Luận Án Tiến Sĩ Nghiên Cứu Điều Kiện Thu Nhận, Xác Định Tính Chất Và Thành Phần Monosaccharide Của Exopolysaccharide

FF ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN BẢO KHÁNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THU NHẬN, XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT VÀ THÀNH PHẦN MONOSACCHARIDE CỦA EXOPOLYSACCHARIDE TỪ MỘT SỐ CHỦNG THUỘC LOÀI Lactobacillus plantarum LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NĂM 2019 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN BẢO KHÁNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THU NHẬN, XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT VÀ THÀNH PHẦN MONOSACCHARIDE CỦA EXOPOLYSACCHARIDE TỪ MỘT SỐ CHỦNG THUỘC LOÀI Lactobacillus plantarum Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đỗ Thị Bích Thủy NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng Các số liệu sử dụng phân tích luận án có nguồn gốc rõ ràng, công bố theo quy định Các kết nghiên cứu luận án tơi tự tìm hiểu, phân tích cách trung thực, khách quan phù hợp với thực tiễn Việt Nam Các kết chưa công bố nghiên cứu khác Nghiên cứu sinh Trần Bảo Khánh i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT C: Carbon Cfu/mL: Colony-forming unit/mL (số lượng tế bào/mL) CDM: Chemical Defined Media EPS: Exopolysaccharide EPS-N5: Exopolysaccharide từ L plantarum N5 EPS-T10: Exopolysaccharide từ L plantarum T10 EPS-W1: Exopolysaccharide từ L plantarum W1 EPS-W12: Exopolysaccharide từ L plantarum W12 EPS-W5: Exopolysaccharide từ L plantarum W5 EtOH: Ethanol FDA Food and Drug Administration (Cục Quản lý Thực phẩm Thuốc) Fruc: Fructose Fruc-6-P: Fruc-6-phosphate FTF: Fructosyltransferase Gal: Galtose Gal-1-P: Galtose -1-phosphate GC-MS: Gas Chromatography Mass Spectometry (Sắc ký khí ghép nối khối phổ) GDP: Guanosine diphosphate Glc: Glucose Glc-1-P: Glucose -1-phosphate Glc-6-P: Glucose -6-phosphate GlcA: Glucuronic acid GPC: Gel Permeation Chromatography (sắc ký thẩm thấu gel) GRAS: Generally Recognized as Safe (Chứng nhận tuyệt đối an toàn) GTF: Glycosyltransferase HePS: Heteropolysaccharide HoPS: Homopolysaccharide HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence HPLC: High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu ii cao) HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation L.: Lactobacillus LAB: Lactic Acid Bacteria Lac: Lactose Man: Mannose Man-1-P: Mannose-1-phosphate Man-6-P: Mannose-6-Phosphate Mw Molecular weight (Khối lượng phân tử) MRS: Man, Rogosa and Sharpe N: Nitrogen NMR: Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy P.: Pediococcus PEP-PTS: Phosphoenolpyruvate – phosphotransferase PGM: Phosphoglucomutase PS: Polysaccharide Rha: Rha S.: Streptococcus Sac: Saccharose SDM: Semi-sefined medium (môi trường bán xác định) TCA: Trichloroacetic Acid TDP: Tyrosine diphosphate UDP: Uridine diphosphate WHC: Water Holding Capacity (khả giữ nước) iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU Chương 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan vi khuẩn lactic 1.1.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 1.1.2 Khái niệm exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 1.1.3 Cấu trúc phân loại exopolysaccharide 1.1.4 Sinh tổng hợp exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 12 1.2 Tình hình nghiên cứu exopolysaccharide vi khuẩn lactic 18 1.2.1 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp exopolysaccharide 19 1.2.2 nuôi cấy Điều kiện tách chiết tinh chế exopolysaccharide từ môi trường 23 1.2.3 Đặc tính sinh lý chức công nghệ exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 24 1.2.4 Cấu trúc exopolysaccharide 28 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Đối tượng nghiên cứu 42 2.2 Hóa chất 42 2.2.1 Các hóa chất sử dụng ni cấy vi khuẩn 42 2.2.2 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm exopolysaccharide 42 2.3 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 42 Các phương pháp vi sinh 42 2.3.2 Xác định hàm lượng exopolysaccharide phương pháp phenol – sulfuric acid 43 2.3.3 Xác định hàm lượng N tổng số phương pháp Kjeldahl 43 2.3.4 Phương pháp tách chiết exopolysaccharide từ dịch nuôi cấy L plantarum 43 2.3.5 Xác định khả hòa tan nước chế phẩm exopolysaccharide 44 iv 2.3.6 Phương pháp khảo sát khả giữ nước giữ dầu chế phẩm exopolysaccharide 44 2.3.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa exopolysaccharide sinh tổng hợp chủng L plantarum nghiên cứu 45 2.3.8 Xác định thành phần đường mối liên kết phân tử exopolysaccharide phương pháp GC-MS NMR 46 2.3.9 Xác định khối lượng phân tử exopolysaccharide phương pháp sắc ký thẩm thấu gel 47 2.3.10 Các phương pháp khảo sát khả ứng dụng L plantarum 47 2.3.11 Sơ đồ thực nội dung nghiên cứu 48 2.3.12 Bố trí thí nghiệm nội dung nghiên cứu 49 2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu 51 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52 3.1 Khảo sát khả sinh tổng hợp exopolysaccharide số chủng L plantarum phân lập từ thực phẩm truyền thống 52 3.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp exopolysaccharide chủng L plantarum tuyển chọn 53 3.2.1 Nguồn carbon 54 3.2.2 Nguồn nitrogen 57 3.2.3 Mật độ tế bào gieo cấy ban đầu 60 3.2.4 pH ban đầu môi trường 61 3.2.5 Nhiệt độ nuôi cấy 63 3.2.6 Thời gian nuôi cấy 65 3.3 Ảnh hưởng điều kiện tách chiết đến khả thu nhận exopolysaccharide từ dịch lên men chủng L plantarum tuyển chọn 67 3.3.1 Nồng độ TCA 68 3.3.2 Hàm lượng ethanol tuyệt đối 70 3.3.3 Thời gian kết tủa 71 3.4 Một số tính chất exopolysaccharide từ chủng L plantarum tuyển chọn 72 3.4.1 Khả hòa tan nước 73 3.4.2 Khả giữ nước, giữ dầu 75 3.4.3 Khả chống oxy hóa 78 3.5 Xác định phần cấu trúc phân tử exopolysaccharide sinh tổng hợp chủng L plantarum W1 80 v 3.5.1 Khối lượng phân tử exopolysaccharide sinh tổng hợp L plantarum W1 81 3.5.2 Thành phần monosaccharide exopolysaccharide sinh tổng hợp L plantarum W1 82 3.6 Khảo sát khả đồng tạo gel sữa đậu nành lên men chủng L plantarum tuyển chọn 94 3.6.1 Ảnh hưởng thời gian lên men đến trạng thái gel sữa đậu nành lên men 94 3.6.2 Khả giữ nước gel sữa đậu nành lên men 96 3.6.3 Độ nhớt sữa đậu nành lên men 97 KẾT LUẬN 101 KIẾN NGHỊ 102 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CĨ LIÊN QUAN ĐÃ CƠNG BỐ 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Đặc điểm EPS từ L plantarum 36 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nguồn C đến khả sinh tổng hợp EPS chủng L plantarum tuyển chọn 55 Bảng 3.2 Hiệu suất thu nhận EPS cao dịch nuôi cấy có bổ sung nguồn C chủng L plantarum tuyển chọn 57 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nguồn N đến khả sinh tổng hợp EPS chủng L plantarum tuyển chọn 58 Bảng 3.4 Hiệu suất thu nhận EPS cao dịch ni cấy có bổ sung nguồn N chủng L plantarum tuyển chọn 60 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng ethanol tuyệt đối đến khả thu nhận EPS từ dịch lên men chủng L plantarum tuyển chọn 71 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian kết tủa đến khả thu nhận EPS từ dịch nuôi cấy chủng L plantruam tuyển chọn 72 Bảng 3.7 Khả chống oxy hóa EPS sinh tổng hợp chủng L plantarum tuyển chọn 79 Bảng 3.8 Tỷ lệ, thành phần (%) monosaccharide cấu trúc EPS-W1 84 Bảng 3.9 Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu liên kết glycoside tương ứng EPS-W1 86 Bảng 3.10 Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR 13C – NMR EPS-W1 đo D2O 90 Bảng 3.11 Trạng thái gel theo thời gian sữa đậu nành lên men chủng L plantarum tuyển chọn 95 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn đơn vị lặp lại số glucan Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn đơn vị lặp lại số fructan Hình 1.3 Sơ đồ đặc điểm HoPS sinh tổng hợp từ LAB 10 Hình 1.4 Sơ đồ đặc điểm HePS sinh tổng hợp từ LAB 11 Hình 1.5 Mơ hình q trình sinh tổng hợp glucan fructan 13 Hình 1.6 Sơ đồ trình sinh tổng hợp HePS tế bào LAB 16 Hình 1.7 Cấu tạo UDP-Glc TDP- Glc 17 Hình 1.8 Sơ đồ biểu diễn tính chất tăng cường sức khỏe có EPS từ LAB 25 Hình 1.9 Cấu trúc EPS tổng hợp L helveticus 766 29 Hình 1.10 Cấu trúc EPS tổng hợp L helveticus Lb161 29 Hình 1.11 Cấu trúc EPS tổng hợp L helveticus K16 30 Hình 1.12 Cấu trúc EPS tổng hợp L delbrueckii subsp bulgaricus LBB.B26 30 Hình 1.13 Cấu trúc EPS tổng hợp L delbrueckii subsp bulgaricus NCFB2074 31 Hình 1.14 Cấu trúc EPS tổng hợp L rhamnosus KL37C 31 Hình 1.15 Cấu trúc EPS tổng hợp L rhamnosus KL37B 31 Hình 1.16 Cấu trúc EPS tổng hợp L fermentum TDS030603 32 Hình 1.17 Cấu trúc EPS tổng hợp L johnsonii 151 32 Hình 1.18 Cấu trúc EPS tổng hợp L delbruckii subsp bulgaricus 32 Hình 1.19 Cấu trúc EPS tổng hợp L delbruckii subsp bulgaricus EU23 33 Hình 1.20 Cấu trúc EPS tổng hợp L plantarum BC-25 33 Hình 1.21 Cấu trúc EPS tổng hợp L pentosus LPS26 34 Hình 1.22 Cấu trúc EPS tổng hợp L acidophilus 5e2 34 Hình 1.23 Cấu trúc EPS tổng hợp L acidophilus LMG9433 34 Hình 1.24 Cấu trúc EPS tổng hợp L paracasei 34-1 35 Hình 1.25 Cấu trúc EPS tổng hợp L sake 0-1 35 Hình 1.26 Cấu trúc EPS tổng hợp L brevis G-77 35 Hình 3.1 Khả sinh tổng hợp EPS số chủng L plantarum 52 viii Hình 4.3a Phổ 1H EPS-W1 xxxi Hình 4.3b Phổ giãn 1H EPS-W1 xxxii Hình 4.3c Phổ giãn 1H EPS-W1 xxxiii Hình 4.4a Phổ 13C EPS-W1 xxxiv Hình 4.4b Phổ giãn 13C EPS-W1 xxxv Hình 4.5a Phổ HMBC EPS-W1 xxxvi Hình 4.5b Phổ giãn HMBC EPS-W1 xxxvii Hình 4.5c Phổ HMBC EPS-W1 xxxviii Hình 4.6a Phổ HSQC EPS-W1 xxxix Hình 4.6b Phổ giãn HSQC EPS-W1 xl Hình 4.6c Phổ HSQC EPS-W1 xli Hình 4.6d Phổ HSQC EPS-W1 xlii Hình 4.7a Phổ NOESY EPS-W1 xliii Hình 4.7b Phổ giãn NOESY EPS-W1 xliv Phụ lục 5: Thành phần môi trường MRS lỏng Bảng 5.1 Thành phần môi trường MRS lỏng Thành phần Khối lượng (g) Peptone 10 Cao thịt Cao nấm D – Glc 20 K2HPO4 2,62 MgSO4.7H2O 0,2 MnSO4.4H2O 0,038 (NH4)2C6H6O7 CH3COONa.3H2O Tween 80 mL Nước cất Định mức đủ 1000 mL xlv ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN BẢO KHÁNH NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THU NHẬN, XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT VÀ THÀNH PHẦN MONOSACCHARIDE CỦA EXOPOLYSACCHARIDE TỪ MỘT SỐ CHỦNG THU? ??C LỒI Lactobacillus plantarum Chun... học quan tâm Từ lý đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài ? ?Nghiên cứu điều kiện thu nhận, xác định tính chất thành phần monosaccharide exopolysaccharide từ số chủng thu? ??c loài Lactobacillus plantarum”... thực với nội dung: Xác định điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS từ dịch lên men chủng L plantarum nghiên cứu Khảo sát số tính chất có lợi EPS sinh tổng hợp chủng L plantarum nghiên cứu Cung cấp thông