LUẬN án TIẾN sĩ dược học FULL (CND và BC) nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi với hướng dẫn khoa học tập thể cán hướng dẫn Các số liệu, kết nêu luận án trung thực công bố phần báo khoa học Luận án chưa công bố cơng trình khác Nếu có điều sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Tác giả LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận giúp đỡ tận tình Thầy cơ, anh chị, bạn đồng nghiệp người thân gia đình Trước hết tơi xin bày tỏ lịng kính trọng đặc biệt biết ơn sâu sắc tới: GS.TS Võ Xuân Minh PGS.TS Đỗ Quyên, người Thầy tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cảm ơn chân thành tới Thầy Cô trong: Ban Giám đốc, Viện Đào tạo Dược, Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sản xuất thuốc, Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y, phòng Sau đại học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Thầy, Cô Bộ môn Thực vật, Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, Ban Giám hiệu Thầy, Cô Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa Sinh biển, Trung tâm phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội tạo điều kiện tốt để hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông, Ủy ban nhân dân Thành phố Hà Nội, anh/chị đồng nghiệp, người thân gia đình bạn bè động viên giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận án Ngày tháng năm 2020 Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục MỤC LỤC Danh mục chữ, ký hiệu viết tắt luận án Danh mục hình Danh mục bảng ĐẶT VẤ N ĐỀ CHƯƠN G TỔN G QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔN G QUAN VỀ ĐU ĐỦ RỪNG 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng sinh học d ược lý 1.1.4 Công dụng CAO THUỐC 1.2.1 Định nghĩa, phân loạ i 1.2.2 Kỹ thuật điều ch ế cao thuốc 1.3 TỔN G QUAN VỀ TĂN G CƯỜN G MIỄN DỊCH 1.3.1 Khái niệm tăng cường miễn dịch chất tăng cường m iễn dịch 1.3.2 Mơ hình nghiên cứu đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch số chế phẩm thảo mộc CHƯƠN G ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢN G NGHIÊN CỨ U 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Động vật thí ngh iệm 2.1.3 Thuốc thử, hóa chất dung mơ i 2.1.4 Máy móc , trang thiết b ị ngh iên c ứu 32 2.1.5 Địa điể m ngh iên cứu 33 2.2 PHƯƠN G PHÁP N GHI ÊN CỨU 33 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khơ Đu đủ rừng qui mơ phịng thí ngh iệm 33 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở đánh giá độ ổn định củ a cao khô Đu đủ rừng 46 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính cao khơ Đu đủ rừng đ ộng vật th ực ngh iệm CHƯƠN G K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 53 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ CA O KHƠ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG QUI MƠ PHỊN G TH Í N GHIỆM 53 3.1.1 Kết xác định số hợp chất sử dụng làm chất đánh dấu 53 3.1.2 Kết xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Đu đủ rừng làm nguyên liệu ch iết xuất 56 3.1.3 Kết xâ y d ựng qu i tr ình bào ch ế cao khơ Đu đủ rừng 72 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨ N CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪN G 88 3.2.1.Kết xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao khô Đu đủ rừng 88 3.2.2 Kết đ ánh giá độ ổn định cao khô Đu đủ rừng 95 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁ C DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG TRÊN ĐỘNG VẬ T THỰ C N GHIỆM 100 3.3.1.Kết đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch cao khô Đu đủ rừng 100 3.3.2 Đánh giá độc t ính cao khô Đu đủ rừng 108 CHƯƠN G BÀN LUẬ N 119 4.1 VỀ XÂ Y DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ CAO KHƠ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 4.1.1 Về xác định nhóm h ợp chất sử dụng làm chất xây dựng qui trình bào chế cao khô Đu đủ rừng 119 đánh dấu 119 4.1.2 Về lựa chọn ph ương pháp định lượng 120 4.1.3 Về t iêu chuẩn sở Đu đủ rừng 121 4.1.4 Về qui trình bào chế cao Đu đ ủ rừng 122 4.1.5 Về thiết bị ch iết xuất, cô đặc kết bào chế 3:1 cao 4.1.6 Bào chế cao khô Đu đủ rừng phương pháp phun sấy 128 129 4.2 VỀ XÂ Y DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤ T LƯỢNG VÀ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CA O KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 135 4.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn sở 135 4.2.2 Về đánh giá độ ổn định cao khô Đu đủ rừng 136 4.3 VỀ TÁC DỤNG TĂ NG CƯỜNG M IỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHƠ LÁ ĐU ĐỦ RỪN G 136 4.3.1 Tác dụng tăng cường miễn dịch cao khô Đu đủ rừng 136 4.3.2 Độc tính cao khơ Đu đủ rừng 143 KẾT LUẬN 145 KIẾN NGH Ị 147 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀ I LUẬ N ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢ O PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Viết tắt Phần viết đầy đủ A Aer Độ hấp thụ quang Aerosil AO Acid oleanolic BC Bạch cầu C Nồng độ 13 CI CR/D P tỷ lệ % (khối lượng/khối lượng) chất rắn tổng khối lượng dịch phun sấy cs Cộng 10 Cyc Cyclophosphamid 11 DĐVN Dược điển Việt Nam 12 DM/DL Dung môi/dược liệu (ml/g) 13 14 ĐĐR EtOH Đu đủ rừng Ethanol 15 HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) 16 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ carbon 13) Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr) hiệu cao) 17 18 HS chiết HSPL Hiệu suất chiết Hệ số pha loãng 19 HSPS Hiệu suất phun sấy 20 HR-ESI-MS High resolution - electrospray ionization - mass spectroscopy (Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử) 21 22 IL INF Interleukin Interferon 23 KLCT Khối lượng thể 24 25 KTTP KLRb k Kích thước tiểu phân Khối lượng riêng biểu kiến 26 LD50 Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số vật thử) 27 LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) 28 LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) 29 M Khối lượng 30 31 32 Mal MeOH m/z Maltodextrin Methanol Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/điện tích) 33 OA Ovalbumin + Al(OH)3 34 RSD 35 SPN Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) Saponin toàn phần 36 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) 37 38 SE STT Standard error (Sai số chuẩn) Số thứ tự 39 TCCS Tiêu chuẩn sở 40 TCMD Tăng cường miễn dịch 41 TD/CR Tá dược/Chất rắn 42 TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) 43 44 KLLTĐ KLTƯTĐ Khối lượng lách tương đối Khối lượng tuyến ức tương đối 45 46 TB TNF Trung bình Tumor necros is factor (Yếu tố hoại tử khối u) 47 UV – VIS Ultraviolet-vis ible (Tử ngoại - khả kiến) DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb ex Lindl.) Vis ,) 1.2 Cấu trúc saponin phân lập từ Đu đủ rừng 1.3 Sơ đồ thiết bịb ể ch iết siêu âm que siêu âm 15 1.4 Cấu tạo hệ thống phun sấy 22 2.1 Sơ đồ nghiên cứu mơ hình gây suy giảm miễn dịch Cy clophosphamid 49 3.1 Cấu trúc hóa học hợp ch ất phân lập từ Đu đủ rừng 3.2 Phổ UV-Vis mẫu t rắng mẫu chuẩn 53 56 3.3 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ quang theo thời gian phản ứng tạo màu 57 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ quang vào lượng acid oleanolic chuẩn 58 3.5 Sắc ký đồ củ a mẫu thử, mẫu chuẩn mẫu trắng 61 3.6 Đồ th ị mô tả phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ acid oleanolic 62 3.7 Hình ảnh vi phẫ u Đu đủ r ừng 65 3.8 Hình ảnh soi bột Đu đủ rừng 66 3.9 Hình ảnh sắc ký đồ TLC dược liệu Đu đủ rừng 68 Ả nh hưởng tỷ lệ dung môi/dược liệu v số lần chiết đến chiết xuất saponin toàn phần 11 77 75 Ả nh hưởng thời g ian đến chiết xuất saponin toàn phần 3.12 Sơ đồ tóm tắt gia iđoạn điều chế cao Đu đủ rừng 3:1 87 3.13 Sơ đồ tóm tắt g iai đoạn bào chế cao khô Đu đủ rừng 88 3.14 Kết chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) củ a bột cao khô Đu đủ rừng 3.15 92 89 H ình ảnh TLC củ a cao khơ Đu đủ rừng Hình Tên hình Trang 3.16 H ình ảnh TLC theo dõi độ ổn định cao khô Đu đủ rừng 99 3.17 ảnh vi thể lách chuột lơ (HE × 100) H ình 104 3.18 ảnh vi thể tuyến ức chuột lơ (HE × 100) H ình 104 3.19 quan g iữa liều dùng theo tỷ lệ chuột chết Tương 109 3.20 đại thể gan, lách thận chuột lô khác (HE x 25) Ả nh 116 3.21 ảnh mô bệnh học gan chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400) H ình 117 3.22 ảnh mơ bệnh học lách chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400) H ình 117 3.23 ảnh mô bệnh học thận chuột sau 90 ng ày uống thuốc (HE x 400) H ình 118 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Sự phụ thuộc củ a độ hấp thụ quang theo thờ i gian phản ứng tạo màu 57 3.2 Kết xác định độ lặp lại độ phương pháp UV- Vis 59 3.3 Kết xác định t ính tương thích hệ thống HPLC 60 3.4 Diện t ích pic thời gian lưu dung d ịch chuẩn nồng độ 61 3.5 Kết đánh giá độ lặp lại độ t rong ngày khác ngày 62 3.6 Độ nhiễu sắc ký đồ mẫu chuẩn acid oleano lic 63 3.7 Kết xác định tỷ lệ khối lượng làm khô bột Đu đủ rừng 67 3.8 Kết xác định hàm lượng tro toàn phần bột Đu đủ rừng 67 3.9 Hàm lượng saponin toàn phần Đu đủ rừng 69 3.10 Hàm lượng acid oleanolic Đu đủ rừng 70 3.11 Tóm tắt tiêu chất lư ợng tiêu chuẩn sở Đu đủ rừng 71 3.12 hưởng phương pháp chiết đến chiết xuất sapon in toàn phần Ả nh 72 13 Ả nh hưởng kích th ước tiểu phân dược liệu đến chiết xuất saponin toàn phần 73 3.14 hưởng dung mơ i đến chiết xuất saponin tồn phần Ả nh 74 3.15 Ả nh hưởng tỷ lệ dung môi/dược liệu v số lần chiết đến chiết xuất saponin toàn phần 74 3.16 hưởng nhiệt độ đến ch iết xuất saponin toàn phần Ả nh 76 3.17 hưởng thời g ian đến chiết xuất saponin toàn ph ần Ả nh 76 3.18 T hơng số qui trình chiết xuất dịch chiết Đu đủ rừng phương pháp ch iết s iêu âm 77 7.Dinh ruvng Phuongpltap UV - YIS Plnttmg pltap HPLC Ham lllQ'llg sapooin 1oan phAn khOng d.lp han 100 1) mglg , kbOOg qui 200 mglg linh ll1ns cMp hem 7.S ml}g'i t (8.6 mglg) khOog qua 12.s mi;18 iinh 111 cấp dịch > gia nhiệt cách bấm vào nút “OFF” mục điều khiển, lần cách – 10 giây Sau để quạt gió hoạt động để làm nguội buồng phun Khi nhiệt độ đầu giảm xuống khoảng 60 - 70 C tắt quạt gió để vệ sinh thiết bị - Vệ sinh thiết bị phun sấy: Tháo phận thiết bị khỏi phần thân máy, dùng máy bơm rửa nước buồng phun đến bột bám thành buồng phun, rửa ống dẫn, bình đựng mẫu để khơ tự nhiên VII PHƯƠNG PHÁP KIỂM SOÁT, KIỂM NGHIỆM Bảng PL Kiểm soát, kiểm nghiệm S TT I 1.1 1.2 1.3 1.4 Giai đoạn bào chế Yêu cầu Giai đoạn chiết xuất Dược liệu Kiểm nghiệm nguyên liệu theo TCCS Nghiền, rây nguyên xây dựng Rây số 710 liệu Cân nguyên phụ Theo công thức liệu Chiết xuất máy Nhiệt độ chiết 70 ± 20 C, thời gian chiết siêu âm chiết 90 phút/ lần, tỷ lệ dung Cô đặc 1.5 Bào chế cao ĐĐR 3:1 I Giai đoạn phun sấy 2.1 Nội dung kiểm tra, kiểm soát Chuẩn bị dịch phun môi/ dược liệu 15ml/1g/lần, chiết Nhiệt độ cô thu hồi dung môi 80 - 850 C; nhiệt độ cô cách thủy 85 - Đ ạt Đúng Đúng Đúng Hàm 90 C lượng saponin: 165 - 245 mg/g Đ ạt Tỷ lệ chất rắn cao: 20 - 30% Đ ạt Pha chế dịch phun theo công thức: Aerosil tỷ lệ 30% so với chất rắn Đúng cao, tỷ lệ chất rắn/ dịch0 phun Nhiệt độ phun sấy 130 ± C, tốc độ 2.2 2.3 Phun sấy Kiểm nghiệm cao khô ĐĐR cấp dịch 30 ml/phút, áp suất khí nén đầu phun Bar Theo TCCS 10 Đúng Đ ạt VIII DƯ PHẨM, PHẾ PHẨM Dược liệu, cao khô đu đủ rừng không đạt, rơi vãi, bẩn phải huỷ IX CÁC HỒ SƠ LÀM VIỆC CẦN THIẾT DĐVN V Sổ pha chế Nội qui phòng bào chế Qui trình vận hành thiết bị Tiêu chuẩn sở cao khô đu đủ rừng Các hồ sơ nội qui khác có liên quan 11 ... VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG TRÊN ĐỘNG VẬ T THỰ C N GHIỆM 100 3.3.1.Kết đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch cao khô Đu đủ rừng 100 3.3.2 Đánh giá độc t ính cao khô Đu đủ rừng 108 CHƯƠN... KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪN G 88 3.2.1.Kết xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao khô Đu đủ rừng 88 3.2.2 Kết đ ánh giá độ ổn định cao khô Đu đủ rừng 95 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁ C DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ... cao khơ Đu đủ rừng qui mơ phịng thí nghiệm Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bước đầu đánh giá độ ổn định cao khô Đu đủ rừng Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính cao khơ Đu đủ rừng động