Alpha Lipoic Acid ALA là một trong những chất chống oxy hóa hiện diện tự nhiên trong tất cả các tế bào nhân sơ và sinh vật nhân thực ALA có chức năng tổng hợp nội sinh là một trong yếu tố tạo thành cho một số phức hợp enzyme quan trọng trong ty thể Do đặc tính chống oxy hóa độc đáo của nó nó đã được sử dụng trong nhiều bệnh liên quan đến mất cân bằng oxy hóa và thường có sẵn trên thị trường dưới dạng thực phẩm bổ sung Mục đích của công việc nghiên cứu hiện tại là xây dựng và tối ưu phương pháp phân tích để xác định hàm lượng ALA trong thực phẩm bổ sung khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Thiết kế quy trình phân tích bao gồm Điều kiện sắc ký HPLC Điều kiện xử lý mẫu Đánh giá xác nhận giá trị của phương pháp Thử nghiệm thành thạo hay so sánh liên phòng Phân tích mẫu ở địa phương Tác giả đã tóm tắt các kết quả đạt được và đưa ra các hướng phát triển tiếp theo
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - BÙI MINH ĐỨC THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC Đà Nẵng 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - BÙI MINH ĐỨC THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành : Kỹ thuật hóa học Mã số : 8520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Diệu Hằng Đà Nẵng 2019 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu tổ chức thí nghiệm hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: PGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng, Phó trưởng phịng Đào tạo Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng tận tình hướng dẫn, giúp đỡ góp ý cho tơi kiến thức q báu thiếu xót để tơi hồn thành luận văn Các thầy giảng viên khoa Hóa, phịng Đào tạo Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng tham gia giảng dạy, hổ trợ kiến thức nền, góp ý phản biện bảo vệ đề tài Viện An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc gia tổ chức đánh giá so sánh liên phịng giúp đề tài nghiên cứu có độ xác tin cậy cao Trung Tâm Kiểm Nghiệm Thuốc, Mỹ Phẩm, Thực Phẩm Quảng Ngãi anh chị Khoa Mỹ Phẩm – Thực phẩm giúp đỡ, hỗ trợ chia sẻ khó khăn với tơi công việc Và cuối xin chúc quý thầy cô tổ chức; cá nhân lời chúc sức khỏe thành công LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng Các số liệu, kết nên luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Bùi Minh Đức TÓM TẮT LUẬN VĂN THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Học viên: Bùi Minh Đức Chuyên Ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số: 8520301 Khóa: 2017-2019 Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN Tóm tắt - Alpha Lipoic Acid (ALA) chất chống oxy hóa diện tự nhiên tất tế bào nhân sơ sinh vật nhân thực ALA có chức tổng hợp nội sinh yếu tố tạo thành cho số phức hợp enzyme quang trọng ty thể Do đặc tính chống oxy hóa độc đáo nó, sử dụng nhiều bệnh liên quan đến cân oxy hóa thường có sẵn thị trường dạng thực phẩm bổ sung Mục đích công việc nghiên cứu xây dựng tối ưu phương pháp phân tích để xác định hàm lượng ALA thực phẩm bổ sung khác phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Thiết kế quy trình phân tích bao gồm: Điều kiện sắc ký HPLC; Điều kiện sử lý mẫu; Đánh giá xác nhận giá trị phương pháp; Thử nghiệm thành thạo hay so sánh liên phịng; Phân tích mẫu địa phương Tác giả tóm tắt kết đạt đưa hướng phát triển Từ khóa - Alpha Lipoic Acid (ALA); Đánh giá phương pháp; So sánh liên phòng; Tối ưu phương pháp; Điều kiện sử lý mẫu DESIGN OF ALPHA LIPOIC ACID ANALYSIS PROCESS IN SUPPLEMENTS FOOD Abstract - Alpha Lipoic Acid (ALA) is a universal antioxidant present naturally in all prokaryotic and eukaryotic cells Endogenously synthesized ALA functions as a cofactor for several important mitochondrial enzyme complexes Due to its unique antioxidant properties, it has been administered in many oxidative stress related diseases and is also commercially available in the form of supplements food The aim of the present research work was to build and optimal analytical method to determine ALA content in various supplement food using high performance liquid chromatography (HPLC) Analysis process design includes: HPLC conditions; Sample handling conditions; Selection, verification and validation of method; Proficiency testing inter-laboratory comparision; Analyzing samples in the locality The achieved results are summarized and perspective of the work is provided Key words - Alpha lipoic acid (ALA); verification and validation of method; interlaboratory comparision; optimal analytical method; Sample handling conditions MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Cấu trúc luận văn CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát thực phẩm chức 1.2 Tổng quan Alpha Lipoic Acid 1.3 Sản xuất ALA công nghiệp 1.4 Tổng quan sắc ký lỏng HPLC CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện đo sắc ký lỏng 31 3.2 Kết Khảo sát tối ưu điều kiện Xử lý mẫu modde 36 3.3 Đánh giá quy trình phân tích ala 41 3.4 Đánh giá phương pháp so sánh liên phòng 54 3.5 Phân tích số mẫu lấy địa bàn 55 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao) DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt ALA Tiếng Anh tên khoa học Tiếng Việt Alpha-Lipoic Acid Alpha Lipoic Acid AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao ISO International Oranization for Standardization Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm CODEX BOA AGL 03 Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế quốc tế Bureau of Accreditation Supplementary requirements for accreditation in the field of chemical testing Văn phịng cơng nhận chất lượng u cầu bổ sung để cơng nhận phịng thử nghiệm lĩnh vực hóa Trung ương TW LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng ACN Acetonitril MeOH Methanol DAD UV-Vis RSD SD Diode Array Detector Đầu dò Diode Array Ultraviolet – Visible spectroscopy Quang phổ tử ngoại khả kiến Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Standard Deviation Độ lệch chuẩn EURACHEM Analytical Chemistry in Europe Hiệp hội Phân tích Hóa học Châu Âu TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam QCVN Quy chuẩn Việt Nam KNV ISO 17025:2017 Kiểm nghiệm viên Tiêu chuẩn quốc tế qui định yêu cầu nhằm đảm bảo lực phòng thử nghiệm hiệu chuẩn DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng 2.1 2.2 Danh mục loại cột khảo sát trình nghiên cứu Đặc điểm dung môi làm pha động thường dùng sắc ký pha đảo Trang 16 17 2.3 Giá trị α2 phụ thuộc vào k no 20 3.4 Kiểm tra lại q trình quy hoạch tối ưu hóa thực nghiệm 40 3.5 Bảng kết phân tích độ chệch đường chuẩn 44 3.6 Bảng kết xác định LOD, LOQ 45 3.7 Kết độ lặp lại mẫu 46 3.8 Kết độ lặp lại mẫu 46 3.9 Kết độ lặp lại mẫu 47 3.10 Kết đánh giá độ tái lặp nội mẫu 48 3.11 Kết đánh giá độ tái lặp nội mẫu 48 3.12 Kết đánh giá độ tái lặp nội mẫu 49 3.13 Đánh giá độ thu hồi mẫu 50 3.14 Đánh giá độ thu hồi mẫu 51 3.15 Đánh giá độ thu hồi mẫu 51 3.16 Kết đánh giá độ không đảm bảo đo mẫu 52 3.17 Kết độ không đảm bảo đo mẫu 53 3.18 Đánh giá độ không đảm bảo đo mẫu 53 3.19 Kết đánh giá so sánh liên phòng Alpha Lipoic Acid 54 3.20 Kết phân tích ALA mẫu lấy địa bàn tỉnh Quảng Ngãi 55 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình hình 1.1 Công thức cấu tạo ALA Trang 1.2 Một số thực phẩm chức có chứa ALA thị trường 1.3 Nguyên lý hoạt động hệ thống HPLC 1.4 Pic chất 10 1.5 Hệ số đối xứng sắc ký 10 2.1 Hệ thống máy HPLC Ultimate 3000 15 2.2 Giao diện phần mềm Chromeleon máy HPLC Ultimate 3000 15 2.3 Phổ UV-VIS hoạt chất ALA 19 2.4 Đường chuẩn phuơng trình hồi quy chất 24 2.5 Xác định LOD, LOQ nhiễu đường 26 3.1 Sắc kí đồ chuẩn ALA chạy khảo sát với H3PO4 0,001M 31 3.2 Sắc kí đồ chuẩn ALA chạy khảo sát với H3PO4 0,005M 32 3.3 Sắc kí đồ chuẩn ALA chạy khảo sát với H3PO4 0,01M 32 3.4 Sắc kí đồ chuẩn ALA chạy khảo sát với H3PO4 0,05M 32 3.5 Sắc kí đồ chuẩn ALA chạy khảo sát với H3PO4 0,025M 33 3.6 Sắc ký đồ chuẩn ALA chạy tỉ lệ ACN:H3PO4 (50:50) 33 3.7 Sắc ký đồ chuẩn ALA chạy tỉ lệ ACN:H3PO4 (30:70) 33 3.8 Sắc kí đồ chuẩn với hệ pha động ACN: 0,025M H3PO4 (40:60) (v/v) 34 3.9 Thông số sắc ký đồ chuẩn ALA 0,1mg/ml bước sóng khảo sát 34 3.10 Thơng số sắc ký đồ chuẩn ALA 0,2mg/ml bước sóng khảo sát 35 3.11 Thông số sắc ký đồ chuẩn ALA 0,3mg/ml bước sóng khảo sát 35 3.12 Thông số sắc ký đồ chuẩn ALA 0,4mg/ml bước sóng khảo sát 35 3.13 Thơng số sắc ký đồ chuẩn ALA 0,5mg/ml bước sóng khảo sát 36 3.14 Các mức yếu tố cần khảo sát Modde 37 Số hiệu hình Tên hình Trang 3.15 Mơ hình ma trận yếu tố Modde 37 3.16 Phương án thí nghiệm kết phân tích mẫu Modde 38 3.17 Tỷ lệ tương quan hệ số hồi quy 38 3.18 Hệ số kết kiểm tra hệ số phương trình hồi quy 39 3.19 Mức độ ảnh hưởng yếu tố 39 3.20 Tối ưu hóa thực nghiệm 40 3.21 Sắc ký đồ mẫu trắng 41 3.22 Sắc ký đồ mẫu chuẩn ALA nồng độ 0,1mg/ml 42 3.23 Sắc ký đồ mẫu 42 3.24 Sắc ký đồ mẫu 42 3.25 Sắc ký đồ mẫu 43 3.26 Phổ UV-Vis dung dịch chuẩn mẫu thử 43 3.27 Phương trình hồi quy tuyến tính ALA 44 3.28 Sắc kí đồ ALA nồng độ 1,50mg/L 45 Xây dựng Biểu mẫu hướng dẫn công việc ALA trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Quảng Ngãi trang sau TTKN THUỐC, MỸ PHẨM, THỰC PHẨM TỈNH QUẢNG NGÃI KHOA KN MỸ PHẨM, THỰC PHẨM HƢỚNG DẪN ĐỊNH LƢỢNG ALPHA LIPOIC ACID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Mã số: HDPP.10/MP Trang: Ban hành lần: Ngày: 10/06/2019 Cơ quan ban hành: TTKN thuốc, MP, TP tỉnh Quảng Ngãi Tình trạng ban hành STT Nội dung/ mục sửa đổi Trang Lần sửa đổi Ngày sửa đổi Người soạn thảo Bùi Minh Đức Ký tên: Người soát xét Người phê duyệt Ký tên: Ký tên Ngày: Ngày: Ngày: Ghi Mục đích Văn hướng dẫn phương pháp xác định Alpha Lipoic Acid thực phẩm chức năng: mẫu lỏng, rắn, ưu dầu sản phẩm thực phẩm chức khác TTKN THUỐC, MỸ PHẨM, THỰC PHẨM TỈNH QUẢNG NGÃI KHOA KN MỸ PHẨM, THỰC PHẨM HƢỚNG DẪN ĐỊNH LƢỢNG ALPHA LIPOIC ACID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Mã số: HDPP.10/MP Trang: Ban hành lần: Ngày: 10/06/2019 Cơ quan ban hành: TTKN thuốc, MP, TP tỉnh Quảng Ngãi Phạm vi áp dụng Khoa kiểm nghiệm Mỹ Phẩm, Thực phẩm Tài liệu tham chiếu TCVN ISO/IEC 17025: 2017 Yêu cầu chung lực phòng thử nghiệm hiệu chuẩn AGL 03 “Yêu cầu bổ sung để cơng nhận phịng thử nghiệm lĩnh vực Hóa”- Văn phịng cơng nhận chất lượng (lần ban hành 06.18, ngày ban hành: 06/2018) Trách nhiệm Kiểm nghiệm viên phân cơng thực phép thử có trách nhiệm tn thủ theo quy trình Thuật ngữ, định nghĩa, từ viết tắt Nội dung 6.1 Nguyên tắc Alpha Lipoic Acid chiết khỏi mẫu ACN:H2O (63:37) nhiệt độ 43oC, siêu âm 45 phút, lọc qua màng lọc xác định phương pháp HPLC cột pha đảo, sử dụng detector tử ngoại bước sóng 208nm 6.2 Quy trình thực 6.2.1 Hóa chất, thuốc thử Acetonitrile Acid phosphoric 85% (China) NaOH Nước cất lần 6.2.2 Thiết bị, dụng cụ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Cân phân tích (độ xác đến 0,0001g) Bể siêu âm Bể cách thủy ổn nhiệt Giấy lọc, màng lọc 0,45m Các dụng cụ thủy tinh thơng thường phịng thí nghiệm TTKN THUỐC, MỸ PHẨM, THỰC PHẨM TỈNH QUẢNG NGÃI KHOA KN MỸ PHẨM, THỰC PHẨM HƢỚNG DẪN ĐỊNH LƢỢNG ALPHA LIPOIC ACID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Mã số: HDPP.10/MP Trang: Ban hành lần: Ngày: 10/06/2019 Cơ quan ban hành: TTKN thuốc, MP, TP tỉnh Quảng Ngãi 6.2.3 Cách tiến hành 6.2.3.1 Điều kiện sắc ký Cột tách: RP-18e (5μm; 250 x 4.6mm) Hệ pha động: ACN : 0,025M H3PO4 (40:60), (v/v) Bước sóng: 208nm Thể tích tiêm: 20µl Tốc độ dòng: 1,5 ml/min Nhiệt độ cột: 30oC 6.2.3.2 Chuẩn b dung d ch chuẩn Chuẩn 1: Cân tương ứng khoảng 100mg chuẩn ALA + 5ml NaOH 0,1N, lắc đều, định mức vừa đủ 100 ml dung dịch ACN:H2O (63:37); (v/v) Hút xác 5,8,10,20,25 ml dung dịch cho vào bình định mức 50ml, định mức nước cất lắc Nồng độ chuẩn từ 0,05mg/ml đến 0,25mg/ml Chuẩn (Hệ số tương đồng): thực tương tự chuẩn 1, tiến hành pha bình thứ đường chuẩn 6.2.3.3 Chuẩn b mẫu thử Chuẩn bị mẫu sơ bộ: + Đối với nguyên liệu: Trộn đồng + Đối với viên nang cứng: Bỏ vỏ nang, trộn đồng tối thiểu 20 viên + Đối với viên nang mềm: Bỏ vỏ nang, trộn đồng tối thiểu 20 viên + Đối với viên nén: Nghiền mịn, trộn đồng tối thiểu 20 viên Chuẩn bị mẫu thử Hút xác cân lượng mẫu thử tương ứng khoảng 100mg ALA vào bình nón 250ml, thêm khoảng 5ml NaOH 0,1N, lắc Thêm khoảng 70ml ACN:H2O (63:37) (v/v), điều chỉnh nhiệt độ bể siêu âm 43oC siêu âm 52 phút Sau kết thúc xong ta chuyển tồn mẫu vào bình định mức 100ml, định mức dung dịch ACN:H2O (63:37)(v/v) tương ứng, lắc lọc Hút xác 5,0ml dịch lọc cho vào bình định mức 50ml, định mức nước cất lắc 6.2.3.4 Tiêm mẫu Tiêm dung dịch chuẩn dung dịch thử điều kiện TTKN THUỐC, MỸ PHẨM, THỰC PHẨM TỈNH QUẢNG NGÃI KHOA KN MỸ PHẨM, THỰC PHẨM HƢỚNG DẪN ĐỊNH LƢỢNG ALPHA LIPOIC ACID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Mã số: HDPP.10/MP Trang: Ban hành lần: Ngày: 10/06/2019 Cơ quan ban hành: TTKN thuốc, MP, TP tỉnh Quảng Ngãi 6.2.3.5 Đánh giá kết Xây dựng đường chuẩn, tính kết ALA có mẫu Hệ số tương quan hồi quy: 0,99 ≤ r2 ≤ 1,00 Hệ số tương đồng F = S * C : yêu cầu 0,98 ≤ F ≤ 1,02 S * C1 (Trong đó: S1; S2 lần lư t diện tích pic chuẩn 1;2 C1;C2 lần lư t nồng độ chuẩn chuẩn 2) Hồ sơ công việc: TT Tên hồ sơ Mã số Ngƣời lập Nơi lƣu Thời gian lƣu Các biểu mẫu ban hành kèm theo hƣớng dẫn: TT 01 Tên biểu mẫu Phiếu kết phân tích Mã số BM.10/HDPP.10/MP ... tài ? ?Thiết kế quy trình phân tích Alpha Lipoic Acid số thực phẩm chức năng? ?? 2 Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng đánh giá quy trình phân tích ALA số thực phẩm chức năng, quy trình phải tối ưu phân tích. .. ? ?Thực phẩm chức sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên thực phẩm trình chế biến bổ sung thêm chất chức Cũng thực phẩm thuốc, thực phẩm chức nằm nơi giao thoa thực phẩm thuốc người ta gọi thực phẩm chức. .. tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình phân tích ALA số thực phẩm chức năng, quy trình phải tối ưu phân tích hầu hết mẫu thực phẩm chức có chứa ALA thị trường Quy trình xây dựng đánh giá theo