CHƯƠNG 1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU 1.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu Thuốc kem berberin clorid do khoa Dược, Viện Bỏng Quốc gia bào chế và cung cấp, đạt tiêu chuẩn cơ sở. Thuốc đối chiếu: kem silver sulfadiazin (biệt dựợc là Silverin 1% của Ấn Độ). 1.1.2. Thiết bị - Cân phân tích điện có độ chính xác 0,1mg của Sartorius. - Máy xét nghiệm sinh hoá tự động của Viện Bỏng Quốc gia. - Máy đếm số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu tự động của Viện Bỏng Quốc gia. - Bộ tiểu phẫu và một số thiết bị, dụng cụ khác. 1.1.3. Động vật thí nghiệm Thỏ nhà khỏe mạnh, không phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng 1,8kg - 2,2kg. Trước khi thí nghiệm được theo dõi từ 4-5 ngày, lựa chọn thỏ khoẻ mạnh, nhanh nhẹn, lông mượt, không có bệnh ngoài da và đường tiêu hoá. Số lượng động vật và cách phân lô nghiên cứu được ghi chi tiết tại mỗi thí nghiệm. Động vật nghiên cứu được cung cấp bởi Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm, Học viện Quân y và đều được nuôi dưỡng trong điều kiện chung của phòng thí nghiệm dược lý từ 5 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu: nhiệt độ phòng là 20 o C, thức ăn tổng hợp, nước uống tự do. 1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2.1. Phương pháp nghiên cứu độ kích ứng da lành của thuốc kem berberin clorid Áp dụng phương pháp nghiên cứu tính kích ứng da theo OECD, 2004 [3, 5]. Thử nghiệm được tiến hành trên 6 thỏ. Dùng dao cạo sạch lông thỏ từ giữa lưng sang hai bên khoảng 10 cm, sát trùng bằng cồn 70 % thể tích, trước khi đặt mẫu thử 24 giờ. Chỉ dùng những con thỏ có da đồng đều, không xây sước khi cạo lông. Trên mỗi thỏ, mỗi bên tại vùng da lưng đã cạo đặt một điểm chất thử với liều 0,5g. Trong nghiên cứu này, qui định bên phải đặt thuốc kem berberin, bên trái đặt thuốc silverin. Lượng chất thử (0,5g) được phết đều vào miếng gạc đã tiệt trùng có diện tích 2,5cm x 2,5cm. Áp miếng gạc có thuốc thử vào vùng da định thử (đã được cạo sạch lông). Miếng gạc được cố định trong 4giờ để đảm bảo miếng gạc luôn áp vào da thỏ. Sau 4 giờ, bóc gạc, rửa sạch vùng da bằng nước cất. Nhận định kết quả sau 4 giờ – 24 giờ – 48 giờ – 72 giờ bôi thuốc. Đánh giá phản ứng trên chỗ da đặt thuốc xem mức độ kích ứng gây ban đỏ hoặc phù theo thang điểm được qui định sẵn như sau: * Đánh giá phản ứng của da ở trạng thái gây ban đỏ, có vẩy xước (ký hiệu A). Không có ban đỏ: 0 điểm. Ban đỏ rất nhẹ: 1 điểm. Ban đỏ nhận thấy rõ: 2 điểm. Ban đỏ vừa phải đến nghiêm trọng: 3 điểm. Ban đỏ có vẩy xước nhẹ: 4 điểm. (Mức tối đa của thang điểm là 4). * Đánh giá phản ứng của da ở trạng thái phù nề (ký hiệu B) Không phù nề: 0 điểm Phù nề nhẹ: 1 điểm Phù nề nhẹ có viền phồng: 2 điểm Phù nề vừa phải có viền phồng: 3 điểm Phù nề nghiêm trọng (viền phồng ≥ 1mm): 4 điểm (Mức tối đa của thang điểm là 4) * Đánh giá kết quả: Sau khi cho điểm mức độ tổn thương (A và B). Lấy trung bình của 2 điểm này (ký hiệu C). Đây chính là điểm trung bình kích ứng da của chế phẩm. Chế phẩm đạt yêu cầu về độ kích ứng da phải không kích ứng da, điểm trung bình kích ứng da bằng không. 1.2.2. Phương pháp đánh giá tính dungnạp trên vết thương phần mềm thực nghiệm. - Đánh giá theo phương pháp của OECD [5]. - Tiến hành trên 4 thỏ - Phương pháp tiến hành: Thỏ được gây mê bằng Thiopental natri liều 35mg/kg TLCT. Cạo sạch lông 2đùi bằng kéo và sau đó bằng lưỡi dao cạo, sát trùng bằng cồn 70 0 . Dùng dao mổ rạch da phía ngoài 1/3 giữa đùi thỏ gây vết thương phần mềm dài 2,5cm, sâu 0,5cm. Băng vết thương phần mềm ở đùi phải bằng thuốc kem berberin clorid, vết thương phần mềm ở đùi trái được băng bằng thuốc silverin. Lượng thuốc 0,5g được phết đều vào miếng gạc đã tiệt trùng có diện tích 2,5 cm x 2,5 cm và băng vào vết thương. Tiến hành thay băng hàng ngày vào một giờ nhất định (8 giờ sáng). - Chỉ tiêu đánh giá: Tin trin ti ch vt thng hng ngy (biu hin ty , sng n, dch, m, tin trin lin vt thng) Tin hnh so sỏnh ỏnh giỏ gia hai vựng. 1.3. PHNG PHP X Lí S LIU: S liu c tớnh ra tr s trung bỡnh hay t l %. So sỏnh bng cỏc thut toỏn thng kờ, s khỏc bit cú ý ngha khi p<0,05. Chng 2 KT QU NGHIấN CU V BN LUN 2.1. Kết quả nghiên cứu xác định độ kích ứng da của thuc kem berberin Bảng 1. Kết quả thử kích ứng da của thuc kem berberin Vựng tn thng Ln 1 (sau 4 h) Ln 2 (sau 8 h) Ln 3 (sau 12h) Ln 4 (sau 72 h) A B C A B C A B C A B C Th 1 Th 2 Th 3 Th 4 Th 5 Th 6 im trung bỡnh kớch ng s cp STT Lần 1 (sau 4h) Lần 2 (sau 24h) Lần 3 (sau 48h) Lần 4 (sau 72h) A B C A B C A B C A B C 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Điểm trung bình kích ứng sơ cấp 0 0 0 0 Vựng bụi thuc silverin (n=4) STT Lần 1 (sau 4h) Lần 2 (sau 24h) Lần 3 (sau 48h) Lần 4 (sau 72h) A B C A B C A B C A B C 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Điểm trung bình kích ứng sơ cấp 0 0 0 0 Nhn xột: Điểm trung bình kích ứng sơ cấp bằng 0 ti vựng ỏp thuc kem berberin cng nh vựng ỏp thuc silverin. Trạng thái của tt cả cỏc thỏ sau bôi 72 giờ khoẻ mạnh, bình thng, không có biểu hiện gãi vào chỗ bôi. Các điểm bôi thuốc không có biểu hiện mẩn ngứa, da mịn bóng nh trc khi bôi. Kết quả nghiên cứu về thuc kem berberin cho thấy thuc kem berberin hoàn toàn không gây kích ứng da thỏ, điểm trung bình kích ứng da bằng 0. Tiêu chuẩn này thực sự rất cần thiết cho thuốc điều trị vết thơng bng. 2.2. Kết quả nghiên cứu ỏnh giỏ tớnh dung np trờn vt thng phn mm thc nghim trờn th Kết quả ỏnh giỏ tớnh dung np trờn vt thng phn mm thc nghim trờn th của thuc kem berberin đợc trình bày ở cỏc bảng sau. Bảng 2. Tớnh dung np trờn vt thng phn mm thc nghim trờn th Thi im Din bin ti ch vt thng ỏnh giỏ Vt thng bụi m berberin Vt thng bụi silverin Sau 24 gi Vt thng khụ, khụng cú biu hin ty , sng n Vt thng khụ, khụng cú biu hin ty , sng n Sau 48 gi Vt thng khụ, khụng cú biu hin ty , sng n, khụng cú dch, m Vt thng khụ, khụng cú biu hin ty , sng n, khụng cú dch, m Sau 72 gi Vt thng khụ, khộp ming tt, khụng cú dch, m Vt thng khụ, khộp ming tt, khụng cú dch, m Sau 5 ngy Vt thng khụ, lin ming tt, khụng cú dch, m Vt thng khụ, lin ming tt, khụng cú dch, m Sau 7 ngy Vt thng lin so tt Vt thng lin so tt Sau 10 ngy Vt thng lin so tt Vt thng lin so tt Nhn xột: Din bin ti ch vt thng tt, ti vt thng khụng cú hin tng ty , sng n, dch m. Sau 7-10 ngy vt thng ó lin so tt. Thuc kem berberin bụi ti ch vt thng dung np tt v cú tỏc dng tt cho s lin so ca vt thng tng ng so vi thuc silverin. Tài liệu tham khảo 1. Bộ Y tế CHXHCN Việt Nam (1996): Qui định về nghiên cứu dợc lý các thuốc y học cổ truyền dân tộc, 1996, QĐ 371/QĐ-YT. 2. Nguyễn Xuân Phách và cs (19950: Toán thống kê và tin học ứng dụng trong sinh - y - dợc, Nhà xuất bản Quân đội nhân dân, 1995, (146 - 149). 3. Phùng Thị Vinh, Nguyễn Thị Lập Một số phơng pháp thử kích ứng da sơ cấp Phòng Dợc Lý Viện Kiểm Nghiệm Bộ Y Tế. 4. Abrham W.B: Techniques of Animal and Clinical toxicology. Med. Pub. Chicago 1978, (55-68). 5. WHO : OECD guideline for testing of chemicals, 2001. (xem ảnh phần phụ lục) . 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Điểm trung bình kích ứng sơ cấp 0 0 0 0 Vựng bụi thuc silverin (n =4) STT Lần 1 (sau 4h) Lần 2 (sau 24h) Lần 3 (sau 48 h) Lần 4. 371/QĐ-YT. 2. Nguyễn Xuân Phách và cs (19950: Toán thống kê và tin học ứng dụng trong sinh - y - dợc, Nhà xuất bản Quân đội nhân dân, 1995, ( 146 - 149 ).