vius

- Kết quả cho thấy nhờ gen kháng virus mà cây chuyển gen có thể kháng lại sự nhiễm của virus trong khi ở cây đối chứng không chuyển gen, sự tăng trưởng và hình thành chồi đều bị ngừn[r]

Chủ đề: Tìm hiểu virus gây bệnh khảm vàng và đốm vòng Lan

Nhóm : GVHD:Nguyễn Thị Kim Cúc Lê Thị Kim Chi

Nội dung :

I Giới thiệu chung. II Đặc điểm sinh học.

III.Cơ chế chép, chế gây bệnh. IV.Triệu chứng ảnh hưởng.

I Giới thiệu chung.

 Đối với việc trồng lan, khó khăn nguy

hại tác nhân gây bệnh gồm có:

 Cơn trùng.  Nấm.

 Tác hại virus gây nghiêm trọng

Trong hai loại virus gây hại nghiêm trọng cho lan là:

 Virus CymMV (Cymbidium mosaic virus): Gây

bệnh khảm vàng

 Virus Odontoglossum ringspot virus (ORSV):

Gây bệnh đốm vòng

 Do vậy, việc phát sớm để ngăn ngừa

II Phân loại,đặc điểm hình thái, cấu trúc gen.

CymMV ORSV

Phân loại

Nhóm:Nhóm IV ((+) ssRNA) Giống: Potexvirus Họ: Flexiviridae Nhóm:Nhóm IV ((+) ssRNA) Chi:Tobamovirus Họ:Virgaviridae Đặc điểm hình thái

Dạng sợi, khơng màng bao, dài 480 nm, rộng 13nm

Đặc điểm hình thái.

CymMV

• Cấu trúc gen

CymMV ORSV

- RNA mạch đơn, sợi

dương((+)ssRNA), có mũ chụp đầu 5’ đuôi polyA đầu 3’

- Gồm vùng: RdRp, TGB CP RNA gen có chiều dài 6227

nucleotide khơng tính poly A đầu tận 3’, có khung đọc mở (ORFs 1-5) mã hóa cho ba loại

protein khác nhau: RdRp (160KDa), TBG (26KDa/ 13 KDa/ 10 KDa) CP(24KDa)

- RNA mạch đơn, sợi dương ((+)ssRNA)

-Gồm vùng: RdRp, MP CP

• Cơ chế chép

RNA đơn(+)

Protein RNA(-) Cắt RNA(+)

IV Triệu chứng.

 Virus CymMV:

- Hiện tượng : + Vàng

+ Thể khảm kèm với hóa đen

+ Chết

vùng dọc theo gân + Có đốm vệt

mơ chết kéo dài, màu nâu đến đen, không hai mặt già

- Hiện tượng hoa:

Ở giống lan: Phalaenopsis, Cattleya,

Dendrobium nhiều giống khác Cụ thể:

+ Gây đốm hoại tử đen kiểu đường hoại tử với vết lõm xuống

+ Tạo khảm màu (thường đậm hay nhạt màu hoa) hoa Cattleya.

+ Hoa nở với hình dạng phát triển Nếu chết trước trưởng thành, hoa thường có kích thước nhỏ số lượng hoa

+ Biểu sau khoảng tuần (vd:hoa Cattleya trắng)

 Virus ORSV

- Hiện tượng lá: + Gây đốm vòng

vàng lan

Odontoglossum grande Lindl

+ Phổ biến vàng dạng hình thoi kèm với vệt vàng lan

- Hiện tượng hoa:

+ Tạo khảm màu Các vệt màu đen thường nhận thấy lan có hoa từ màu hồng đến xanh nhạt pha đỏ (lavender)

+ Trước xảy

Cattleya,

diện giống lan

Odontoglossum,

Cymbidium, Vanilla

nhiều giống lan khác

 Triệu chứng nhiễm hai loại virus

- Những sọc ngắn màu vàng nhạt non

trưởng thành, làm nhỏ dựng đứng, phát hoa ngắn - Bệnh xuất

con nhiều tuổi,

 Ảnh hưởng tới trồng.

- Làm thay đổi hình thức dáng vẻ từ chóp

rễ đến đỉnh ngọn, gây bệnh điểm bị thủng, tế bào gần vết thương Phần nhiều virus gây bệnh theo cách lưu

dẫn.

- Virus công chủ tồn suốt đời Ở sinh sản dinh dưỡng, tồn dai dẳng.

- Các triệu chứng tùy thuộc: Loại chủ, loại virus điều kiện môi trường ánh

 Ảnh hưởng tới kinh tế

- Lan nhiễm virus thường lây lan nhanh, gây chết số lương lớn , không chữa

triệt để cách cắt bỏ mô hư hỏng hay dùng phương pháp lan

V Hình thức lan truyền.

 Lan truyền học:

- Lan truyền qua nhựa cây, dùng dụng cụ cắt mang mầm bệnh để tách thu hoạch hoa - Lan truyền từ bề mặt

chậu mang mầm bệnh qua nước tưới

- Qua nhân giống dinh dưỡng thông thường qua cấy mơ

 Kiểm sốt biện pháp vệ sinh

- Sử dụng dụng cụ Xử lý nhiệt cách an toàn hiệu để khử trùng dụng cụ

- ORSV vơ hiệu hóa 1000C sau 10

phút Các dụng cụ thường nhúng cồn trước đốt Mặt cắt nên đưa vào lửa trong nhiều giây.

VI Phương pháp phát hiện.

1 Phát virus gây hại lan cách test thử nhanh

• Nguyên tắc test thử nhanh

Dựa vào phản ứng tạo màu có

diện kháng nguyên (protein màng bao virus), kết hợp chuyên biệt với

Test thử nhanh

 Ưu điểm:

- Đơn giản

- Không cần đầu tư trang thiết bị

- Tiện lợi

- Giá thành rẻ

 Nhược điểm:

- Chỉ dùng để sàng lọc phát sớm mẫu nghi ngờ bị

- Pocket Diagnostics Orchid virus screen -

Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus

Phát RT-PCR.

Mẫu( Lá/Hoa Lan)

Chuẩn bị mẫu

Tách chiết RNA

Monoplex RT-PCR Multiplex RT-PCR:

Điện di

Phương pháp RT-PCR

 Ưu điểm:

- Có độ tin cậy cao

các phương pháp khác

 Nhược điểm:

- Đòi hỏi phịng thí nghiệm đại

- u cầu trình độ

chun mơn, kỹ thuật cao

2 Phát virus gây hại lan RT-PCR

a Thực phản ứng Monoplex RT-PCR:

Chuẩn bị phản ứng RT:

- Đối với mẫu phân tích: (Chuẩn bị mẫu đối chứng )

 Trộn loại 2µl RNA tổng số tách chiết tương ứng với loại

0.5µl primer ngược (nồng độ 5µM):

+ RNA virus CymMV: sử dụng primer CymMV CP-R1 + RNA virus ORSV: sử dụng primer ORSV CP-R1 + RNA thực vật: sử dụng primer mt-R1

 Tiếp tục trộn hỗn hợp với 5µl nước cất lần Đun 10 phút

70oC, làm lạnh đá phút Tiếp tục bổ sung vào hỗn hợp

RT gồm:

+ Nước cất lần 3.25µl + Buffer (5x, Promega) 2.5µl + dNTPs (10mM) 1.25µl + RNasin (40 U/µl, Promega) 0.25µl

- Ủ phản ứng 420C 60 phút Tiếp tục bổ sung hóa chất sau để tiến hành phản ứng PCR: (sử dụng cặp primer cho mẫu RNA tương ứng):

- Sản phẩm phản ứng RT 2µl

- DyNAzyme™ II DNA polymerase buffer (10x, Finnzymes Inc.) 2µl

- cặp Primer xi ngược

(5µM) 2µl

- dNTPs (2 mM) 2µl

- DyNAzyme™ II DNA polymerase enzyme (2 U/ µl, Finnzymes Inc.) 0.4µl

 Sau chuẩn bị, đặt phản ứng vào máy PCR thiết lập chương trình phản ứng sau: Bước 1: biến tính 960C phút

Bước 2: 960C 30 giây

Bước 3: 520C 30 giây

Bước 4: 720C 30 giây

Lặp lại 30 chu kỳ từ Bước đến Bước Bước 5: 720C phút

 Cuối phân tích sản phẩm khuếch đại gel

b Thực phản ứng Multiplex RT-PCR:

 Chuẩn bị thực tương tự Monoplex

RT-PCR Tuy nhiên, có vài điều khác biệt:

Phản ứng RT:

 Được chuẩn bị thực tương tự phản

ứng Monoplex RT-PCR, ngoại trừ primer

ngược (primer reverse CymMV CP-R1, ORSV CP-R1 mt-R1) cho vào đồng thời

VII Ứng dụng khác

 Chiến lược chuyển gen kháng Cymbidium mosaic virus

- Đầu tiên phải thu nhận toàn gen virus từ lan

- Tồn RNA sau ly trích dùng làm vật liệu tổng hợp cDNA gen mã hoá protein vỏ virus (CP) nhờ phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu

- Sản phẩm phản ứng RT-PCR sau gắn vào vector, tạo thành plasmid chứa tồn trình tự gen Cp virus

- Kết đựơc xác nhận cách giải trình tự: gen có chứa vùng mã hố protein vỏ đặc trưng cho

virus

- Gen CP tiếp tục đựơc tinh chèn vào

- Protector chuyển gen phát triển thành môi trường chứa hygromycin tác nhân chọn lọc

dòng chuyển gen sau tháng Hiệu chuyển 0.5 % Cây đủ rễ chuyển trồng

trong phịng tăng trưởng (Hình D)

- Để nghiên cứu tính kháng virus, chuyển gen không chuyển gen điều ủ với virion virus Sau 1, 2, tháng gây nhiễm chúng kiểm tra ELISA để đo lường mức độ tích tụ virus