liệu thực vật, hàm ỉượng chúng chiếm 0,001% Đặc trưng cho họ Cúc hợp chất : sesquitecpen, sesquitecpen lacton, cumarin, ancaloit 1.1.2 Vài nét thực vật học hố học chi Euporium (tơng Eupatoriae họ Cúc) Các họ Cúc chia làm 13 tông Trong tông chia thành nhiều chi chi lại gổm nhiểu lồi khác Có tồng gổm nhiều chi tơng H elianthae, có 23 chi ngược lại có tơng gồm số chi tơng Eupatoriae, có chi [2], Cụ thể chi tông Eupatoriae phủn biệt sau: - Chi Aảenostemma Forst - Cúc dính gồm loài m ọc ven rừng ẩm, vùng núi thấp - Chi Agératum L - c ỏ hôi gồm loài, m ọc phổ biến từ đến miển núi - Chi Eupatorium L - Mẩn tưới gồm loài, m ọc từ đồng đến núi cao - Chi M ika n ia Willd - Cúc leo có lồi, gặp ven rừng vùng núi thấp Tổng E u patoriae tổng cộng có 15 lồi, có lồi thuộc chi Eupatorium Lồi: Mán tưới tía (Eupatorium ayapana Vent.), Mán tưới trắng (Eupatorìttm stoechadosm um Hance) c ỏ lào (E upatorium odoratum L.) thu hái địa phạn Hà Nội Hai loài khác phát tỉnh phía bdc như: E upatorium chinensis L Hữu lũng, Lạng Sơn, Lạng Giang, Hà Bác Eupatorium L inđleyanum Bl Hữu Lũng, Lạng Sơn, Hà Trung, Thanh Hóa địa phận Ninh Bỉnh Các thuộc chi E upatorìum phan bơ' rải rác chùu Âu, Bắc Phi, châu Á Vào năm 30, 40 loài lan rộng vùng ồn đới chùu Á, châu Âu song tạp trung chủ-yếu vùng nhiệt đới châu Mỹ [21 ] Theo Dodomaeus xuất xứ tên Eupatorium íà H epatorium (h epar tiếng la tinh gan) hoạt tính hữu ích lồi thực vật chữa bệnh vể gan [22] Nhiều loài thực vạt chi sử dụng để chữa bệnh gan, lách, chống khối u, làm liền vết thương, làm thuốc lợi tiểu, hạ sốt nhiều ứng dụng khác [52] Các nhóm chất tạp trung chủ yếu p-hydroxiaxetophenon, dãn xuất thymol flavon [18] N gồi kể thêm loạt sesquitecpen lacton, chủ yếu germacrolid, số sesquitecpen vài trường hợp có ditecpen Những kết qủa nghiơn cứu gán đay có phân biệt hai nhóm chất: Một nhóm sesquitecpen lacton hai nhóm p-hydroxiaxetophenon dản xuất thymol E upatorium m ohrii đại diện cho nhóm 1, tách từ phàn rễ hai dãn xuất nerolidol ( hình 1) OH u :o : R=■CH,OH, R1 = CH,OH R = CHjOAc, R' = CHịOAc : R =s R' = CHO : R = C H j O H , R ‘ = CHO : R - R* - H 10: R = R' = Ae 11: k = Acv R l = H 21: R = H 22: R - Ac 24 23 25 R1 H OH OH R1 H Ac H RJ Ang* Ang* Tigl.* R‘ R 28 H H Tigl 29 H Ac Tigl 30(10) (10-epi) OH Ac Ang Ang = COC(M e) = CH M e(cií); Tigl = trans; iBii = C O C H (M c): ; MeBũ = CO C H (M e) H ình 1: C ác chất phát chi EupatorĨLim R 10 33 : R - K 35 : R = O M e 34 : R = o H 36: R — ỴBÜ (11) OH - y y 45 44 V ' ^ O ^ C «H j H R2 H R3 H H H H HH H O CO Ph OM c H OTigl ' 47(14) 48 49(15) R1 H H H R2 HOAng O M ebû RJ H H H HeO ' X X H „ o y C p ’' - Y S 50(12) OH H OH R' R! RJ 0' 54(17) 55(17) 56Í1S) 57(19) 58(2) OH «O M c H H H H H O M e OM e H H H H OH H 53(16) USAS 2.55 dd " Ú = 8.2) H 59(17) 6.97_ 61 151 OH ^ v 0y ° R C H ^C ^ C jjC H ^C H j 65 : R = H (23) 66: R = o Ac v 64(22) Me[C=C]j [CH=CH]j (CHj)3OAc 67(23) H ình : Các chất phát chi Eupatorium (tiếp theo) 87 ^H-NMR (CDCI3, 250 MHz): = 6.90 (ỴH , d, J = 8.0 Hz, H -5); 6.69 (1H, i, H-2); 6.64 (IH , d, J = 8.0 Hz, H-6); 4.52 4.42 ( 2H, dạng AB, J = 12 Hz, H-9); i.85 3.77 (2H, dạng AB, J = 11.8 Hz, H - 10); 2.25 (1H, septet, J = Hz, :H (C H 3) 2; 2.26 (3H, s, H -7); 1.12 ( 6H, d, J = Hz, CH(CH3 )2) 13c - NMR (CDCI 3, 50 MHz): Bảng 13 Ký hiệu c s (X) Ỗ(1X) [ppm] [ppm] c- 139.84 140.0 C- ■ 128.95 126.19 c -3 126.10 156.70 C -4 110.07 119.54 c -5 126.83 124.49 c- 123.20 118.71 c -7 21.16 20.96 c- 65.70 79.10 C -9 56.72 67.47 c - 10 51.05 66.04 c - l l / c - 13 170.32 c - 11 126.88 c - 12/C - 17 20.63 c - 12 140.41 c - 14 126.71 C(ÇH3) 20.45 c - 15 141.40 CH(Œ3) 15.90 c - 16 15.94 -c = 168.77 -c = 178.20 B ảng 13: I 3C-NMR của(IX) (X) 88 EIMS m /z (% ): 268 (M + 28); 237 (M+ - CHoOH, 73) 167 (237- OCC(CH ) ); 71 (CH ) CHCO+, 0 ); 43 (CH 3)2 CH+, 90) ” (X ) chứng minh - angeloyloxi - 8.10 - dihydroxi - thym ol với số liệu sau: \.a 1d = (C = 0.185, metanol) IR (CHCI 3): 3610, 3400, 2920, 2815, 1700 cm -1 ^ - N M R (CDCl3t 250 MHz): = 6.94 (1H, d, J = 7.9 Hz, H - 5); 6.71 (1H, s, H-2); 6.65 (1H, d, J = 7.9 Hz, H- 6); 6.17 (1H, qq, ỉ = 6.0 Hz 1,3 Hz, H-15); 4.61 4.51 (2H , dạng AB, J = 12.1 Hz, H-9); 3.85 (2H, m , H-10); 2,27 (3H, s, H7); 1,97 (3H , dq, J = 6.0 1.3 Hz, H-16); 1.86 (3H, m, H -17) 13C-NMR (CDCI , 50 MHz): Bảng 13 EIMS m /z (%): 281 (M ++1, 6); 249 (M+ - CH 2OH, 31); 167 (249-(C H 3) (CH 3CH)C-CO, 34); 83(C4 H7CO+, 100); 55(C 4H7+, 29) 3.7 C  Y C Ỏ LÀO 3.7.1 X iý dịch ch iết cloroform Từ kg mẫu tươi thu 877.4m g CCT sắc ký đổ cặn chiết từ c ỏ lào trước chạy cột hệ dung m CHCl3/EtỐc 9/1 (Hình 45) H ình 45: SKLM cặn chiết thô CL 89 Thực tách SKC hệ dung môi thu phân đoạn chính: Phân đoạn 1-9, phân đoạn 13-15 phân đoạn 22-34 tương ứng với vệt cố giá trị R f sau: vệt 1, R f = 0.71; vệt 2, R f = 0.61; vệt 3, R f = 0.40 sắc ký đồ sau chạy cột 1, & hệ dung m ổi CHCl3/EtOAc 7/3 (Hinh 46) 1-9 13-15 cột 22-34 35-50 —— - • " P —ssra Hình 46: SKLM sau chạy cột Nhìn SKLM ta nhận thấy vệt phân đoạn 1-9 có giá trị R f lớn, chứng tỏ chúng làm hệ dung m ồi phân cực Đ ối với phân đoạn 13-15, giảm độ phân cực dung m ôi rửa giải để thực việc phân lập chất Từ phân đoạn 22 trở sau, chưa thấy rõ khả tách chất hệ dung m ôi 3.7.2 Tách chalcon Nhin SKLM ta nhận thấy phân đoạn 13-15 chất xuất đậm lớn chứng tỏ hàm lượng tương đối cao có vệt cách xa hẳn vệt khác nên chọn phân đoạn để nghiên cứu trước Chất tiến hành tách cột hệ dung m ôi CHCl3/EtOAc 8/2 Sắc ký đồ phân đoạn chạy cột sau (Hình47) 90 1-5 9-14 18-29 30- cuối o > H ình 47: sắc ký đồ sau chạy cột Các vệt chất phát đèn tử ngoại phương pháp hấp phụ iot Giá trị R f sau: 0.72 (5.32 mg); 0.70; 0.64 (17.9m g); 0.64 (7 mg); 0.35 (5 m g) Ở phận đoạn 9-14, sau cho bay hòa lại mẫu CHCI3, để qua đêm tủ lạnh, xuất tinh thể Kết tinh phần tinh thể EtOAc/P.E thu 2.8 mg tinh thể hình kim, màu vàng, tnc = 142 - 144°c, ký hiệu (XII) Các phản ứng khảo sát khung flavonoit: - Phản ứng với HC1 đặc, Mg bột, mơi trường cồn: Dùng thìa kim loại lấy vài tinh thể (X II) hòa tan lượng tối thiểu hỗn hợp dung m ôi CHCl3/EtOAe 8/ Dung dịch có màu vàng Nhỏ 2-3 giọt HC1 đặc cho vài mảnh Mg vào dung dịch, nhỏ thêm 2-3 giọt cồn Lắc ống nghiệm, ta nhận thấy dung dịch từ màu vàng chuyển sang màu đỏ sẫm - Phản ứng với NaOH viên: Hòa NaOH viên nước cất Cho vài tinh thể (X II) vào dung dịch'thấy xuất màu đỏ - Phản ứng với FeCỈ3 Hòa tan (XII) CHCl3/EtOAc 8/2, nhỏ vài giọt FeCỈ3 vào, dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu nâu - Các kết qủa đo phổ iH -N M R khối phổ khảng định (X II) 2’, dihydroxi - 4', 5', 6’ trimetoxi chalcon, với số liệu cụ thể sau: iH -N M R (CDCI 3, 300 MHz): s = 3.84 (3H, s, OCH 3) 3.90 (3H, s, OCH ); 3.93 (3H, s, OCH 3); 7.84 (2H, s, H - a H-ß); 6.30 ( H, s, H-3'); 6.87 (2H, d J = 8.6 Hz, H-3 H-5); 7.57 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2 H- 6); 13.76 (1H, s, OH) MS: Cria trị tính: 330.1102; giá trị tìm: 330.40 (100%) 91 pic theo m /z (%): 210 (C l 0H 10O5 , 93.46) 195 (C 9H7O , 75.62); 167 (C 8H 70 4i 27.05); 91 (C 7H 7, 11.21) 3.7.3 T ách chalcon S KLM phân đoạn 1-9 cột cho thấy phân đoạn tổn vệt chất Sau bay dung mồi để qua đêm tủ lạnh thu mẫu đặc mầu vàng Thực SKC nhanK cho phân đoạn hệ dung môi P.E/EtOAc 7/3, ký hiệu cột Kết qủa tách sắc ký cột sau: Fr 9-10; R f = 0.78 (11.2 mg); Fr 18-22: R f = 0.43 ( 2.3 mg); Fr 28-35: R f = 0.22 (0.2 mg) Phân đoạn 9-10 sau cho bay dung m ô i cộ dạng dung dịch sệt, màu vàng, ký hiệu L2 Phân đoạn 18-22 tinh thể màu vàng cam, ký hiệu (X I) Kết qủa phân tích ^H-NMR L2 khơng thể pic cụ thể, sắc đồ có dạng l polim e (X I) thể chất sạch, tnc = 136.5 - 137.5 (EtOAc/P.E); tnc [41] = 142 - 144°c Các kết qủa phổ khẳng định (XI) odorátin, giá trị cụ thể sau: iH -N M R (CDCI 3, 300 MHz): = 3.84 (3H, s, OCH 3); 3.86 (3H, s, OCH ); 3.90 (3H, s, OCH ); 3.93 (3H, s, OCH 3); 7.85 (2H, s, H - a H -ß y , 6.30 ( H, s, H -3’); 6.94 (2H, d, J = 8.7 Hz, H - H- 5); 7.61 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2 H- 6); 13.78 (1H, s, OH) MS: pic theo m/z: 210 (C ịo H io C ^ )’ 195 (C 9H 7O 5); 167 (C 8H 7O 4); 91 (C 7H 7) 3.7.4 Tách flavan on Trong kết qủa sắc ký cột 1, có phân đoạn từ 22 trở cuối cần khảo sát hệ dung m ôi tách chất Chúng chọn hệ dung mồi CHCl3/EtOAc 6/4 để thực tách SKC nhanh cho phân đoạn này, ký hiệu cột SKLM sau tậch cột có dạng hình 48 92 5-8 ^ 12-17 cột 20-24 Hình48: sắc ký đồ sau chạy cột Các đặc điểm cụ thể sắc ký trình bày bảng 14 H iện bẳng Anh sáng ngoại tử Ẫ = 254 run Ả = 365 nm Hấp phụ iot Fr 20-24 vệt nâu vệt Frl2-17 vệt nâu vệt mờ vệt nâu vệt nâu vàng vêt vàng vệt 0.77; 0.65 0.75; 0.65; 0.54 0.67; 0.57 1 Fr 5-8 vệt mờ vệt tím vệt nâu vệt vệt nâu vàng vàng vệt Rf Bảng 14: Sắc ký đồ chiết sau chạy cột Phân đoạn 5-8 gần lượng vết, phần khảo sát 3.7.3 Phân đoạn 12-17 có vệt hấp phụ Ỉ2, thể hàm lượng tương đối lớn nẽn chủng tổi lấy phân đoạn để tiếp tục khảo sát cột Cột tiến hành hệ dung m ôi CộHộ/EtOAc 7/3 theo SKC thông thường Sắc ký đổ phân đoạn sau chạy cột thể hình 49 5-18 ^ cột 19-37 38-53 o