Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây lan gấm (ludisia discolor (ker gawler) blume)

SƯ P M KHOA SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố nuôi cấy lên khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume)” Sinh viên thực : Nguyễn Vũ uyền Trinh Chuyên ngành : Cử nhân Sinh Môi Trường Lớp : 09CSM Người hướng dẫn : Th.S Võ Châu Tuấn Đà Nẵng, tháng 5/ 2013 LỜI CẢM Ơ Trong suốt thời gian thực khố luận tốt nghiệp này, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths Võ Châu Tuấn – thầy giáo tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths Bùi Thị Thơ, KS.Trần Quang Dần, người giúp đỡ nhiều việc trau dồi kiến thức kĩ thực hành thí nghiệm suốt trình tơi thực đề tài khố luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt ẵng, tháng năm 2013 Sinh viên thực Nguyễn Vũ Huyền Trinh M MỞ ẦU Tính cấp thiết đề tài 2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu hương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược đa dạng giá trị dược liệu loài lan 1.1.1 Sự đa dạng loài, đa dạng phân bố .4 1.1.2 Các hoạt chất sinh học lan 1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy nhân giống in vitro 1.2.1 Môi trường nuôi cấy 1.2.2 Điều kiện nuôi cấy 1.2.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 10 1.3 Các nghiên cứu nhân giống lan dùng làm dược liệu kỹ thuật in vitro 10 1.3.1 Các nghiên cứu giới 10 1.3.2 Các nghiên cứu nước 13 1.4 Giới thiệu lan gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume) 15 1.4.1 Đặc điểm nhận dạng 15 1.4.2 Đặc điểm sinh thái 15 1.4.3 Phân bố lan gấm .15 1.4.4 Công dụng lan gấm 15 1.4.5 Những nghiên cứu lan gấm 15 hương Ố TƯỢ V P ƯƠ P ÁP Ê ỨU .18 2.1 Đối tượng nghiên cứu .18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp vô trùng mẫu tạo nguyên liệu khởi đầu 18 2.2.2 Phương pháp tái sinh chồi in vitro 19 2.2.3 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 19 2.2.4 Xử lý thống kê 19 hương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .19 3.1 Đánh giá hiệu khử trùng mẫu nuôi cấy .20 3.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi in vitro lan gấm 21 3.3 Ảnh hưởng nhóm chất điều hịa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm 25 3.3.1 Ảnh hưởng BA IBA đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm 25 3.3.2 Ảnh hưởng BA KIN đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm 27 KẾT LUẬN VÀ Ề NGHỊ .30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 P DANH M C CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : diclorophenoxyacetic acid AC : active carbon (than hoạt tính) BA : 6-benzyl adenine B5 : Gamborg (1968) CW : coconut water (nước dừa) IBA : indole 3-butyric acid KC : Knudson C (1965) KIN : kinetin ĐHST : điều hòa sinh trưởng MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid RE : Robert Ernst (1979) SH : Schenk Hildebrandt (1972) VW : Vacin Went (1949) DANH M C CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Ảnh hưởng phương pháp khử trùng đến đoạn chồi đỉnh 19 3.2 Ảnh hưởng phương pháp khử trùng đến đoạn thân có mắt 20 3.3 Ảnh hưởng BA, KIN đến khả tái sinh chồi đỉnh đoạn thân có mắt 3.4 Ảnh hưởng BA IBA đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm 3.5 21 25 Ảnh hưởng BA KIN đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm 26 DANH M C CÁC HÌNH ẢNH Hình Tên hình 2.1 Cây lan gấm tự nhiên 3.1 Ảnh hưởng BA đến khả tái sinh đoạn chồi đỉnh sau Trang 17 tuần nuôi cấy 3.2 (a) 0,25 mg/l BA (b) 0,5 mg/l BA (c) 1,0 mg/l BA (d) 1,5 mg/l BA Ảnh hưởng BA đến khả tái sinh đoạn thân có mắt sau tuần nuôi cấy 3.3 23 (a) 0,25 mg/l BA (b) 0,5 mg/l BA (c) 1,0 mg/l BA (d) 1,5 mg/l BA 24 Ảnh hưởng 0,5 mg/l BA + (0,1-1) mg/l IBA đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm (a) 0,5mg/l BA + 0,1 mg/l IBA (b) 0,5mg/l BA + 0,25 mg/l IBA 26 (c) 0,5mg/l BA + 0,5 mg/l IBA (d) 0,5mg/l BA + 1,0 mg/l IBA 3.4 Ảnh hưởng 0,5 mg/l BA + (0,25-1,5) mg/l KIN đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm (a) 0,5mg/l BA + 0,25 mg/l KIN (b) 0,5mg/l BA + 0,5 mg/l KIN (c) 0,5mg/l BA + 1,0 mg/l KIN (d) 0,5mg/l BA + 1,5 mg/l KIN 28 MỞ ẦU Tính cấp thiết đề tài Thực vật đóng vai trị vơ quan trọng việc chăm sóc sức khỏe chữa bệnh từ hàng ngàn năm Trong khoảng 250.000 – 300.000 lồi thực vật có đến 35.000 loài sử dụng làm dược liệu [48] Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO,1993) ước tính có khoảng 70-80% dân số giới, đặc biệt nước phát triển, sử dụng chủ yếu loài thảo dược truyền thống để bảo vệ sức khỏe [18] Nhu cầu toàn xã hội thuốc thảo dược lớn mà ngày tăng [75] Tại Việt Nam (1997) cho thấy 50% dân số ưa chuộng phương pháp chữa bệnh dược liệu truyền thống sử dụng phương pháp y học đại khác [82] Tuy nhiên, loài thuốc tự nhiên bị suy giảm số lượng chất lượng khai thác mức, điều kiện ngày bất lợi môi trường,… dẫn đến nhiều loài dược liệu quý bị tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho người Cây lan gấm số loài dược liệu biết đến nhiều Châu Á đặc tính chữa trị bệnh phổi thúc đẩy tuần hoàn hệ thần kinh, chữa vết thương bị cắn côn trùng …[1, 33, 81, 64] Tại Việt Nam, gọi với tên khác thạch tầm hay cỏ nhung, phân bố vườn quốc gia Bạch Mã, đảo Cù Lao Chàm, số khu rừng Tây Nguyên [1] Do có giá trị chữa bệnh nên loài khai thác thương mại hóa người dân địa phương có thuốc Bên cạnh đó, khai thác lạm dụng mức vào nguồn tự nhiên làm cho số lượng dần suy giảm, có khả dẫn đến tuyệt chủng tương lai không xa Tuy nhiên, chưa có cơng trình nghiên cứu nhân giống lan gấm Việt Nam Vì vậy, cần có giải pháp kĩ thuật nhân giống phù hợp nhằm góp phần bảo vệ ứng dụng vào sản xuất hàng loạt loài lan Việc ứng dụng tiến khoa học kĩ thuật nhằm trì đa dạng phát triển bền vững loài thuốc thực từ nhiều năm nước phát triển phát triển Công nghệ sinh học công cụ quan trọng nhân giống cải thiện di truyền dược liệu cách áp dụng kỹ thuật tái sinh ống nghiệm biến đổi di truyền Việc ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật xem phương án có tiềm để chọn lựa, nhân nhanh bảo tồn nguồn gen quý dược liệu có nguy bị tiêu diệt [79] Xuất phát từ sở chọn đề tài: “ ghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố nuôi cấy lên khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume)” Làm sở để bảo tồn phát triển loài thuốc quý Việt Nam Mục tiêu nội dung nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân nhanh chồi in vitro lan gấm Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu nghiên cứu, đề tài thực nội dung sau đây: Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu nuôi cấy: khử trùng mẫu vật nồng độ khác Ca(OCl)2, HgCl2, NaOCl khoảng thời gian khác để tìm chất khử trùng mẫu thích hợp Cảm ứng chồi ban đầu: khảo sát ảnh hưởng thành phần nồng độ chất ĐHST (BA, KIN), xác định mơi trường thích hợp cho giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu Nhân nhanh chồi: khảo sát ảnh hưởng thành phần nồng độ chất ĐHST (BA, KIN, IBA) tới hệ số nhân chồi hương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược đa dạng giá trị dược liệu loài lan 1.1.1 Sự đa dạng loài, đa dạng phân bố Hoa lan nằm số thực vật có hoa tiến hóa lớp mầm với gần 1000 chi 25.000 – 35.000 lồi cho thấy đa dạng lớn kích thước, hình dạng màu sắc hoa Chúng phân bố toàn giới, ngoại trừ Nam Cực [61] Hầu hết lồi lan có nguồn gốc từ khu rừng nhiệt đới ẩm Trung Nam Mỹ, Ấn Độ, Sri Lanka, Miến Điện, Nam Trung Quốc, Thái Lan…[39] Theo Helmut Bechtel (1982), lan rừng phân bố giới gồm khu vực [14]:  Châu Á nhiệt đới gồm chi: Bulbophyllum, Calanthe, Ceologyne, Cymbidium, Dendrobium, Paphiopedilum, Phaius, Phalaenopsis, Vanda, Anoectochillus  Châu Mỹ nhiệt đới gồm chi: Brassavola, Catasetum, Cattleya, Cynoches, Pleurothaillis, Stanhopea, Zygopetalum, Spathoglottis  Châu Phi gồm chi: Lissochilus, Polystachiya, Ansellia, Disa  Châu Úc gồm chi: Bulbophyllum, Calanthe, Cymbidium, Dendrobium, Eria, Phaius, Pholidota, Sarchochilus  Vùng ôn đới Châu Âu, Bắc Mỹ Đông Bắc Á Châu gồm chi: Cypripedium, Orchis, Spiranthes Tại Việt Nam có số lồi đặc hữu thuộc chi Anoectochillus, Bulbophyllum, Calanthe, Cheirostylis, Cleisostoma, Coelogyne, Cymbidium, Dendrobium, Eria, Liparis, Oberonia, Paphiopedilum, Pholidota, Taeniophyllum [63] 1.1.2 Các hoạt chất sinh học lan Họ lan họ lớn thứ hai giới thực vật có hoa với xấp xỉ 20.000 loài, 850 chi Sự đa dạng chủ yếu vùng nhiệt đới, nơi có đến 70% số loài họ 26 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BA IBA đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan gấm Chất ST (mg/l) Số chồi Chiều dài Số (lá/chồi) BA IBA (chồi/mẫu) chồi (cm) 0,5 0,1 1,0c 1,1b 0,7b c ab ab ặc điểm chồi Chồi xanh nhạt 0,5 0,25 1,0 1,7 1,4 Chồi xanh đậm, khỏe 0,5 0,5 2,0b 2,0a 1,7a Chồi xanh đậm, nhỏ 0,5 2,6a 2,2a 2,0a Chồi xanh đậm, nhỏ Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p