Trong nghiên cứu này, HAp được tách từ xương bò và tạo hạt dạng vi tinh thể bằng việc kết hợp các phương pháp ninh, nung, siêu âm; bột HAp thu được có độ tinh thể cao, mật độ phân bố tương đối dày đặc. Bột HAp dạng vi tinh thể được kiểm tra hoạt tính sinh học thông qua thực nghiệm in vitro cho thấy HAp có hoạt tính sinh học cao nhờ vào việc hình thành lớp khoáng xương mới giúp cho xương nhanh chóng được tái tạo.
TIỂU BAN TÀI NGUYÊN SINH VẬT KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH HYDROXYAPATITE (HAp) DẠNG VI TINH THỂ TỪ XƢƠNG BÕ VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NĨ IN VITRO Lê Thanh Thanh, Phan Tuấn Hào, Nguyễn Thị Ngọc Nhi Trường Đại học Thủ Dầu Một Các loại vật liệu có hoạt tính sinh học nhận nhiều quan tâm lĩnh vực cấy ghép vật liệu nhân tạo Vật liệu sử dụng lĩnh vực có khả hình thành lớp khống xương liên kết với xương tự nhiên (Okada & Furuzono, 2012; Kusrini et al., 2012) Sau khoảng thời gian cấy ghép việc tạo liên kết với khung xương tự nhiên vật liệu từ từ tan mà không để lại dấu vết hay hóa chất độc hại Hydroxyapatite (HAp) thu từ nguồn gốc tự nhiên đáp ứng yêu cầu vật liệu y sinh có chất thành phần hóa học xương người, Ca/P xương đảm bảo khơng bị đào thải q trình đưa vào thể (Phạm Thị Sao, 2012; Sobczak et al., 2009; Liu et al., 2008) Chính mà HAp sử dụng rộng rãi tỏ vượt trội hẳn so với vật liệu khác lĩnh vực cấy ghép y học nói riêng lĩnh vực y khoa nói chung Trong nghiên cứu này, HAp tách từ xương bò tạo hạt dạng vi tinh thể việc kết hợp phương pháp ninh, nung, siêu âm; bột HAp thu có độ tinh thể cao, mật độ phân bố tương đối dày đặc Bột HAp dạng vi tinh thể kiểm tra hoạt tính sinh học thơng qua thực nghiệm in vitro cho thấy HAp có hoạt tính sinh học cao nhờ vào việc hình thành lớp khống xương giúp cho xương nhanh chóng tái tạo I PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Xương bò (xương ống) rửa nước cất lần nước muối 0,9% chần qua nước sôi giờ, ninh nồi áp suất (4 lần) để loại bỏ tủy, gân, protein chất béo Sau xương sấy 50-60oC để loại bỏ số chất hữu đơn giản cắt thành khối cm3 Các khối xương sấy 100oC hết mùi, xương sau sấy có màu trắng vàng nghiền cối chày thành bột (XB) Cân 10 g bột xương (XB) nung giá trị nhiệt độ khác (500oC, 600oC, 700oC, 800oC, 900oC, 1000oC) khoảng thời gian (1, 2, 3, giờ) sau nghiền máy nghiền bi vịng 20 phút thu bột HAp Chuẩn bị 0,8 g bột HAp cho vào cốc thêm vào hệ dung môi siêu âm 12% wt, đánh siêu âm thời gian khác Sau kết thúc q trình đánh siêu âm mẫu sấy khơ thu bột HAp dạng vi tinh thể Mẫu bột HAp dạng vi tinh thể ngâm dung dịch SBF theo tỉ lệ ngâm mvl/Vdd (50 mg/100 ml, 100 mg/100 ml) thời gian ngâm (1, 5, 10 ngày); mẫu ngâm nhiệt độ 37oC tương tự nhiệt độ thể người lắc máy lắc với tốc độ lắc 50 (vòng/phút) Sau khoảng thời gian ngâm, bột vật liệu tách rửa nước cất lần để loại bỏ ion dư thừa sau rửa lại cồn nguyên chất để loại bỏ hoàn toàn ion tự do; sấy khô 700C Vật liệu HAp dạng vi tinh thể trước sau ngâm dung dịch SBF đặc trưng phương pháp hóa-lý đại như: nhiễu xạ tia X (XRD) máy XRD-6100 (SHIMADZU, Japan), phổ hồng ngoại biến đổi (FTIR) máy FT/IR-4600 (Jasco, Japan), hiển vi điện tử quét (SEM) máy Jeol/JSM-6480 LV (Japan), phân tích kích thước hạt (PSA) máy Horiba LA-950 (Horiba, Japan), quang phổ phát xạ nguyên tử (ICP) trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm thành phố Hồ Chí Minh 1460 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Ảnh hƣởng nhiệt độ thời gian nung đến hydroxyapatite (HAp) tách từ xƣơng bò Ảnh hưởng nhiệt độ nung Hình 1.a cho thấy mẫu bột xương sau nung nhiệt độ 500oC, 600oC có màu sẫm, nhiên nung 700oC-1000oC bột xương có màu sáng (chủ yếu màu trắng) Kết tương tự nghiên cứu trước Kusrini & Sontang, (2012) cho màu sắc bột xương thay đổi theo nhiệt độ nung chứng tỏ hợp chất hữu bị phân hủy hoàn toàn nung nhiệt độ cao (như collagen protein) Cùng với thay đổi hiệu suất phân hủy chất hữu (hình 1.b) Mẫu bột xương trước nung sau nung nhiệt độ 500oC, 600oC (hình 2.a đến c) rõ dải phổ đặc trưng nhóm PO43- nhóm OH- có tinh thể HAp thơng qua phổ FTIR Nhiệt độ nung 700-10000C (hình 2.d đến g) nhóm PO43- quan sát thấy đỉnh 1087-1091, 1040-1045, 957, 596-601, 565-570, 472 cm-1; dao động kéo dài nhóm OH- tinh thể hydrat đỉnh 3571 cm-1 dao động uốn nhóm OH- tinh thể hydrat đỉnh 632 cm-1; dao động kéo dài nhóm OH- H2O hấp thụ đỉnh 3447 cm-1; dao động nhóm CO32- đỉnh 1458-1464, 1412-1417 cm-1 (a) (b) Hình 1: Mẫu bột xƣơng bị nung nhiệt độ khác nhau: 5000C, 6000C, 7000C, 8000C, 900oC, 1000oC thời gian tƣơng ứng (a - Màu sắc, b - Hiệu suất) Hình 2: Phổ FTIR mẫu bột xƣơng bò trƣớc (a) sau nung nhiệt độ khác nhau: (b) 500oC, (c) 600oC, (d) 700oC, (e) 800oC, (f) 900oC, (g) 1000oC thời gian tƣơng ứng 1461 TIỂU BAN TÀI NGUYÊN SINH VẬT Kết nhiễu xạ tia X (XRD) hình biểu diễn pic nhiễu xạ mặt (002), (211), (310), (222), (213), (004) pic nhiễu xạ đặc trưng tinh thể HAp Pic cao mặt (211) có độ nhọn độ rộng pic hẹp chứng tỏ HAp có độ tinh khiết cao Hình 3.c có đầy đủ pic đặc trưng cường độ độ nhọn, độ rộng pic hẹp chứng tỏ thu HAp với độ tinh khiết cao nhiệt độ nung 900oC Hình 3: Nhiễu xạ tia X (XRD) bột xƣơng bò nung nhiệt độ khác nhau: (a) 700oC, (b) 800oC, (c) 900oC, (d) 1000oC thời gian tƣơng ứng Ảnh hưởng thời gian nung (a) (b) Hình 4: Mẫu bột xƣơng bị nung thời gian khác nhau: giờ, giờ, giờ, nhiệt độ tƣơng ứng 900oC (a - Màu sắc, b - Hiệu suất) Hình trình bày màu sắc hiệu suất mẫu bột xương nhiệt độ nung 9000C khoảng thời gian khác nhau: 1, 2, 3, màu vật liệu thu chủ yếu màu trắng hiệu suất giảm dần theo thời gian Chứng tỏ hợp chất hữu (như collagen protein) có xương bị phân hủy hoàn toàn, nhiệt độ nung 900oC tinh thể HAp thu với hàm lượng cao Hình trình bày phổ FTIR mẫu bột xương nung 900oC thời gian 1, 2, 3, thể đầy đủ dải phổ đặc trưng nhóm PO43- nhóm OH- có tinh thể HAp Các dải phổ đặc trưng: nhóm PO43- quan sát thấy đỉnh 1087-1091 cm-1, 10401045 cm-1, 957 cm-1, 596-601 cm-1, 565-570, 472 cm-1; nhóm OH- đỉnh 3571 cm-1, 3447 cm-1, 632 cm-1 nhóm CO32- đỉnh 1458-1464 cm-1, 1412-1417 cm-1 1462 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Hình 5: Phổ FTIR mẫu bột xƣơng bò nung thời gian khác nhau: (a) giờ, (b) giờ, (c) giờ, (d) nhiệt độ tƣơng ứng 900oC Hình 6: Nhiễu xạ tia X (XRD) mẫu bột xƣơng bò nung thời gian khác nhau: (a) giờ, (b) giờ, (c) giờ, (d) nhiệt độ tƣơng ứng 900oC Kết nhiễu xạ tia X (XRD) hình biểu diễn pic nhiễu xạ mặt (002), (211), (310), (222), (213), (004) pic nhiễu xạ đặc trưng tinh thể HAp Pic cao mặt (211) có độ nhọn độ rộng pic hẹp chứng tỏ HAp có độ tinh khiết cao Hình 6.c có đầy đủ pic đặc trưng cường độ độ nhọn, độ rộng pic hẹp kết giống với mẫu bột xương nung 9000C trong điều kiện khảo sát nhiệt độ nung đề cập Sau trình ninh tiến trình xử lý nhiệt HAp thu có hàm lượng cao từ xương bị, tìm điều kiện tối ưu nhiệt độ nung 9000C thời gian (ký hiệu: 93XB) Mẫu tối ưu xác định hàm lượng calcium phosphate quang phổ phát xạ nguyên tử (ICP), hàm lượng calcium xác định 42%, hàm lượng phosphate 18,2% kết phân tích kích thước hạt (PSA) 13,7 µm Từ kết mẫu bột HAp tiến hành tạo hạt dạng vi tinh thể phương pháp siêu âm Tổng hợp hydroxyapatite (HAp) dạng vi tinh thể Mẫu bột HAp tốt thu điều kiện khảo sát tạo hạt dạng vi tinh thể nhờ vào q trình đánh sóng siêu âm hệ dung mơi khác (hình 7) Mẫu bột 93XB tiến 1463 TIỂU BAN TÀI NGUYÊN SINH VẬT hành đánh siêu âm với hệ hai dung môi nước cất lần ethanol tỉ lệ (1:1) thời gian 150 phút thu kích thước hạt trung bình nhỏ (2,1 µm) Kết tương tự với nghiên cứu trước Kordylla et al (2008), Poinern et al (2009) cho tiến hành tăng thời gian đánh siêu âm đồng thời tăng tiếp xúc hạt sóng siêu âm, sau hạt cịn tiếp xúc với hạt bong bóng nhỏ gây lỗ rỗng hạt làm cho kích thước hạt thu nhỏ kích thước ban đầu (các hạt bong bóng nhỏ hình thành sóng siêu âm tạo luồng vi sóng xung kích) Hệ dung mơi góp phần tác động vào việc hình thành phân bố kích thước hạt, hệ phân cực có khả tạo hạt kích thước nhỏ (a) (b) Hình 7: Kích thƣớc hạt trung bình mẫu bột 93XB trƣớc sau đánh siêu âm (a Thời gian siêu âm (30, 60, 90, 120, 150 phút), b - Dung môi siêu âm (nƣớc cất lần, ethanol, nƣớc cất lần:ethanol tỉ lệ 1:1, 1:2, 2:1)) Từ kết cho thấy sau tiến hành đánh siêu âm kích thước hạt trung bình thu giảm đáng kể Đối với mẫu 93XB tiến hành đánh siêu âm hệ dung môi nước cất lần:ethanol tỉ lệ (1:1) thời gian 150 phút có kích thước dạng vi tinh thể (2,1µm), ký hiệu: 93XB15N:E (1:1) Động học hình thành khống xƣơng vật liệu HAp sau thực nghiệm in vitro (a) (b) Hình 8: Nhiễu xạ tia X (XRD) bột 93XB15N:E (1:1) trƣớc sau ngâm ngày, ngày, 10 ngày dung dịch SBF (a - Tỉ lệ ngâm 50 mg/100 ml, b - Tỉ lệ ngâm 100 mg/100 ml) 1464 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Hình trình bày kết nhiễu xạ tia X (XRD) mẫu HAp ngâm dung dịch SBF với tỉ lệ ngâm 50 mg/100 ml 100 mg/100 ml với thời gian 1, 5, 10 ngày Sau ngâm dung dịch SBF số lượng pic giữ nguyên cũ, nhiên cường độ quầng nhiễu xạ trở nên thay đổi Với thời gian ngâm 1, 5, 10 ngày nhận thấy có lớn dần pic với xuất thêm quầng nhiễu xạ làm cho pic trở nên tù (hình 8.a) Trong mơi trường ngâm 50 mg/100 ml lượng HAp tương tác lượng lớn dung dịch SBF dẫn đến tương tác hóa học mạnh HAp SBF làm phá vỡ cấu trúc HAp, nhanh chóng tái tạo lại tinh thể kéo theo hình thành HAp Dựa vào tài liệu Kokubo et al (1992), (2006) mô tả hoạt tính sinh học vật liệu HAp dung dịch SBF phản ứng phân hủy sau: Ca10(PO4)6(OH)2 hay [Ca(PO4)2]3Ca(OH)2 + 2H+ → 10Ca2+ + 6PO43- + 2H2O Sau có kết tinh lại ion để tạo thành lớp khoáng xương HAp bề mặt vật liệu HAp cũ Kết nhiễu xạ tia X (XRD) mẫu ngâm tỉ lệ 100 mg/100 ml (hình 8.b) nhận thấy khác biệt quan trọng so với kết ngâm tỉ lệ 50 mg/100 ml Điều thể ảnh hưởng tỉ lệ ngâm hoạt tính sinh học vật liệu Sau ngâm 1, 5, 10 ngày số lượng pic giữ nguyên cũ không xuất thêm pic lạ nào, cường độ pic cao so với mẫu bột trước ngâm Ngồi khơng có xuất thêm quầng nhiễu xạ pic không trở nên tù so với ngâm tỉ lệ 50 mg/100 ml Khi ngâm 100 mg/100 ml tỉ lệ tương đối cân mặt hóa học nên việc phá hủy cấu trúc tinh thể HAp xảy chậm dẫn đến việc hình thành lớp HAp so với ngâm tỉ lệ 50 mg/100 ml Từ kết trình bày hình cho thấy vật liệu cấy ghép khơng biến đổi thành vật liệu khác biến đổi thành vật liệu khác lại không giống cấu trúc xương vật liệu bị đào thải Lớp khống hình thành cầu nối gắn liền miếng ghép xương vào xương tự nhiên, qua xương hỏng tu sửa tái tạo lại (A) (B) Hình 9: Ảnh SEM bột 93XB15N:E (1:1) trƣớc sau ngâm ngày, ngày, 10 ngày dung dịch SBF (A - Tỉ lệ ngâm 50 mg/100 ml, B - Tỉ lệ ngâm 100 mg/100 ml) 1465 TIỂU BAN TÀI NGUYÊN SINH VẬT Hình 9.A trình bày ảnh SEM bột vật liệu sau ngày, ngày, 10 ngày ngâm dung dịch SBF Sau tiến hành ngâm dung dịch SBF khoảng thời gian khác ta thấy bề mặt vật liệu hoàn toàn bao phủ hạt tinh thể Sau ngày ngâm, ta thấy bề mặt bột 93XB đánh siêu âm thời gian 150 phút hệ dung môi nước cất lần:ethanol (1:1) bắt đầu xuất vết lốm đốm (hình 9.A.c d), lớp tinh thể HAp hình thành HAp cũ Sau ngày 10 ngày lớp tinh thể phát triển mạnh (hình 9.A.e đến h) Ta khơng cịn thấy vết lốm đốm mà thay vào bề mặt hạt tinh thể HAp phủ lớp HAp hồn tồn Hình 9.B trình bày ảnh SEM bột vật liệu sau ngày, ngày, 10 ngày ngâm dung dịch SBF Sau ngày ngâm, ta thấy bề mặt bột 93XB đánh siêu âm thời gian 150 phút hệ dung môi nước cất lần:ethanol (1:1) bắt đầu xuất lớp khống bám bề mặt vật liệu cũ (hình 9.B.c d), lớp tinh thể HAp hình thành HAp cũ Sau ngày, 10 ngày lớp tinh thể phát triển mạnh chứng tỏ lớp tinh thể HAp ngày phát triển HAp cũ (hình 9.B e đến h) III KẾT LUẬN Hydroxyapatite (HAp) tách từ xương bò tạo hạt dạng vi tinh thể sử dụng kết hợp phương pháp ninh, nung, siêu âm HAp tách thành công nung xương bò 900oC thu HAp dạng vi tinh thể với kích thước hạt trung bình (2,1 µm) đánh siêu âm hệ dung mơi nước cất lần : ethanol tỉ lệ (1:1) thời gian 150 phút HAp tổng hợp ngâm dung dịch giả dịch thể người (Simulated Body Fluid, SBF) cho thấy vật liệu có hoạt tính sinh học cao thơng qua việc hình thành lớp khống xương bề mặt chúng Sự hình thành lớp khống tùy thuộc vào tỉ lệ vật liệu dung dịch SBF Cơ chế trình hình thành lớp khoáng phá hủy HAp cũ dung dịch SBF sau kết tinh lại ion hình thành nên lớp khống vật liệu cũ Lớp khống cầu nối gắn kết vật liệu nhân tạo xương tự nhiên phẫu thuật chỉnh hình xương TÀI LIỆU THAM KHẢO Kusrini E., Pudjiastuti A R., Astutiningsih S., Harjanto S., 2012 Preparation of Hydroxyapatite from Bovine bone by Combination Methods of Ultrasonic and Spray Drying Bio-Chemical and Environmental Sciences, December 14-15: 47-51 Liu H., Yazici H., Ergun C., Webster T J., Bermek H., 2008 An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration Acta Biomaterialia, 4: 1472-1479 Okada M & Furuzono T., 2012 Hydroxylapatite nanoparticles: fabrication methods and medical applications Sci Technol Adv Mater, 13: 1-14 Phạm Thị Sao, 2012 Nghiên cứu chế tạo hydroxyapatit dạng gốm xốp từ vỏ trứng đá vôi Luận văn ThS Chun ngành: Hóa vơ cơ, Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội, Việt Nam Sobczak A., Kowalski Z., Wzorek Z., 2009 Preparation of hydroxyapatite from animal bones Acta of Bioengineering and Biomechanics, 11(4): 23-28 1466 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Kusrini E & Sontang M., 2012 Characterization of x-ray diffraction and electron spin resonance: Effects of sintering time and temperature on bovine hydroxyapatite Radiation Physics and Chemistry, 81: 118-125 Kordylla A., Koch S., Tumakaka F., Schembecker G., 2008 Towards an optimized crystallization with ultrasound: Effect of solvent properties and ultrasonic process parameters Journal of Crystal Growth, 310: 4177-4184 Poinern G E., Brundavanam R K., Mondinos N., Jiang Z.T., 2009 Synthesis and characterisation of nanohydroxyapatite using an ultrasound assisted method Ultrasonics Sonochemistry, 16: 469-474 Ohtsuki C., Kokubo T., Yamamuro T., 1992 Mechanism of apatite formation on CaOSiO2-P2O5 glasses in a simulated body fluid Journal of Non-Crystalline Solids, 143: 84-92 10 Kokubo T & Takadama H., 2006 How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity Journal of Biomaterials, 27: 2907-2915 STUDY ON THE SEPARATION AND THE IN-VITRO BIOACTIVITY OF MICROCRYSTALLINE HYDROXYAPATITE (HAp) FROM BOVINE BONE Thanh Thanh Le, Tuan Hao Phan, Thi Ngoc Nhi Nguyen SUMMARY In the food industry, bovine bones are known as a bio-waste Therefore, the use of bovine bone as a source of hydroxyapatite (HAp) results in economic and environmental benefit Microcrystalline HAp form was separated from bovine bone using a combination of methods including simmer, calcination and ultrasonic Influence of factors, such as calcination temperature, calcination time, ultrasonic time, ultrasonic solvent, were also surveyed HAp was soaked in Simulated Body Fluid (SBF) to test the in vitro biological activity in the formation of new bone mineral layer Characteristics of microcrystalline HAp were determined by X-ray diffraction (XRD), infrared spectrum transform (FTIR), microscopy scanning electron (SEM), analysis of particle size (PSA) and atomic emission spectra (ICP) Preparation of HAp was done by heating bovine bone at 900oC for hours, and microcrystalline HAp was obtained by ultrasonic method using ethanol in distilled water solution (1:1) for 150 The HAp had high bioactivity via in vitro experiments 1467 ... µm Từ kết mẫu bột HAp tiến hành tạo hạt dạng vi tinh thể phương pháp siêu âm Tổng hợp hydroxyapatite (HAp) dạng vi tinh thể Mẫu bột HAp tốt thu điều kiện khảo sát tạo hạt dạng vi tinh thể nhờ vào... Hydroxyapatite (HAp) tách từ xương bò tạo hạt dạng vi tinh thể sử dụng kết hợp phương pháp ninh, nung, siêu âm HAp tách thành công nung xương bò 900oC thu HAp dạng vi tinh thể với kích thước hạt trung... lớp tinh thể HAp hình thành HAp cũ Sau ngày, 10 ngày lớp tinh thể phát triển mạnh chứng tỏ lớp tinh thể HAp ngày phát triển HAp cũ (hình 9.B e đến h) III KẾT LUẬN Hydroxyapatite (HAp) tách từ xương