NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ALKALOID DỪA CẠN TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - VÕ NGỌC BÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ALKALOID DỪA CẠN Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 9.44.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Hà Nội - 2018 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Ngô Quốc Anh Người hướng dẫn khoa học 2: TS Đoàn Duy Tiên Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Cơ sở, họp Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Ngo Quoc Anh, Vo Ngoc Binh, Nguyen Le Anh, Nguyen Van Tuyen Synthesis and antitumor activity of new vinca-alkaloid mimicking sarcodictyin features Tạp chí hóa học, 2014, 52(6A) 242-246 Q A Ngo, L A Nguyen, N B Vo, T H Nguyen, F Roussi and V T Nguyen Synthesis and antiproliferativeactivity of new vinca alkaloids containing an α, β-unsaturated aromatic side chain, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25, 5597-5600 Võ Ngọc Bình, Nguyễn Lê Anh, Nguyễn Thúy Hằng, Trần Thị Yến, Ngô Quốc Anh Tổng hợp chọn lọc lập thể dẫn xuất hidydrocyanoanhydrovinblastine Tạp chí hóa học, 2016, 54(6e2), 180-183 Võ Ngọc Bình, Nguyễn Lê Anh, Nguyễn Thúy Hằng, Trần Thị Yến, Ngô Quốc Anh Nghiên cứu tổng hợp số dẫn xuất vinca – ancaloit từ 3’-cyanoanhydrovinblastine Tạp chí hóa học, 2016, 54(6e2), 184-188 N B Vo, L A Nguyen, T L Pham, D T Doan, T B Nguyen and Q A Ngo Straightforward access to new vinca-alkaloids via selective reduction of a nitrile containing anhydrovinblastine derivative, Tetrahedron Letters, 2017, 58, 2503-2506 Vo Ngoc Binh, Nguyen Le Anh, Nguyen Thuy Hang, Tran Thi Yen, Ngo Quoc Anh Synthesis and antitumor activity of new vinca alkaloids from 3’-cyanoanhydrovinblastine, Viet Nam Journal of Chemistry, 2018 (Đã chấp nhận đăng) MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Ung thư nhóm bệnh đặc trưng phát triển khơng kiểm sốt lan truyền tế bào bất thường Tỷ lệ ung thư tồn giới ước tính khoảng 14 triệu trường hợp năm Các nguồn lực to lớn đầu tư khắp giới để phát triển chiến lược phòng ngừa, chẩn đốn điều trị ung thư Các cơng ty dược phẩm tổ chức phủ, phi phủ tham gia tích cực vào việc phát phát triển chất chống ung thư Các vinca alkaloid phân lập từ dừa cạn Madagascar, Catharantus roseus G Don, chứa khoảng 130 terpenoid indole alkaloid Giá trị lâm sàng chúng công nhận vào đầu năm 1965 Vì loại hợp chất sử dụng chất chống ung thư 50 năm qua nhóm hợp chất dẫn đầu cho phát triển thuốc Ngày nay, hai hợp chất tự nhiên, vinblastine (VLB) vincristine (VCR) hai dẫn chất bán tổng hợp, vindesine (VDS) vinorelbine (VRLB), phê duyệt để sử dụng Hoa Kỳ Do tầm quan trọng dược phẩm hàm lượng chiết xuất thấp VLB, VCR alkaloid khác nên Catharanthus roseus trở thành thuốc nghiên cứu nhiều Những nỗ lực nghiên cứu nhà khoa học nhằm tìm thêm hợp chất khác có độc tính thấp khả điều trị cao tiếp tục Xuất phát từ sở kết nghiên cứu tính cấp thiết thực tiễn, thực đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp hoạt tính sinh học dẫn xuất alkaloid dừa cạn” Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất vinca alkaloid mang nhóm khác vị trí C-3’ N-6’ thuộc vòng D tiểu đơn vị velbanamine, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học dẫn xuất tổng hợp Các phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp tổng hợp hữu đại biết, có cải tiến vận dụng thích hợp vào trường hợp cụ thể Sản phẩm phản ứng làm phương pháp sắc ký cột Cấu trúc sản phẩm xác định phương pháp phổ đại như: IR, HR-MS, NMR Hoạt tính sinh học đánh giá theo phương pháp Monks hai dòng tế bào ưng thư KB HepG2 Phép thử độc tế bào ung thư bạch huyết cấp tính người HL-60, thử nghiệm apoptosis thực 1Viện Dược lý Độc học, Đại học Würzburg, Cộng Hịa Liên Bang Đức Phương pháp mơ hình mơ docking phân tử thực Phịng Thí nghiệm Hóa học tính tốn Mơ phỏng, Khoa Hóa học - Trường Đại học Quy Nhơn Những đóng góp luận án  Tổng hợp 23 hợp chất vinca alkaloid từ alkaloid dừa cạn thiên nhiên catharanthine, vindoline, vinblastine vincristine bao gồm: – 12 dẫn xuất muối ammoni bậc IV anhydrovinblastine, vinblastine, vincristine 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 81a – 84c – 11 dẫn xuất từ 3'-cyanoanhydrovinblastine bao gồm dẫn xuất vinca alkaloid 92a – 92e thông qua việc khử chọn lọc 3’cyanoanhydrovinblastine 88 dẫn xuất vinca alkaloid 93a – 93f thơng qua việc khử alkyl hóa aminomethyl 92c  Lần quy kết đầy đủ độ chuyển dịch proton carbon hợp chất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 xác định cấu hình tuyệt đối vị trí C-3’ hợp chất 88 Một phương pháp tổng hợp chất 88 cho hiệu suất cao nhiều phương pháp tổng hợp cũ (74% so với 32%)  Cấu trúc chất xác định liệu phổ 1DNMR, 2D-NMR, IR HRMS Đặc biệt, sử dụng phổ 2D – NMR: COSY, HSQC, HMBC, NOESY xác định cấu hình lập thể hợp chất 92a – 92e  Tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB Hep-G2 23 dẫn chất Kết quả, bốn hợp chất 83a, 83b, 84a, 84b thể tính độc tế bào có chọn lọc mạnh dòng tế bào KB với IC50 tương đương với vinblastine vincristine Ba vinca alkaloid dẫn xuất 81a-c xuất phát từ anhydrovinblastine 12 có hoạt tính gây độc tế bào KB tốt so với 12 chí tốt so với Ellipcitine trường hợp 81b Các hợp chất vinca alkaloid lược giản 82a-c cách thay vindoline với 3,5-dimethoxyaniline (DMA) khơng làm hoạt tính mà cịn cải thiện họat tính đáng kể so với hợp chất gốc 18(S)-3’,5'dimethoxyanilinecleavamine 77  Lựa chọn hợp chất 81a – 81c, 82a-b, 92a-92c có độc tính tế bào mạnh để tiến hành docking tubulin Kết cho thấy, 02 dẫn chất alkaloid dừa cạn 92b 82a có hoạt tính gây độc tế bào mạnh cho tương tác mạnh với tubulin  Lần tiến hành thử chế sinh học 02 chất chlorochablastine 83b chlorochacristine 84b mô hình apoptosis, cell cycle, ức chế tăng sinh tế bào so với alkaloid thương phẩm Kết cho thấy hai chất lựa chọn có hiệu lực tương tự vinflunine alkaloid dừa cạn bán tổng hợp thương phẩm hệ Bố cục luận án Luận án có 138 trang bao gồm: Mở đầu: trang Chương Tổng quan: 27 trang Chương Thực nghiệm: 38 trang Chương Kết thảo luận: 52 trang Kết luận: trang Phần tài liệu tham khảo bao gồm 16 trang tài liệu trích dẫn, tài liệu cập nhật đến năm 2018 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Microtubule - Một đích tác dụng quan trọng thuốc điều trị ung thư 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Động học microtubule 1.1.3 Các nhóm thuốc chống ung thư theo chế tác dụng lên microtubule 1.2 Vinca alkaloid 1.2.1 Giới thiệu vinca alkaloid 1.2.2 Tổng hợp vinca alkaloid 1.2.2.1 Bán tổng hợp 1.2.2.2 Tổng hợp toàn phần 1.2.2.3 Sinh tổng hợp công nghệ sinh học 1.2.3 Mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính vinca alkaloid 1.2.3.1 Những thay đổi phần khung vindoline 1.2.3.2 Những thay đổi phần khung velbanamine 1.2.4 Ứng dụng lâm sàng vinca alkaloid 1.3 Định hướng mục tiêu luận án CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất thiết bị 2.1.1 Hóa chất dung mơi 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 2.1.2.1 Phổ hồng ngoại IR 2.1.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 2.1.2.3 Phổ khối lượng MS HRMS 2.1.2.3 Năng suất quay cực riêng [α]D 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp tổng hợp hữu 2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.3 Các phương pháp tinh chế xác định cấu trúc 2.3 Tổng hợp số dẫn xuất vinca alkaloid chứa mạch nhánh ketone α,β-không no 2.3.1 Tổng hợp anhydrovinblastine 12 2.3.2 Tổng hợp 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 2.3.3 Tổng hợp số dẫn xuất vinca alkaloid chứa mạch nhánh ketone α,β-không no 2.4 Tổng hợp số dẫn xuất vinca alkaloid từ 3’cyanoanhydrovinblastine 88 2.4.1 Tổng hợp 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 2.4.2 Tổng hợp dẫn xuất alkaloid thơng qua việc khử có chọn lọc dẫn xuất 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 2.4.2.2 Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’S,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 83a 2.4.2.2 Tổng hợp chất 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b 2.4.2.3 Tổng hợp chất (3'R-aminomethyl)-(4’S,5’-dihydro)anhydrovinblastine 92c 2.4.2.4 Tổng hợp chất 3'S-cyano-4-deacetyl-anhydrovinblastine 92d 3'Scyano-4-deacetyl-3-hydroxymethyl-anhydrovinblastine 92e 2.4.3 Tổng hợp số dẫn xuất alkaloid thông qua việc khử alkyl hóa aminomethyl 92c 2.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học chất nghiên cứu Hoạt tính sinh học hợp chất nghiên cứu theo phương pháp gây độc tế bào Monks (1991) hai dịng tế bào ung thư biểu mơ KB ung thư gan HepG2 phòng thử hoạt tính Sinh học, Viện Hóa học Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phép thử độc tế bào ung thư bạch huyết cấp tính người HL-60, thử nghiệm apoptosis thực Viện Dược lý Độc học, Đại học Würzburg, Cộng Hòa Liên Bang Đức Phương pháp mơ hình mơ phân tử docking thực Phịng Thí nghiệm Hóa học tính tốn Mơ phỏng, Khoa Hóa học - Trường Đại học Quy Nhơn CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tổng hợp dẫn xuất vinca alkaloid chứa mạch nhánh ketone α,βkhông no Các hợp chất ketone α,β-không no hợp chất tìm thấy nhiều thiên nhiên alkaloid, terpene, sesquiterpen, triterpenoid, chalcone flavone daphnipaxianines Daphliphyllum paxianum, myrtenal từ loài Citrus reticulata, zerumbone Zingiber zerumbet, licorisoflavane A, quercetin, kaemferol Morus alba L hay isoliquirigenin từ Glycyrrhiza glabra, curcumin từ loài Curcuma longa L Đặc biệt, sarcodictyin (71, 72) eleutherobin 73 phân lập từ số lồi san hơ mềm, chuỗi DNA thể sống tạo thành từ hợp chất chứa nhóm ketone α,β-khơng no thymine uracil Nhóm ketone α,β-khơng no có vai trị quan trọng mặt hóa học sinh học Về mặt hóa học, hợp chất ketone α,β-khơng no chất trung gian chìa khóa để tổng hợp nhiều chất quan trọng flavonoid, pyrazoline, diazepine, pyrimidine,…Về mặt sinh học, hợp chất chứa nhóm ketone α,β-khơng no xác định có nhiều hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng viêm, hoạt tính chống sốt rét, hoạt tính chống ký sinh trùng, hoạt tính chống huyết áp hay loại bỏ yếu tố NF-κB gây nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt hoạt tính gây độc tế bào nhóm xem Michael acceptor nhóm thiol số protein hay khả định hướng tế bào ung thư chết theo chương trình Chính vậy, hợp chất chứa nhóm ketone α,βkhơng no ln đối tượng nghiên cứu hấp dẫn nhà khoa học, số thuốc chứa nhóm sử dụng hiệu điều trị bệnh AZT, Edoxudine, Zalcitabine, Griseofulvin nhiều chất khác chứa nhóm phân lập từ thiên nhiên sử dụng hỗ trợ điều trị điều trị bệnh ung thư Hình 3.3 Hợp chất lai ketone α,β-không no vinca alkaloid Do đó, chúng tơi nghiên cứu tổng hợp loạt vinca alkaloid có chứa mạch nhánh hợp chất ketone α,β-không no liên kết với amin bậc ba phần velbanamine tạo thành muối amoni bậc bốn xác định hoạt tính chống ung thư chúng Tổng hợp hợp chất vinca alkaloid đơn giản cách thay vindoline với 3,5-dimethoxyaniline (DMA) nghiên cứu Sơ đồ 3.1 Quy trình chung tổng hợp hợp chất 76a-c Hóa chất điều kiện: (a) ArCHO, MeOH, nhiệt độ phòng (b) NBS, p-TsOH, CH3CN, nhiệt độ phòng Trước tiên, tổng hợp alkylbromide 76a-c chứa hợp phần ketone α,βkhông no bắt đầu phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt arylcarboxaldehyde acetone methanol nhiệt độ phịng Sau đó, sản phẩm ngưng tụ bromo hóa chọn lọc vị trí α-methylketone 75a-c áp dụng dụng quy trình nhóm tác giả Lee Jong Chan, sử dụng NBS diện axit ptoluenesulfonic nhiệt độ phòng giờ, thu sản phẩm 76a-c với hiệu suất 70-73% Sơ đồ 3.2 Tổng hợp vinca alkaloid chìa khóa 12 77 Hóa chất điều kiện: (a) (i) Vindoline (V) 3,5-dimethoxyaniline (DMA), FeCl3, glycineNaCl 0,1M, HCl 0,1 N, (ii) NaBH4, NH4OH Các hợp chất 12, 77 tổng hợp theo phương pháp mô tả trước Vukovic với hiệu suất tốt (76-85%) Theo đó, chúng tơi thực phản ứng ghép nối catharanthine vindoline (hoặc 3,5-dimethoxyaniline) với có mặt ion sắt III mơi trường nước có tính axit, sau khử hóa NaBH4 thu hợp chất 12 77 (Sơ đồ 3.2) Trong hóa học Hữu cơ, phản ứng Menshutkin cách dễ dàng hiệu để chuyển amin bậc ba thành muối ammonium bậc bốn thông qua alkylhalide Bằng phản ứng Menshutkin, 12 muối amoni bậc bốn thu sau khuấy đương lượng alkylbromide 76a-c nhiệt độ phòng THF với vinca alkaloid anhydrovinblastine 12, 18(S)-3’,5'6 dimethoxyanilinecleavamine 77, vinblastine 1, vincristine (Sơ đồ 3.4) Các sản phẩm cuối 81a-84c thu với hiệu suất 63-72% Sơ đồ 3.4 Tổng hợp vinca alkaloid chứa mạch nhánh ketone α,β-không no Các hợp chất miêu tả đầy đủ cách sử dụng phổ 1D, 2D NMR phổ khối phân giải cao HR-EI-MS Nhìn chung, so sánh với phổ hợp chất ban đầu thay đổi quan trọng phổ NMR chúng quan sát thấy xung quanh vị trí N-6’, đặc biệt vị trí 5’, 7’, 19’ 22’, cộng hưởng proton carbon phần vidoline thay đổi không đáng kể Các vinca alkaloid phân tử có cấu trúc phức tạp nên việc gán phổ NMR vinca alkaloid phải tiếp cận thận trọng Việc phân tích cấu trúc hợp chất thu được tiếp cận theo phần khung cấu trúc phân tử, trước hết phần khung vindoline sau phần velbanamine chứa mạch nhánh ketone α,β-không no cộng hưởng 2,83 (s, 1H) gán cho proton H-19, phổ HMBC H-19 tương tác với nguyên tử carbon 30,9 (C-20), 50,1 (C-10), 53,5 (C-12), 76,5 (C-4) 83,1 (C-2) Trên phổ COSY, proton H-10 tương tác với H-11 Hình 3.6 Cấu trúc đánh số theo IUPAC phần velbanamine Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR phần velbanamine hợp chất 81b anhydrovinblastine 12 CDCl3 Vị trí Hợp chất 81b Anhydrovinblastine 12 δH, J (Hz) δC δH, J (Hz) 1’ 2,63 (m, 1H) 33,85 2,40 (m, 1H) 3,12 (m, 1H) 3,04 (m, 1H) 2’ 2,02 (m, 1H) 30,68 1,30 (m, 1H) 3’ 5,60 (s br, 1H) 121,8 5,45 (s, 1H) 4’ 132,87 5’ 4,45 (m, 1H) 64,35 3,28 (m, 1H) 4,56 (m, 1H) 3,52 (d, J = 16,0, 1H) 7’ 4,45 (m, 1H) 53,40 3,4 (m, 1H) 4,47 (m, 1H) 3,4 (m, 1H) 8’ 3,30 (m, 1H) 19,93 3,05 (m, 1H) 3,87 (m, 1H) 3,41 (m, 1H) 9’ 107,66 10’ 129,1 11’ 7,57 (d, J = 8,1, 1H) 117,44 7,51 (d, J = 7,7, 1H) 12’ 7,16 – 7,26 (m, 1H) 120,6 7,20 – 7,10 (m, 1H) 13’ 7,16 – 7,26 (m, 1H) 123,6 7,20 – 7,10 (m, 1H) 14’ 7,16 – 7,26 (m, 1H) 111,27 7,20 – 7,10 (m, 1H) 15’ 134,75 N-H 8,36 (s, 1H) 8,04 (s, 1H) 17’ 132,8 18’ 54,6 19’ 4,11 (m, 1H) 63,09 2,55 (br d, J = 14,0, 1H) 4,53 (m, 1H) 3,31 (m, 1H) 20’ 2,04 (m, 2H) 27,26 1,92 (dd, J = 14,5/7,5, 1H) 21’ 1,07 (t, J = 7,4, 3H) 11,50 0,98 (t, J = 7,5, 3H) 22’ 3,68 (s, 1H) 70,5 23’ 191,18 24’ 6,90 (d, J = 16,5, 1H) 123,90 25’ 8,25 (d, J = 16,5, 1H) 147,27 10 δC 34,3 32,9 123,5 140,0 52,1 54,3 25,9 117,3 129,4 118,3 122,2 118,3 110,5 135,0 131,0 55,5 45,9 27,8 12,2 26’ 27’, 31’ 7,66 (d, J = 8,4, 2H) 28’, 30’ 7,40 (d, J = 8,5, 2H) 29’ C18’-COOCH3 C18’-COOCH3 3,68 (s, 3H) 132,1 130,6 129,4 137,9 173,09 52,83 3,62 (s, 3H) 174,6 53,3 Trên phần velbanamine, tín hiệu N-H H-3’ định vị dễ dàng 8,36 (s, 1H) 5,60 (s br, 1H) Sử dụng H-3’ làm điểm bắt đầu, xác định proton H-1’, H-2’ H-19’ dựa phổ COSY Ba tín hiệu cộng hưởng proton methyl H-21’, C18’-COOCH3 1,07 (t, J = 7,4 Hz, 3H) 3,68 (m, 3H) khơng có thay đổi nhiều so với anhydrovinblastine 12 Trên phổ COSY, proton methylene H-20’ cộng hưởng 2,02 ppm tương tác với proton H-21’ tương tác allylic với proton H-3’ 5,60 ppm Sự chuyển dịch hóa học proton methylene H-20’ hồn tồn phù hợp với tính chất allylic Hai tín hiệu cộng hưởng 4,45 4,56 ppm gán cho proton H-5’ hai proton có tương tác yếu với hai proton H-20’ Các proton lại phần velbanamine H-7’, H-8’ proton thơm nhân indole Trên phổ COSY, hai proton H-7’ tương tác yếu với proton H-5’ tương tác với hai proton H-8’ Độ chuyển dịch hóa học hai proton H-8’ 3,30 ppm 3,87 ppm không khác nhiều so với anhydrovinblasstine 12, đó, độ chuyển dịch hóa học hai proton H-7’ hợp chất 81b 4,45 4,56 ppm khác nhiều so với hai proton H-7’ anhydrovinblastine 12 3,61 3,44 ppm, điều ảnh hưởng nhóm vị trí N-6’ Các proton thơm nhân indole từ H-11’ đến H-14’ dễ dàng xác định dựa phổ COSY, HSQC HMBC, H-11’ 7,57 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-11’) 7,16 – 7,26 (m, 3H, H-12’, H-13’, H-14’) Như vậy, chúng tơi hồn thành việc gán phổ proton hai phần khung vindoline velbanamine Dễ thấy, so sánh với hợp chất ban đầu tín hiệu cộng hưởng proton carbon-13 phần khung vindoline thay đổi không đáng kể, thay đổi quan trọng phổ NMR 81b quan sát thấy xung quanh vị trí N-6’, đặc biệt vị trí 5’, 7’, 19’ 22’ (xem Bảng 3.2) Trên phổ 1H-NMR hợp chất 81b, vùng trường thấp xuất tín hiệu cộng hưởng 7,66 (d, J = 8,4 Hz, 2H-H-27’, H-31’) 7,40 (d, J = 8,5 Hz, 2H-H-28’, H-30’) đặc trưng cho nhân thơm vị trí para Hai tín hiệu doublet 8,25 ppm 6,9 ppm có số tách J = 16,5 Hz đặc trưng cho proton olefin cạnh nhóm carbonyl H25’ H-24’ Phổ khối phân giải cao HR-EI-MS hợp chất 81b cho pic ion giả phân tử M+ có m/z 971,4366 (tính tốn cho cơng thức M+ C56H64ClN4O9, 971,4356) xác nhận nhóm alkylbromide 76b đính vào 11 anhydrovinblastine 12 Như vậy, nhóm alkylbromide 76b đính phần khung velbanamine anhydrovinblastine 12 Cấu hình trung tâm bậc bốn N-6’ yếu tố định định hướng ketone α,β-khơng no, sở cho tương tác hợp chất với tubulin Theo cấu trúc tia X vinblastine, cặp electron không phân chia nguyên tử nitơ định hướng cho cấu hình tuyệt đối nhóm amino bậc ba S Do đó, cấu hình tuyệt đối N-6’ cho hợp chất 81b cấu hình S Bằng cách tiếp cận tương tự, dựa liệu phổ 1D, 2D NMR phổ khối phân giải cao HR-EI-MS chứng minh cấu trúc hợp chất lại 81a, 81c-d, 83a-84d Tiếp theo ví dụ phân tích cấu trúc hợp chất vinca alkaloid lược giản cách thay vindoline với 3,5-dimethoxyanilin (DMA) Hình 3.10 Cấu trúc hợp chất 82b cách đánh số theo IUPAC Phổ khối HR-EI-MS cho pic ion phân tử M+ có m/z 668,2866 ứng với công thức theo lý thuyết C39H43ClN3O5+ xác nhận nhóm alkylbromide 76b gắn vào 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 Trên phổ 1H-NMR hợp chất 82b xuất đầy đủ tín hiệu cộng hưởng proton có mặt phân tử Vùng trường thấp, tín hiệu cộng hưởng 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-27’, H-31’) 7,38 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-28’, H-30’) đặc trưng cho nhân thơm vị trí para Hai tín hiệu doublet 8,03 ppm 6,88 ppm có số tách J = 16,2 Hz đặc trưng cho proton olefin H-25’ H-24’ Tín hiệu proton nhân indole cộng hưởng 7,44 (m, 1H, H-11’), 7,25 (m, 2H, H13’, H-14’), 7,07 (t, J = 7,3 Hz, H-12’) 8,40 (s, N-H) Trên nhân aniline, tín hiệu singlet cộng hưởng proton tương đương nhóm methoxi -OCH3 3,76 ppm hai tín hiệu proton H-2 H-6 cộng hưởng 5,96 ppm 6,00 ppm Trên phổ 13C NMR DEPT hợp chất 82b, cho thấy rõ tín hiệu carbon nhóm carbonyl 191,03 (C-23’) 172,76 (C18’-COOCH3) Trên phổ 1H NMR HSQC xác nhận tín hiệu proton khơng tương tác với carbon 5,29 (s, 2H) tín hiệu proton –NH2 nhân aniline 12 Bảng 3.3 So sánh phổ 1H NMR (CDCl3) hợp chất 82b 18(S)-3’,5'dimethoxyanilinecleavamine 77 Vị trí Hợp chất 82b 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 5’ 4,45 (m, 1H) 3,30 (m, 1H) 6,11 (m, 1H) 3,40 (m, 1H) 7’ 4,26 (m, 1H) 3,00 (dd, J = 13,6Hz/ 4,6Hz, 1H) 4,40 (m, 1H) 3,15 (m, 1H) 19’ 4,18 (d, J = 15,9 Hz, 1H) 2,50 (d, J = 12,8Hz, 1H) 4,65 (d, J = 15,9 Hz, 1H) 3,54 (m, 1H) 22’ 3,64 (s, 2H) 5,96 (s, 1H) 5,88 (s, 2H) 6,00 (s, 1H) 7,8 NH2 3,76 (s, 6H) 5,29 (s, 2H) 3,72 (s, 6H) - Dữ liệu phổ hợp chất 82b so sánh với hợp chất ban đầu 18(S)3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 (xem Bảng 3.3) Dễ thấy, tín hiệu cộng hưởng proton carbon-13 phần khung velbanamine xung quanh vị trí N-6’ thay đổi so với hợp chất ban đầu, đặc biệt vị trí 5’, 7’, 19’ 22’ Từ liệu cho thấy nhóm ketone α,β-không no gắn vào 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 vị trí N-6’ phần khung velbanamine Cấu hình trung tâm bậc bốn N-6’ yếu tố định định hướng ketone α,β-khơng no, sở cho tương tác hợp chất với tubulin Theo cấu trúc tia X vinblastine [142], cặp electron không phân chia nguyên tử nitơ định hướng cho cấu hình tuyệt đối nhóm amino bậc ba S Do đó, cấu hình tuyệt đối N-6’ cho hợp chất 82b cấu hình S Tương tự vậy, cấu trúc hợp chất 82a, 82c chứng minh phương pháp phổ 1D, 2D NMR phổ khối phân giải cao HR-EI-MS Như vậy, tổng hợp 12 muối amoni bậc bốn từ vinca alkaloid anhydrovinblastine 12, 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77, vinblastine 1, vincristine (Sơ đồ 3.4) Các sản phẩm thu 81a-84c thu với hiệu suất 62-72% Ưu điểm phương pháp chỗ, phản ứng xảy dễ dàng, hiệu suất tốt Sản phẩm tạo bền so với chất ban đầu, trung tâm phản ứng nguyên tử nitơ amin bậc ba bị alkyl hóa Đặc biệt, phản ứng xảy chọn lọc vị trí N-6’ phần khung velbanamine điều lý 13 giải cấu tạo chữ T cấu trúc vinca alkaloid che chắn vị trí N-9 phần vindoline tính linh động cặp electron amin bậc ba so với amin bậc nhân aniline 3.2 Tổng hợp dẫn xuất vinca alkaloid từ 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 3.2.1 Tổng hợp dẫn xuất vinca alkaloid thơng qua việc khử chọn lọc 3’-cyanoanhydrovinblastine 88 Hình 3.14 Hợp chất 85, 86 87 Langlois Potier lần tổng hợp dẫn xuất nitril vinca alkaloid (85, 86 87) thu hỗn hợp với hiệu suất thấp (