Nghiên cứu sự biến động của glycoprotein thời kỳ có chửa và lactogen nhau thai ở trâu đầm lầy việt nam bubalus bubalis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Văn Hạnh NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA GLYCOPROTEIN THỜI KỲ CÓ CHỬA VÀ LACTOGEN NHAU THAI Ở TRÂU ĐẦM LẦY VIỆT NAM (BUBALUS BUBALIS) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Văn Hạnh NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA GLYCOPROTEIN THỜI KỲ CÓ CHỬA VÀ LACTOGEN NHAU THAI Ở TRÂU ĐẦM LẦY VIỆT NAM (BUBALUS BUBALIS) Chuyên ngành: Mô - Phôi Tế bào học Mã số: 62.42.30.20 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: Hướng dẫn chính: TS Bùi Xuân Nguyên Hướng dẫn phụ: GS.TS Jean Francois Beckers Hà Nội – 2010 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình ảnh, đồ thị vi MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1 Hoạt động sinh sản mang thai trâu đầm lầy 1.1.1 Chăn nuôi trâu Việt Nam 1.1.2 Chu kỳ sinh sản trâu đầm lầy 1.1.3 Môi trường biểu động dục trâu đầm lầy 10 1.1.4 Sự phát triển bào thai 11 1.1.5 Tương quan số đo khác thai 12 1.1.6 Sự phát triển thai động vật nhai lại 14 1.1.7 Hocmon thai 19 1.2 Nghiên cứu glycoprotein thời kỳ có chửa (PAG) 20 1.2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu PAG 20 1.2.2 Chức PAG 24 1.2.3 Biểu PAG động vật nhai lại 25 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu lactogen thai 27 1.3.1 Tổng quan tài liệu PL 27 1.3.2 Chức PL 30 1.3.3 Biểu PL động vật nhai lại 32 iii Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Động vật thí nghiệm 33 2.2 Thu thập mẫu vật 34 2.2.1 Thu mẫu từ lò mổ 34 2.2.2 Phương pháp đo thai 35 2.2.3 Gây động dục đồng pha trâu nông hộ 37 2.2.4 Thu mẫu máu từ trâu nông hộ 38 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio immunoassay – RIA) 38 2.3.1 Kháng nguyên 38 2.3.2 Chuẩn bị kháng thể 39 2.3.3 Chuẩn bị kháng thể thứ cấp 39 2.3.4 Chuẩn bị PAG đánh dấu phóng xạ 40 2.3.5 Chuẩn bị rbPL đánh dấu phóng xạ 41 2.3.6 Chuẩn bị đường chuẩn 42 2.3.7 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) 43 2.3.8 Kiểm tra độ nhạy 44 2.3.9 Kiểm tra tính tương đồng 44 2.4 Phương pháp Elisa 45 2.4.1 Tạo phân lập IgG 45 2.4.2 Sự kết hợp IgG – Biotine 46 2.4.3 Xác định độ pha loãng tối ưu cho kháng thể gắn enzyme 46 2.4.4 Phương pháp ELISA kẹp gián tiếp cho định lượng PAG 46 2.5 Phân tích số liệu 48 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Phát triển trước sinh trâu đầm lầy 49 3.1.1 Kích cỡ bào thai 49 iii 3.1.2 Tương quan chiều dài đầu đuôi với số đo khác 53 3.1.3 Tương quan khối lượng thai với số đo khác 60 3.2 Thiết lập hệ thống RIA cho việc định lượng PAG trâu đầm lầy 65 3.2.1 Hệ thống RIA với phương pháp có ủ trước kháng thể 66 3.2.2 Hệ thống RIA sử dụng phương pháp không ủ trước kháng thể 68 3.2.3 Hàm lượng PAG trâu đầm lầy định lượng ba hệ thống RIA 71 3.2.4 Tương quan hàm lượng PAG trâu tuổi thai ước lượng 78 3.2.5 Định lượng PAG mẫu máu bò kháng thể kháng PAG khác loài 3.3 Thiết lập hệ thống sandwich ELISA cho định lượng PAG 3.3.1 Tối ưu phương pháp sandwich ELISA 83 86 86 3.3.2 Tương quan hàm lượng PAG trâu loại mẫu định lượng phương pháp ELISA RIA 90 3.3.3 Định lượng hàm lượng PAG hệ thống ELISA 98 3.3.4 Chẩn đốn có thai sớm trâu phương pháp định lượng PAG 3.4 Hàm lượng PL trâu đầm lầy 3.4.1 Thiết lập phương pháp định lượng PL trâu đầm lầy 99 101 101 3.4.2 Hàm lượng PL loại mẫu khác trâu đầm lầy 104 3.4.3 Tương quan hàm lượng PL với tuổi thai ước lượng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105 112 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 iii MỞ ĐẦU Việt Nam nước có kinh tế nơng nghiệp (nguồn thu chủ yếu từ trồng trọt chăn nuôi) khoảng 60,5% lao động hoạt động lĩnh vực nông nghiệp Sản lượng chăn nuôi chiếm khoảng 18,6% tổng sản phẩm nội địa (GDP) củaViệt Nam Đàn gia súc chăn nuôi Việt Nam chiếm khoảng 20% đàn trâu, 13% đàn bị 5% đàn dê nước Đơng Nam Á Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo, vốn phổ biến bò áp dụng hạn chế trâu Tỉ lệ chết phôi trâu sau gây động dục đồng pha thụ tinh nhân tạo cao từ 22,9 đến 49% Đây nguyên nhân làm cho tỉ lệ sinh sản trâu thấp khoảng cách hai lứa đẻ bị kéo dài Gần đây, protein giai đoạn mang thai nghiên cứu có ứng dụng hiệu chẩn đoán mang thai đánh giá trạng thái phát triển thai bò, dê cừu Tuy nhiên, trâu đầm lầy nói chung trâu chăn ni điều kiện Việt Nam nói riêng lĩnh vực cần nghiên cứu Mục tiêu luận án: Mục tiêu chung luận án đánh giá khả áp dụng phương pháp định lượng hocmon PAG lactogen trâu đầm lầy Việt Nam nhằm mục đích chẩn đốn có chửa sớm cung cấp thông tin biến động hocmon trình mang thai Kết nghiên cứu protein hocmon thời kỳ có chửa biểu chúng trâu đóng góp quan trọng liên quan đến kiến thức sinh sản trâu đầm lầy Ngoài ra, luận án nghiên cứu kết hợp việc áp dụng chẩn đoán mang thai sớm với kỹ thuật gây động dục đồng loạt nhằm rút ngắn khoảng cách hai lứa đẻ tăng hiệu kinh tế chăn nuôi trâu Nội dung nghiên cứu: Luận án thực nhằm đạt nội dung sau: Hiểu mối quan hệ số đo kích thước thai: chiều dài, chu vi đầu, thân, dài chân…trong trình phát triển thai trâu đầm lầy Cung cấp thông tin hàm lượng protein thời kỳ có chửa (PAG) huyết trâu mẹ, thai, dịch ối, dịch niệu trâu đầm lầy thời điểm mang thai khác Tạo lập phương pháp ELISA cho định lượng PAG trâu đầm lầy Việt Nam Thu thập thông tin hàm lượng lactogen thai huyết trâu mẹ, thai, dịch ối, dịch niệu, nước tiểu trâu mẹ trình mang thai Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án: Kết nghiên cứu luận án không bổ sung thông tin khoa học quan trọng liên quan đến phát triển trước sinh biến động hai hocmon protein quan trọng trâu đầm lầy mà mở khả ứng dụng kết vào việc nâng cao suất sinh sản chăn nuôi trâu Ứng dụng thành công kết nghiên cứu góp phần hỗ trợ người chăn ni quản lý có hiệu hoạt động sinh sản đàn trâu Đóng góp quan trọng khác kết luận án giúp cho bác sĩ thý y nhà nghiên cứu có thêm sở khoa học cần thiết chẩn đoán liên quan đến trạng thái sinh lý bệnh lý trình mang thai Những điểm luận án: Lần trình bày liệu liên quan đến phát triển trước sinh trâu đầm lầy Lần có thơng tin hàm lượng PAG trâu đầm lầy dịch phân tích khác Trình diễn khả ứng dụng phương pháp ELISA vào định lượng PAG áp dụng kết vào chẩn đoán mang thai sớm trâu Cung cấp thông tin hàm lượng PL dịch phân tích khác trâu đầm lầy Bố cục luận án Luận án gồm 141 trang, 38 bảng, 54 hình, 192 tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh tiếng Pháp Bố cục luận án gồm: Mở đầu (03 trang), tổng quan tài liệu (30 trang), vật liệu phương pháp nghiên cứu (16 trang), kết nghiên cứu thảo luận (62 trang), kết luận kiến nghị (03 trang), danh mục cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (2 trang) tài liệu tham khảo (25 trang) Chương TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1 Hoạt động sinh sản mang thai trâu đầm lầy Mặc dù trâu động vật động dục quanh năm, nhiên hiệu suất sinh sản chúng khác biệt lớn vào thời điểm khác năm Rất nhiều nghiên cứu biểu động dục, tỷ lệ đậu thai tỷ lệ đẻ trâu thay đổi rõ ràng theo mùa Điều ảnh hưởng thời kỳ “nghỉ” dài hai lứa đẻ; trâu đẻ ngồi mùa sinh sản khởi động lại hoạt động buồng trứng vào mùa sinh sản So với trâu sông, trâu đầm lầy có chu kỳ động dục 21 ngày thời gian mang thai trâu đầm lầy dài (330 ngày so với 300 ngày trâu sông) Những vấn đề mang thai chết phôi, chết thai sảy thai nguyên nhân cho việc mang thai thất bại Đây nguyên nhân làm giảm tỷ lệ sinh sản kéo dài khoảng cách lứa đẻ trâu 1.2 Nghiên cứu PAG Glycoprotein thời kỳ có chửa (Pregnancy associated glycoproteins PAGs) thuộc họ lớn glycoprotein tổng hợp từ tế bào mặt thai động vật nhai lại Quá trình tổng hợp biến động theo thời gian có chửa (Sousa cs., 2006) Hiệu việc áp dụng PAGs chẩn đốn có chửa sớm chứng minh Theo Gonzlez cs., (2004) kỹ thuật chẩn đốn có chửa dê từ ngày thứ 20 thai kỳ với độ xác 76,6%, cao so với dùng phương pháp siêu âm 55,7%, đó, thời điểm khơng thể xác định có chửa kỹ thuật định lượng progesteron (P4) Ở bò, kỹ thuật định lượng PAG ứng dụng để chẩn đốn mang thai từ ngày thứ 28 Với kết này, kỹ thuật định lượng PAG phổ biến để chẩn đoám mang thai nước Châu Âu Bắc Mỹ 1.3 Nghiên cứu lactogen thai Ở loài động vật linh trưởng, gặm nhấm nhai lại lactogen thai tiết từ thai vào máu mẹ thai Hàm lượng lactogen máu thai máu mẹ loài khác Hàm lượng lactogen máu cừu cao lại thấp máu bò (Byatt cs., 1987) Hàm lượng lactogen máu dê cừu mẹ cao từ 100 đến 1000 lần so với hàm lượng lactogen máu bị Cho đến nay, khơng có thơng tin hàm lượng lactogen máu trâu Tuy nhiên, chúng tơi nhận định dùng kháng thể kháng lactogen bò để định lượng lactogen trâu nghiên cứu biến động hàm lượng lactogen trình mang thai trâu đầm lầy Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Động vật nghiên cứu Trâu Việt Nam thuộc loài trâu đầm lầy (Bubalus bubalis carabanensis), loài trâu nước (Bubalus bubalis) Mẫu thu bảo quản theo Beckers (1982) Kích thước thai trâu tiến hành đo theo Joubert (1956) Singh cs (1963) 2.2 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) Phương pháp miễn dịch phóng xạ định lượng PAG thực theo Zoli cs (1992) có thay đổi phù hợp với phân tích mẫu vật trâu Gắn kết Iot phóng xạ (NaI125, PerkinElmer, Boston, USA) thực theo phương pháp sử dụng chloramine T (Greenwood cs., 1963) Phương pháp định lượng PL theo Beckers (1988) 2.3 Phương pháp Elisa Phương pháp ELISA sử dụng để định lượng PAG phương pháp indirect sandwich thực theo Green cs (2005) có cải tiến phù hợp với đối tượng trâu 2.4 Phân tích số liệu Số liệu hàm lượng PAG thể theo dạng Trung bình (M) ± sai số tiêu chuẩn (SD) Với phương pháp số liệu so sánh Student’s test (t-test) Phương pháp hồi quy đánh giá Office Excel có tham khảo cơng trình khoa học uy tín lĩnh vực tương tự Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mối tương quan kích thước thai trước sinh 3.1.1 Sự phân bố mẫu vật trình mang thai Bảng 3.1 trình bày kết đo 17 chi tiêu thai trâu Giá trị trung bình trình bày theo khoảng thời gian tháng 3.1.2 Tương quan chiều dài đầu đuôi thai (CRL) số đo khác Mối tương quan CRL với chiều dài thai trình bày bảng 3.2 Hệ số tương quan cao khơng có khác hai giới (P