Quy trình công nghệ sản xuất insulin

Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Cơng nghệ sinh học LỜI NĨI ĐẦU Có thể nói kỉ 21 kỉ công nghệ sinh học, kỉ ứng dụng ngày nhiều khoa học công nghệ Nó khơng có ý nghĩa cách mạng hố phát triển sinh học, mà cịn tạo quyền lực to lớn cho người việc cải tạo sinh giới thân Cơng nghệ sinh học phát triển ứng dụng từ lâu Tuy nhiên công nghệ sinh học thực phát triển từ thập niên 70 kỉ XX, với đời hỗ trợ của ngành khoa học khác, đặc biệt công nghệ thơng tin.Từ cơng nghệ sinh học phát triển vũ bão xứng đáng mang danh cho kỉ mới: Thế kỉ công nghệ sinh học! Cơng nghệ sinh học gì? Cơng nghệ sinh học công nghệ sử dụng hệ thống sinh học, tế bào sinh vật, động vật, thực vật dẫn xuất chúng để tạo sản phẩm cải biến trình chun hóa phục vụ lợi ích người Cơng nghệ sinh học ngành khoa học quan trọng, phát triển sở kĩ thuật mẻ: kĩ thuật di truyền, kĩ thuật dung hợp tế bào; kĩ thuật nuôi cấy mô; kĩ thuật nuôi cấy tế bào; kĩ thuật cấy chuyển phôi….Những thành tựu chuẩn bị cho cách mạng sinh học ngành kinh tếkĩ thuật Công nghệ vi sinh coi ngành mũi nhọn công nghệ sinh học, có tác động to lớn đến đời sống người việc sử dụng vi sinh vật để tạo hàng loạt sản phẩm rượu, bia, axit hữu cơ, axit amin, chất điều vị, dung môi hữu cơ, vitamin, kháng sinh, vacxin… Công nghệ vi sinh sử dụng để xử lý phế thải làm môi trường… Vi sinh vật trở thành công cụ chuyển gen lý tưởng mà giá trị cơng cụ tạo sản phẩm có chất lượng cao giá thành rẻ Công nghệ sản xuất Insulin công nghệ ứng dụng công nghệ sinh học vi sinh sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học cao Insulin dạng hoocmon điều chỉnh lượng đường máu người động vật, thiếu Insulin gây bệnh tiểu đường sau dẫn đến bệnh lý khác Cũng Insulin, chất có hoạt tính sinh học cao Interferon, hoocmon sinh trưởng GVHD: TS Trần Văn Lư -1- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học người( HGH), somatostatin …rất cần thiết cho việc phòng chống chữa bệnh cho người Thơng thường hợp chất có hoạt tính sinh học tổng hợp với lượng nhỏ tế bào thể người động vật bình thường Một số người thiếu hụt hợp chất gây bệnh lý cần điều trị bổ sung vào thể Ngày người ta sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học công nghệ di truyền với số lượng lớn, tinh có tính an tồn cao Ý nghĩa đó, cơng đầu ngành cơng nghệ sinh học nói chung, cơng nghệ vi sinh nói riêng Với lý đó, tơi chọn đề tài : “ Quy trình công nghệ sản xuất Insulin” để làm rõ vấn đề Vì thời gian có hạn nên chắn tiểu luận cịn nhiều thiếu sót, mong q thầy bạn góp ý để tiểu luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn NỘI DUNG GVHD: TS Trần Văn Lư -2- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học INSULIN: 1.1 Sơ lược lịch sử phát Insulin Bệnh tiểu đường biết đến từ thời cổ đại Những tài liệu cổ người Ai Cập từ 1.500 năm trước Cơng ngun mơ tả bệnh suy mịn với tình trạng nước tiểu người bệnh có vị Từ năm 1850 trở đi, khám nghiệm tử thi bệnh nhân bị bệnh tiểu đường gợi ý, bệnh xuất tuyến tụy không bảo đảm chức bình thường Nhiều bác sĩ cho tế bào biệt hóa, gọi tiểu đảo Langerhan, sản sinh hóa chất giúp thể điều hòa nồng độ đường máu Bệnh tiểu đường xuất hóa chất khơng sản sinh H1 - Loại thuốc trị tiểu đường nhà sinh lý học người Canada Fred Banting Charles Best tìm năm 1922 Quá trình nghiên cứu sản xuất insulin có đóng góp quan trọng chó Năm 1922, Fred Banting Charles Best thuộc Đại học Tổng hợp Toronto (Canada) thông báo họ tìm insulin ứng dụng thành công chất điều trị bệnh tiểu đường người Vào thời điểm đó, người bị bệnh tiểu đường phải vật lộn với bệnh để tồn chưa có biện pháp điều trị hiệu Bệnh nhân nhanh chóng trở thành xương di động thường chết sớm bị sút cân nghiêm trọng Banting Best cắt bỏ tuyến tụy chó, hậu chúng bị tiểu đường (thử nghiệm nghe tàn nhẫn, giúp cứu sống hàng triệu người) Họ cố gắng tinh chế hc mơn hóa học từ tụy chiết xuất nhiều thành phần từ tiểu đảo Langerhan Sau đó, chất tiêm vào chó bị bệnh tiểu đường để thử nghiệm họ nhận thấy bệnh tiểu đường bị đẩy lùi GVHD: TS Trần Văn Lư -3- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Cơng nghệ sinh học Ban đầu, thuốc tiêm lẫn nhiều tạp chất thường gây tai biến nguy hiểm Một đội ngũ nhà khoa học phối hợp nghiên cứu tạo tinh chất chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan, bảo đảm đủ độ tinh khiết để thử nghiệm người bệnh Vào tháng năm 1922, Leonard Thompson, 14 tuổi, điều trị thành công Bệnh viện Toronto tinh chất (được gọi insulin) Năm 1928, Oskar Wintersteiner chứng minh insulin protein.Tin tức thành công Banting Best nhanh chóng lan rộng sau phịng thí nghiệm họ khơng thể đáp ứng đủ nhu cầu loại thần dược Quy trình sản xuất thương mại insulin bắt đầu việc chiết suất chất từ tụy bò lợn thịt (hiện nguồn insulin quan trọng y học) Q trình biến đổi hóa học làm cho insulin giống với hc mơn người tạo cho đặc tính thuận tiện cho việc sử dụng Ban đầu, insulin tiêm 3-4 lần/ngày trước bữa ăn Sau đó, loại insulin có tác dụng kéo dài đời, số lần tiêm giảm xuống Năm 1955, Frederick Sanger, người đoạt giải thưởng Nobel, tìm chuỗi axit amin insulin người Điều cho phép nhà khoa học tạo gene insulin, dùng để tạo chủng vi khuẩn biến đổi di truyền có khả sản sinh số lượng lớn insulin với độ tinh khiết cao Ngày nay, biết insulin giúp tế bào thể hấp thu đường từ thức ăn tiêu hóa Gan có vai trị đặc biệt quan trọng quy trình điều hòa nồng độ đường máu thể Insulin giúp cho gan tiếp nhận đường (glucose) sau bữa ăn lưu trữ dạng glycogen Glycogen sau chuyển hóa thành glucose trở lại máu nồng độ đường máu bắt đầu giảm 1965, người ta tổng hợp nhân tạo hai chuỗi polipepetit A B tạo Insulin nhân tạo giá thành đắt Năm 1978, lần Insulin tổng hợp nhờ vi khuẩn E.Coli công nghệ di truyền Người ta tạo dòng plasmic tái tổ hợp cách gắn đoạn gen tổng hợp chuỗi polipeptit A B vào vật chất di truyền tế bào E.Coli , sau gắn hai loại chuỗi polipeptit với tạo phân tử Insulin có hoạt tính dùng chữa bệnh GVHD: TS Trần Văn Lư -4- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình công nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học Từ năm 1982, Insulin sản xuất công nghệ gen trở thành thương phẩm 1.2 Cấu trúc Insulin: Insulin hoocmon protein tế bào tuyến tụy beta đảo Langerhans sinh Phân tử Insulin tương đối nhỏ, có khối lượng khỗng 6000 Dalton, cấu tạo hai chuỗi polipeptit A B Các chuỗi A B liên kết cầu nối disulfua, ngồi cịn có cầu nối disulfua nằm chuỗi A Ở hầu hết loài, chuỗi A gồm 21 axitamin chuỗi B gồm 30 axitamin Mặc dù trình tự aaxitamin khác lồi số đoạn định phân tử có tính bảo tồn cao, đoạn có chứa cầu nối disulfua, hai đầu chuỗi A nhánh bên đầu COOH chuỗi B Sự tương đồng tình tự axitamin dẫn đến cấu trúc chiều Insulin loài khác giống Insulin chiết rút từ động vật có hoạt tính sinh học cao lồi khác Các phân tử Insulin có xu hướng tạo thành dạng dime dung dịch hình thành liên kết H đầu COOH chuỗi B Ngoài ra, có mặt ion kẽm, dime insulin liên kết tạo thành hexame Các mối tương tác có ý nghĩa quan trọng điều trị Dạng monome dime dễ dàng khuếch tán vào máu, dạng hexame khuếch tán Do đó, hấp thụ thuốc chứa hàm lượng hexame cao thường bị chậm ngừng hẳn Vấn đề thúc đẩy đời số loại chất insulin giả tái tổ hợp Loại chất bán thị trường insulin lispro, phân tử chất có trật tự lisin prolin đầu COOH chuỗi B bị đảo ngược, làm giảm khả hình thành dạng dime hexame Insulin ban đầu tổng hợp dạng “preproinsulin” (tiền insulin) ribosome tế bào beta đảo Langerhans tuyến tụy Preproinsulin phân tử dạng thẳng bao gồm: peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với 31 acid amin (C) chuỗi A nối với theo thứ tự SPB-C-A Khi vận chuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo proinsulin (B-C-A) Proinsulin hình thành cầu nối disulfur lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba Proinsulin bị phân cắt enzyme PC1/3 liên kết GVHD: TS Trần Văn Lư -5- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Cơng nghệ sinh học chuỗi B peptide C sau bị phân cắt enzyme PC2 vị trí liên kết chuỗi A peptide C Hai acid amin đầu N peptide nối với đầu C chuỗi B bị phân cắt PC1/3 phân cắt khỏi chuỗi B enzyme carboxypeptidase H Kết cuối tạo thành insulin H.2 – Cấu trúc phân tử Insulin 1.3 Vai trò Insulin: Insulin hoocmon điều hòa nồng độ Glucose máu Chức cân nội môi lượng sinh học quan trọng Glucose nguồn ngun liệu hơ hấp tế bào nguồn khung Cacbon định cần cho tổng hợp chất hữu Cân trao đổi chất phụ thuộc vào việc trì Glucose máu gần điểm ổn định,khoãng 90mg/ml người ( Theo Campbell) 1.3.1 Insulin trao đổi Hidratcacbon: Glucose giải phóng từ tinh bột, saccarose….nhờ thủy phân tiêu hóa thức ăn, sau hấp thụ vào máu ruột non Nồng độ Glucose cao máu kích hoạt giải phóng Insulin Insulin hoạt động tế bào khắp thể nhằm thscđẩy hấp thụ, sử dụng dự trữ Glucose Tác động Insulin lên trao đổi Glucose thay đổi tùy theo mô đích Các phân tử Insulin tuần hồn theo dịng máu chúng gắn vào thụ thể chúng màng tế bào Khi đó, phức hợp thụ thể -Insulin khởi phát GVHD: TS Trần Văn Lư -6- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học chuỗi truyền tín hiệumang thơng tin phát từ Insulin : chuyển glucose khỏi huyết tương H – Insulin gắn với thụ thể màng tế bào tuần hoàn máu Trong loạt đáp ứng tế bào hoạt hóa Insulin gây bước chìa khóa trao đổi chất Glucose GLUT4 glucose transporter Nhờ vận chuyển thuận lợi glucose vào tế bào, GLUT4 loại glucose khỏi dòng máu cách hiệu Những thay đổi kéo dài từ vài phút đến vài GLUT4 có mặt màng tế bào nhiều loại mô thể mô xương( đốt cháy Glucose làm lượng), mô mỡ ( chuyển glucose thành tryglyxerit để dự trữ) mô gan Insulin thúc đẩy gan dự trữ Glucose để hình thành Glycogen Phần lớn Glucose hấp thụ ruột non vào tế bào gan, chuyển hóa thành chất dự trữ glycogen Insulin có nhiều tác động gan thúc đẩy sinh tổng hợp glycogen Đầu tiên hoạt hóa enzym hexokinaza, chất photphorin hóa glucose, nhờ glucose bị bẩy vào tế bào Insulin ức chế hoạt động Glucose-6-phosphatase Insulin hoạt hóa nhiều enzym liên quan trực tiếp đến sinh tổng hợp glycogen, bao gồm phosphofructokinase glucogen syntase Khi khơng có mặt Insulin, tổng hợp Glycogen gan dừng lại enzym chịu trách nhiệm phân hủy Glycogen hoạt động GVHD: TS Trần Văn Lư -7- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học H.4 – Insulin điều hịa lượng glucose máu Vì Insulin ngăn cản mức độ tăng cao đường máu nên khơng phép có q nhiều Insulin Một bước kiểm soát mức độ Insulin enzym Insulinnase ( tìm thấy gan thận ) phân hủy Insulin tuần hoàn máu, làm cho hoocmon phân hủy với thời gian bán rã khoãng phút Quá trình bảo đảm mức độ Insulin lưu hành máu điều chỉnh mức độ glucose máu không giảm xuống thấp đến mức nguy hiểm 1.3.2 Insulin trao đổi lipit: Insulin có tác động quan trọng lên q trình trao đổi lipit Các tác động bao gồm: 1.3.2.1 Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp axit béo gan: Khi lượng Glycogen tích tụ gan cao ( > 5% khối lượng thô gan) trình tổng hợp bị ức chế Khi gan bão hịa Glycogen lượng Glucose hấp thụ thêm vào tế bào gan phải chuyển sang đường tổng hợp axit béo, sau vận chuyển khỏi gan dạng lipoprotein Các lipoprotein vào vịng tuần hồn, cung cấp axit béo tự cho mô, mô mỡ ( tế bào tạo mỡ) để tổng hợp triglyxerit 1.3.2.2 Insulin ức chế phân hủy chất béo mô mỡ: Bằng cách ức chế trình thủy phân triglyxerit thành glyxerol axit béo tự Enzim nhạy GVHD: TS Trần Văn Lư -8- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học cảm với hoocmon trở nên hoạt động photphorin hóa Insulin ngăn cản q trình kết hợp với thụ thể màng tế bào, làm tăng tích tụ glyxerit tế bào mỡ 1.3.3 Insulin tác động khác: - Insulin làm tăng tính hấp thụ axitamin - Insulin làm tăng tính thấm tế bào ion Kali, Magie, photphat vô , tạo điều kiện thuận lợi cho q trình photphorin hóa sử dụng glucose H5-Insulin làm tăng tính thấm ion K, Mg photphat vơ 1.4 Tổng hợp tự nhiên Insulin thể: Insulin tổng hợp tế bào tuyến tụy beta Các tế bào beta xếp thành bó gọi đảo Langerhan tụy insulin tạo từ phần protein lớn để đảm bảo gấp nếp H.6 - Tổng hợp Insulin thể GVHD: TS Trần Văn Lư -9- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học ANRm tiến hành dịch mã protein gọi preproinsulin Preproinsulin bao gồm trình tự tín hiệu đầu amin giúp tiền chất hoocmon qua màng lưới nội chất tham gia vào trình sau dịch mã Tại trình sau dịch mã, trình tự tín hiệu đầu amin khơng cần thiết nên preproinsulin bị thủy phân tạo thành proinsulin Sau hình thành cầu nối disunfua số peptitdase phân cắt proinsulin tạo insulin hoàn chỉnh hoạt động Insulin đóng gói chứa hạt tiết, tích tụ tế bào chất kích hoạt để giải phóng H – Các bước cải biến sau dịch mã phân tử Insulin KHÁI QUÁT VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG: 2.1 Dịch tễ học: Tiểu đường ( diabetes ) bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat, đường máu khơng bị oxi hóa để giải phóng lượng mà tích tụ máu mức cao (> 1,2g/l) gọi tăng đường huyết Ở Mỹ, năm có khỗng 17 triệu người ( 6%) dân số mắc bệnh tiểu đường, gây tử vong cho 400.000 cư dân Hoa Kỳ đứng thứ bệnh gây chết người Tiểu đường phổ biến độ tuổi 45 tuổi, người béo phì, hoạt động, người có người thân bị mắc bệnh GVHD: TS Trần Văn Lư - 10 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học * Tách chiết ARN: quy trình tương tự tách chiết AND, dịch chiết sau làm protein, sử dụng enzim phân hủy AND, kết tủa thu ARN * Định lượng AND, ARN: sản phẩm sau tách chiết cần có độ tinh hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng phương pháp đo quang phổ để xác định số hấp phụ, tù đánh giá độ tinh hàm lượng cần thiết Hoặc dùng phương pháp điện di gel thạch xác định băng AND, ARN, suy độ tinh hàm lượng cần thiết cho nghiên cứu 3.2.1.2 Tạo vector tái tổ hợp: ► Vector tách dòng: phân tử AND có kích thước nhỏ, có khả gắn gen cần thiết, tự tái bản, tồn tế bào chủ đặc biệt phải mang tín hiệu nhận biết tế bào chủ mang vector tái tổ hợp Các loại vector tách dòng thường dùng : ❖ Plasmid : phân tử AND dạng vòng, xoắn kép, có tế bào chất vi khuẩn ❖ Phagơ : phần lớn phagơ Lamda, có hệ gen chứa vị trí thuận lợi cho cài gen khác nhau, giúp gen dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn có khả có khả chép nhanh ❖ Virut tế bào nhân thực: virut SV40, adenovirut, retrovirut, virut herpes…được sử dụng tách dòng chuyển gen tế bào động vật, thực vật ► Enzym cắt giới hạn: enzym có khả nhận biết đoạn trình tự phân tử AND cắt AND điểm đặc hiệu Đồng thời cắt gen từ hệ gen đó, cắt vector tách dòng vector tái tổ hợp, tạo điều kiện gắn đoạn gen cần thiết Các loại enzym giới hạn thường dùng : ❖ Enzym giới hạn cắt đầu so le ( đầu dính) enzym có khả nhận biết đoạn trình tự lại cắt vị trí lệch hai mạch đơn, tạo đầu dính, nối đoạn AND bị cắt lại với ❖ Enzym giới hạn cắt đầu bằng: enzym nhận biết đoạn trình tự cắt vị trí giới hạn, tạo đầu chúng không tự nối lại được, cần sử dụng enzym nối để nối đoạn cắt lại với đoạn nối chuyên dụng cho loại enzym GVHD: TS Trần Văn Lư - 17 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học ► Enzym nối Ligasa: enzym quan trọng tế bào, chúng xúc tác hình thành liên kết photphodieste để nối đoạn axit nucleic với Có loại enzym nối quan trọng Công nghệ di truyền: enzym E.Coli AND tách chiết từ vi khuẩn E.Coli, enzym T4 AND enzym T4 ARN tách chiết từ phage T4 Ngồi ra, ngày người ta cịn sử dụng đoạn nối (đầu dính adaptor ) cho enzym đầu Adaptor xúc tác nối đoạn ADN enzym cắt đầu từ tạo nên đầu sol Các adaptor đặc trưng riêng cho loại enzym Dùng enzym cắt hạn chế từ hai nguồn AND khác nhau, qua khâu nối trộn lẫn tạo sản phẩm AND tái tổ hợp 3.2.1.3 Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dòng gen: - Đưa AND tái tổ hợp vào tế bào chủ theo kỹ thuật biến nạp( chuyển trực tiếp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ) – tế bào chủ vi khuẩn, tế bào động vật, tế bào thực vật; nhờ máy di truyền tế bào chủ nhân AND tái tổ hợp, tạo sinh khối lớn - Những tế bào chủ thường dùng: ❖ Vi khuẩn E.Coli: dễ thao tác, tốn kém, sinh sản nhanh, tạo dòng AND tái tổ hợp nhanh ❖ Tế bào nấm men, tế bào động vật, thực vật nuôi cấy Invitro; loại tế bào thường dùng vào mục đích cụ thể; nghiên cứu điều hòa hoạt động gen, đột biến gen… - Những phương pháp chủ yếu dùng để đưa AND tái tổ hợp vào tế bào nhận: ❖ Kỹ thuật siêu âm: chuyển gen vào tế bào trần ( thành Xelulose) mơi trường thích hợp ❖ Kỹ thuật xung điện: sử dụng dòng điện cao áp ( khoãng 500V/cm) tạo lỗ thủng nhỏ tế bào trần, tạo điều kiện gen xâm nhập vào hệ gen tế bào chủ ❖ Kỹ thuật vi tiêm: tiêm lượng nhỏ AND vào tế bào chủ tế bào trứng thụ tinh giai đoạn phôi 4-8 tế bào GVHD: TS Trần Văn Lư - 18 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học ❖ Kỹ thuật bắn gen: dùng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển ( súng bắn gen) vào hệ gen tế bào chủ Vi đạn hạt Volfram vàng trộn với gen cần chuyển phụ gia, vi đạn bắn vào viên đạn lớn hơn, bắn, viên đạn lớn giữ lại, vi đạn bắn vào tế bào nhận với gia tốc lớn 3.2.1.4 Chọn lọc, tạo dòng biểu gen: Việc chọn lọc dịng tế bào ý khơng đơn giản tốn nhiều công sức Khi xác nhận ADN tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào mang gen cần thiết chúng sinh sản để tạo dịng tạo điều kiện cho gen biểu ❖ Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmit tái tổ hợp: sau biến nạp ADN vào tế bào nhận, tạo nhiều dịng tế bào vi khuẩn khác Chúng ni thành dòng khuẩn lạc vi khuẩn (gồm dòng tế bào vi khuẩn khơng nhận plasmit, dịng nhận plasmit khơng có gen lạ dịng nhận plasmit tái tổ hợp) Do muốn nhận tách dòng gen từ thư viện ADN, người ta sử dụng phương pháp: - Lai axit nucleic: làm tan chỗ khuẩn lạc vi khuẩn giấy lọc nitrocellulose ADN thoát gắn với mẫu thử axit nucleic có mang dấu phóng xạ với độ dài hàng trăm nu Nếu tượng bắt cặp bổ sung xảy có nghĩa gen chuyển vào tế bào nhận - Phát kiểu hình: địi hỏi dịng mục tiêu phải có biểu dạng protein dễ phát phép thử - Phản ứng miễn nhiễm: tế bào nhận plasmit có gắn đoạn ADN lạ tế bào vi khuẩn hoạt tính kháng tetracyclin, khuẩn lạc mọc mơi trường có ampicilin, khơng mọc mơi trường có tetrecyclin Đây dịng tế bào cần chọn ❖ Sự biểu gen tạo dịng: nói chung gen lạ sau đưa vào tế bào nhận, muốn gen có biểu tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ yếu tố phiên mã dịch mã phù hợp sở chế điều hòa biểu biểu gen Các vector gọi vector biểu 3.2.2 Ý nghĩa sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất insulin: GVHD: TS Trần Văn Lư - 19 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học Trên thị trường có loại Insulin tổng hợp chủ yếu , phân loại theo thời gian bắt đầu hoạt động , thời điểm đạt cực đại thời gian kéo dài tác dụng thuốc Với vai trò công nghệ ADN tái tổ hợp lượng Insulin sản xuất vè đáp ứng nhu cầu Insulin bệnh nhân tiểu đường Theo Hiệp hội Tiểu đường Mỹ, insulin tác động nhanh vào máu vòng 15 phút, đạt cực đại 30-90 phút kéo dài Có loại Insulin tác dụng lâu, tồn trog máu tư 20 – 24 giờ, thị trường số Insulin bán dạng hỗn hợp hai loại đóng lọ, làm tăng hiệu điều hịa điều trị bệnh Hiện cơng nghệ sinh học trở thành phương tiện hữu hiệu có nhiều ứng dụng vơ to lớn sản xuất Insulin bước nhảy vọt việc chữ trị bệnh tiểu đường Ngoài ý nghĩa quan sử dụng công nghệ để sản xuất Insulin, hiệu kinh tế sử dụng công nghệ này, giá thành sản phẩm hạ nhiều mà chất luuwongj ssanr phẩm vãn bảo đẩm, nhờ ý nghĩa sản xuất sinh khối cao tế bào nhân tham gia quy trình nghệ ADN tái tổ hợp 3.2.3 Quy trình sản xuất Insulin công nghệ AND tái tổ hợp: Tổng hợp Insulin người q trình sinh hóa gồm nhiều bước, gồm hai phương pháp 3.2.3.1 Phương pháp 1: Tạo chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học tạo tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh ◆ Bước 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng sinh học phân tử tách gen mã hoá proinsulin người nhiễm sắc thể số 11 Tách mARN gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein Do hầu hết mARN người có polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với polyA Sử dụng sắc kí lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho trình dịch mã; cịn lại loại bỏ ADN ARN khác Cắt bỏ cầu nối A - T thu mARN GVHD: TS Trần Văn Lư - 20 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học H8 Tách mARN gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người ◆ Bước 2: Tách thiết kế plasmit tái tổ hợp - Cắt gen mã hoá proinsulin plasmit loại enzym giới hạn Nối ADN ligase phageT4 Trong thành phần vector biểu phải có promoter mạnh giúp gen biểu vi khuẩn -Thiết kế trình tự mã hố cho protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin tế bào chất Nếu sử dụng mARN tách từ tiến hành sau: - Sao mARN tinh khiết thành ADN (cADN) nhờ enzym phiên mã ngược nhờ dNTP (trong phản ứng RT - PCR) - Cài đoạn cADN mã hố insulin hồn chỉnh vào plasmit đứng sau promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli ◆ Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca tạo lỗ xung điện GVHD: TS Trần Văn Lư - 21 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học H9 Tách biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli Sau q trình biến nạp, cần chọn lọc dịng vi khuẩn mang gen mong muốn Qúa trình chọn lọc phụ thuộc vào quy trình gen đánh dấu vector sử dụng Thông thường sử dụng laoij gan kháng sinh Ampixilin Tetraxilin để chọn lọc Sau kiểm tra dịng chọn lọc theo nhiều cách khác cách giải đoạn trình tự nucleotic đoạn gen cài vào vector tái tổ hợp so sánh với trình tự gốc ◆Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đưa vào nồi lên men Ni chúng nồi lên men với điều kiện tối ưu Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, theo chất dinh dưỡng liên tục bổ sung để đảm bảo tăng trưởng vi khuẩn theo hàm mũ Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi khuẩ nhân lên qua nguyên phân Như vậy, H10- Qúa trình lên men sau thời gian ngắn, sinh khối tăng lên nhanh gen insulin tổng hợp.◆ Bước 5: Tiền tinh Sau lên men cần tách tế bào khử trùng nhiệt - Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit - Bằng phương pháp ly tâm lọc tách proinsulin GVHD: TS Trần Văn Lư - 22 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Cơng nghệ sinh học ◆ Bước 6: Hoạt hoá Do hệ thống E.coli có khả biểu gen insulin khơng có khả hoạt hố insulin Hoạt hố proinsulin invitro cách xử lý dung dịch đệm, giúp đạt cấu trúc bậc 4, sau dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi sản phẩm thu có hoạt tính cần thiết Hình 11:Hoạt hố proinsulin thành insulin hoàn chỉnh ◆ Bước 7: Hỗn hợp tinh cịn có insulin Bằng phương pháp sắc ký, tách phương pháp miễn dịch gắn enzym Độ tinh insulin đánh giá qua giai đoạn trung gian q trình sản xuất nhờ phịng thí nghiệm chun hố Cuối insulin tinh thể hố Hình 12: Các tinh thể insulin GVHD: TS Trần Văn Lư - 23 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Cơng nghệ sinh học 3.2.3.2 Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B Phương pháp tránh việc sản xuất enzim đặc hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A B Xác định trình tự ADN để qua tổng hợp tách hai dòng gen Mỗi ADN chèn vào plasmit Sau sản xuất tương tự sản xuất proinsulin Cuối hai chuỗi A B trộn với hình thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ chất oxi hố định Hình 13 Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A chuỗi B riêng biệt Hình 14: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B GVHD: TS Trần Văn Lư - 24 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học 3.2.4 Các phương pháp sản xuất khác: • Ngày nay, nấm men sử dụng thay cho vi khuẩn E.Coli để sản xuất insulin Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin người gần hoàn chỉnh với cấu trúc khơng gian hồn hảo Điều làm giảm tối đa tính phức tạp giá thành giai đoạn tinh Sản xuất insulin dựa công nghệ gene công nghệ sinh học mang lại nhiều lợi ích tính vượt trội so với việc thu nhận từ động vật Insulin sản xuất nhiều hệ thống khác tế bào E coli, tế bào Saccharomyces tế bào thực vật, có thành cơng đáng kể Tuy nhiên tạo insulin hệ thống gặp số hạn chế Novo Nordisk công ty hàng đầu giới bán insulin với chất lượng đáng tin cậy, công ty sản xuất insulin thương mại hệ thống tế bào Saccharomyces Nhóm nghiên cứu Novo Nordisk tạo insulin hệ thống tế bào nấm men Pichia cho thấy hệ thống có nhiều ưu điểm so với hệ thống Saccharomyces Hiện Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu tạo insulin theo phương pháp Đối tượng chọn để sản xuất insulin tế bào nấm men Pichia Trong giai đoạn đầu nghiên cứu, nhóm thực tổng hợp gene mã hóa cho insulin Hiện nhóm tiến hành nhân dịng gene mã hóa cho insulin plasmid mang pBluescript Plasmid pBluescript mang gene mã hóa cho insulin chuyển nạp vào E coli Khi thành công q trình nhân dịng gene mã hóa cho insulin, gene mã hóa cho insulin biểu tế bào Pichia Kiểm tra trình biểu protein kháng thể chuyên biệt Tiến hành thu nhận tinh protein tái tổ hợp Bước đầu kiểm tra hoạt tính insulin chuột thí nghiệm • Giả insulin : Cải tiến phương thức hoạt động insulin thể người cách thay đổi trình tự axitamin tạo chất tương tự Insulin giả kết dính với khuếch tán vào máu dễ dàng Quy trình sản xuất Insulin giả tương tự quy trình sản xuất insulin • phương pháp sản xuất Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất biểu chuỗi A chuỗi B riêng biệt cách sử dụng Escherichia coli, sau thu chuỗi A chuỗi B, trộn với in vitro tạo cầu nối disulfur Phương GVHD: TS Trần Văn Lư - 25 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Cơng nghệ sinh học pháp có hiệu sản xuất thấp Do đó, Eli Lilly phát triển phương pháp cải tiến hơn, phương pháp biểu proinsulin thay biểu chuỗi A B riêng biệt phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A B trypsin carboxypeptidase, tạo thành insulin • Một phương pháp khác phát triển tập đoàn Novo Nordisk, phương pháp biểu miniproinsulin bao gồm chuỗi B chuỗi A nối với acid amin, biểu nấm men, sau xử lý miniproinsulin in vitro trypsin tạo thành insulin Phương pháp có nhiều thuận lợi cầu nối disulfur hình thành trình biểu trình tiết miniproinsulin, miniproinsulin tách chiết tinh dễ dàng tiết thẳng môi trường ni cấy • Mới nhất, Cơng ty Bio-Technology General đưa phương pháp Trong phương pháp này, dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin biểu tế bào E.coli Bằng cách này, hiệu suất trình biểu protein hiệu trình hình thành cầu nốii Sau đó, proinsulin chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin carboxypeptidase B • Các nhà khoa học Anh Mỹ cho biết họ sử dụng tế bào gốc lấy từ máu dây rốn trẻ sơ sinh để giúp bệnh nhân tiểu đường loại khôi phục khả sản xuất insulin thể Theo báo cáo công bố ngày 26/05/2007, chuyên gia cho biết sau năm nghiên cứu, họ có khả phát triển số lượng lớn tế bào gốc từ máu dây rốn sử dụng chúng để thay tế bào sản xuất insulin bị hư hại tuyến tụy bệnh nhân tiểu đường Nhóm nghiên cứu sử dụng dây rốn nơi đặc biệt chứa nhiều tế bào gốc phôi người, dây rốn dễ cung cấp phụ nữ sinh phẫu thuật mở tử cung để bệnh viện khoa Y trường Đại học Texas Nhóm nghiên cứu cho “đây chứng minh tế bào gốc lấy từ dây rốn người sử dụng để tổng hợp insulin” Nghiên cứu GVHD: TS Trần Văn Lư - 26 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Cơng nghệ sinh học vừa giới thiệu tạp chí y học Cell Proliferation, ấn tháng 6/2007 Tiến sĩ Randall Urban, thành viên nhóm nghiên cứu giáo sư nội khoa trường Đại học Texas, phát biểu: “Khám phá mang lại cho khả tiềm tàng việc sản xuất insulin từ tế bào mầm người trưởng thành để điều trị cho bệnh nhân tiểu đường” Theo trưởng nhóm nghiên cứu, giáo sư Larry Denner, chuyên gia nội khoa – nội tiết trường Đại học Texas, tế bào gốc từ dây rốn có khả sản xuất hợp chất có tên C-peptide, chất protein tiền thân insulin diện tế bào sản xuất insulin Do đó, diện C-pep chứng minh có lượng insulin định sản xuất tế bào gốc dùng thay cho tế bào tụy tạng hư hại bị phá hủy” Theo ông, “điều kiện tiên chúng tơi việc sản xuất insulin phải có diện C-peptide” Nhóm nghiên cứu cho biết họ hy vọng tạo mô tụy tạng cho bệnh nhân tiểu đường Ở người bị tiểu đường loại 1, thể họ khơng cịn khả sản xuất insulin tế bào bị phá hủy Bằng phương thức này, việc cấy ghép tế bào quan nội tạng, bác sĩ tránh khó khăn lớn nhất, phản ứng thải loại – tình trạng mà để tránh người ghép phải uống thuốc ức chế miễn dịch suốt đời Trong báo cáo nghiên cứu này, chuyên gia hy vọng tương lai, họ sản xuất phương tiện thay cho tế bào gốc lấy từ phôi người – vấn đề gây nhiều tranh cãi giới Tại Mỹ, Quốc hội nước tranh luận việc có nên tăng ngân sách liên bang cho nghiên cứu tế bào gốc hay không Nhưng người phản đối sử dụng tế bào gốc cho thử nghiệm phôi người điều sai trái, người ủng hộ nói điều cần thiết để tạo nên chuyển biến tích cực nhiều lĩnh vực y học khác • Các nhà khoa học Argentina đạt kết tuyệt vời Họ thành cơng việc ni dưỡng loại bị mà sữa có chứa insulin.Đó lồi bị GVHD: TS Trần Văn Lư - 27 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học biến đổi gien, sinh Trung tâm Nghiên cứu khoa học Boisidus.Cơ thể loại bị có khả tiết insulin người.Theo lời chuyên gia, để cung cấp insulin cho tất người bệnh tiểu đường tuýp Argentina cần 25 bò Hơn việc sản xuất men từ loại sữa bò cho phép giảm giá thành loại thuốc tiểu đường có xuống 30% • Cấy Ðược Tế Bào Sản Xuất Insulin Giáo sư Leo Behie, thuộc Trường Kỹ Sư Sinh Hóa Học Schulich, vừa sáng chế kỹ thuật sản xuất tế bào tuyến tụy tạng sinh kích thích tố insulin Kỹ thuật điều chế thật nhiều tế bào island cells từ lợn Hiện thực Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Dược Phẩm (PPRF, Pharmaceutical Production Research Facility), Ðại Học Calgary, Gia Nã Ðại Các khoa học gia sản xuất tế bào tụy tạng (island cells) người có khả sản xuất insulin.Thành công việc sản xuất island cells giúp điều trị tiểu đường loại trẻ em Cấy tế bào tụy tạng giúp trẻ em tiểu đường loại sản xuất insulin, khơng cần chích insulin ngày Các khoa học gia thành công việc cấy island cells điều trị tiểu đường từ năm 2000 Nhưng lần sản xuất hàng loạt island cells áp dụng rộng rãi điều trị tiểu đường loại Hiện 10% bệnh nhân cấy tế bào tụy tạng tự sản xuất insulin vòng năm sau giải phẫu Nhờ sản xuất thặng dư tế bào tụy tạng nên ghép thêm (booster shots) tế bào tụy tạng cho bệnh nhân, cần, việc điều trị tiểu đường loại GVHD: TS Trần Văn Lư - 28 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học KẾT LUẬN Ngày cơng nghệ sinh học ngày đóng vai trò to lớn đời sống người, người bước ứng dụng công nghệ sinh học vào việc cải tạo thiên nhiện, cải tạo thân người Trong có quy trình tạo Insulin điều hòa trị bệnh tiểu đường người phương pháp công nghệ ADN tái tổ hợp, quy trình cơng nghệ di truyền Quy trình tạo Insulin điều hòa trị bệnh tiểu đường người phương pháp công nghệ ADN tái tổ hợp lĩnh vực ứng dụng quan trọng công nghệ sinh học sản xuất chất có hoạt tính sinh học Mỗi bước đòi hỏi yêu cầu kĩ thuật biện pháp khác nhằm tạo số lượng lớn chủng loại thuốc đa dạng, có chất lượng theo mong muốn, phù hợp với nhu cầu sử dụng người, góp vai trị quan trọng ngành y học nói chung Vấn đề cốt lõi quy trình ứng dụng cơng nghệ ADN tái tổ hợp, sử dụng kĩ thuật để chuyển gen mong muốn từ loài sang loài khác chọn làm vật chủ Tuy nhiên vấn đề sản xuất Insulin ngày cịn có nhiều đề cần bàn cãi, chí phản đối số nhà nhà khoa học Đó vấn đề kháng Insulin phải sử dụng Insulin hết đời người mắc bệnh nên sản xuất Insulin nào, loại nàoủa cao sản xuất cho hợp lí,có hiệu Do nên xuất nhiều cơng trình nghiên cứu đổi quy trình sản xuất Insulin nhận nhiều quan tâm giới, góp phần đẩy lùi bệnh gây suy nhược thể GVHD: TS Trần Văn Lư - 29 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Cơng nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Trần Bình (đồng tác giả) Cơng nghệ sinh học cải tiến giống trồng Nhà xuất Nông nghiệp, 1997 Hồ Huỳnh Thùy Dương Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục 1998 Trịnh Đình Đạt Công nghệ sinh học (công nghệ di truyền) Nhà xuất Giáo dục, 2006 Phạm Thành Hổ Nhập môn công nghệ sinh học Nhà xuất Giáo dục, 2005 Khuất Hữu Khanh Cơ sở phân tử kỹ thuật gen Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà nội, 2005 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi Kỹ thuật di truyền ứng dụng Nhà xuất ĐHQG Hà Nội, 2003 Nguyên Quang Thạch (đồng tác giả) Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp Đại học nông nghiệp, 2004 8.Pham Văn Ty Công nghệ sinh học- tập Nhà xuất giáo dục Vũ Văn Vụ (đồng tác giả) Công nghệ sinh học tế bào Nhà xuất Giáo dục, 2005 GVHD: TS Trần Văn Lư - 30 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học MỤC LỤC Đặt vấn đề Nội dung Khái quát Insulin 1.1 Sơ lược lịch sử phát Insulin 1.2 Cấu trúc phân tử Insulin 1.3 Vai trò Insulin 1.3.1 Insulin trao đổi Hidratcacbon 1.3.2 Insulin trao đổi Lipit 1.3.3 Insulin hoạt động khác 1.4 Sự tổng hợp tự nhiên Insulin thể Khái quát bệnh tiểu đường 10 2.1 Dịch tễ học 10 2.2 Phân loại, nguyên nhân, triệu chứng, hướng điều trị 11 2.2.1 Tiểu đường Typ I 11 2.2.2 Tiểu đường Typ II 13 2.3 Biến chứng 14 Quy trình sản xuất Insulin 14 3.1 Quy trình sản xuất Insulin trước 15 3.1.1 Đặc điểm 15 3.1.2 Nhược điểm 15 3.2 Quy trình sử dụng cơng nghệ ADN tái tổ hợp để sản xuất Insulin 16 3.2.1 Khái qt quy trình cơng nghệ ADN tái tổ hợp 16 3.2.1.1 Phân lập 16 3.2.1.2 Tạo vector tái tổ hợp 17 3.2.1.3 Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào 18 3.2.1.4 Chọn lọc, tạo dòng biểu gen 19 3.2.2 Ý nghĩa sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp sản xuất Insulin 20 3.2.3 Quy trình sản xuất Insulin công nghệ ADN 20 3.2.3.1 Phương pháp 20 3.2.3.2 Phương pháp 24 3.2.4 Các phương pháp sản xuất Insulin khác 25 Kết luận 29 Tài liệu tham khảo .30 GVHD: TS Trần Văn Lư - 31 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng ... trùng QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN: GVHD: TS Trần Văn Lư - 14 - HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học 3.1 Quy trình sản xuất Insulin. .. Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Cơng nghệ sinh học • Chi phí đắt (do cần lượng lớn tụy để sản xuất insulin) • Không thể sản xuất lượng lớn quy mô lớn • Giá thành cao 3.2 Quy trình. .. tử Insulin có hoạt tính dùng chữa bệnh GVHD: TS Trần Văn Lư -4- HVTH: Trần Thị Kim Phượng Quy trình cơng nghệ sản xuất Insulin Tiểu luận Công nghệ sinh học Từ năm 1982, Insulin sản xuất công nghệ