Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật elisa trong bộ kit chẩn đoán bệnh gạo heo cysticercus cellulosae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ QUANG ĐANG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA TRONG BỘ KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH GẠO HEO CYSTICERCUS CELLULOSAE Chuyên ngành: Xét nghiệm Y học Mã số: 60 72 03 33 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC Hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS VŨ QUANG HUY TP Hồ Chí Minh – Năm 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả LÊ QUANG ĐANG MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình MỞ ĐẦU MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn Enzym 1.1.1 Thành phần kỹ thuật ELISA 1.1.2 Thực kỹ thuật ELISA 1.1.3 Các công trình nghiên cứu kỹ thuật ELISA 1.2 Bệnh Cysticercus cellulosae 1.2.1 Lƣợc sử bệnh Cysticercus cellulosae 1.2.2 Hình thể Cysticercus cellulosae 1.2.3 Chu trình phát triển 11 1.2.4 Đặc điểm dịch tễ bệnh Cysticercus cellulosae 13 1.2.5 Miễn dịch học bệnh Cysticercus cellulosae: 16 1.2.6 Biểu lâm sàng cận lâm sàng: 16 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nghiên cứu xác định giá trị chẩn đoán huyết kỹ thuật ELISA 21 2.1.1 Xác định độ pha loãng cộng hợp, nồng độ kháng nguyên hiệu giá kháng thể 21 2.1.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật ELISA 26 2.1.3 So sánh kết xét nghiệm phát kháng thể kháng C.cellulosae kỹ thuật ELISA vàobộ Kit công ty DAG 27 2.2 Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng dịch tễ bệnh C.cellulosae 28 2.2.1 Đặc điểm lâm sàng 28 2.2.2 Đặc điểm cận lâm sàng 29 2.2.3 Đặc điểm dịch tễ 30 2.2.4 Thiết kế nghiên cứu: tiền cứu nghiên cứu chùm ca bệnh 31 2.2.5 Cỡ mẫu 31 2.2.6 Chọn mẫu 32 2.2.7 Đối tƣợng nghiên cứu 32 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Kết nghiên cứu 33 3.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dƣơng, giá trị tiên đoán âm kỹ thuật ELISA 45 3.3 So sánh kết xét nghiệm phát kháng thể kháng C cellulosae kỹ thuật ELISA kit DAG 46 Chƣơng BÀN LUẬN 47 4.1 Về nghiên cứu xác định giá trị chẩn đoán huyết kỹ thuật ELISA 47 4.1.1 Xác định thành phần kỹ thuật ELISA 47 4.1.2 Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dƣơng, giá trị tiên đoán âm kỹ thuật ELISA 50 4.1.3 So sánh kết xét nghiệm kỹ thuật ELISA kit DAG 54 4.2 Về nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng đặc điểm dịch tễ bệnh Cysticercus cellulosae 54 KẾT LUẬN 56 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BV : Bệnh viện C cellulosae : Cysticercus cellulosae CT scan : Computerized tomography scanner Chụp điện toán cắt lớp BCAT : Bạch cầu toan DNT : Dịch não tủy ELISA : Enzyme – Linked Immuno- Sorbent Assay Phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn enzim HT : Huyết KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể MRI : Magnetic resonance imagine Chụp cộng hƣởng từ OD : Optical density Mật độ quang OD+ : Trị số OD trƣờng hợp bệnh Cysticercus cellulosae OD- : Trị số OD trƣờng hợp không bệnh Cysticercus cellulosae DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Trị số OD theo nồng độ KN, hiệu giá KT độ pha loãng cộng hợp 34 Bảng 3.2: Trị số OD kỹ thuật ELISA sử dụng KN dịch nang 36 Bảng 3.3 So sánh trị số OD kỹ thuật ELISA dùng KN dịch nang với HT bệnh ký sinh trùng khác 38 Bảng 3.4: Trị số OD theo nồng độ KN hiệu giá KT 40 Bảng 3.5: Trị số OD 46 mẫu HT nhóm chứng 42 Bảng 3.6 Kết ELISA 140 mẫu HT đƣợc xác định chẩn đoán 45 Bảng 3.7 Kết xét nghiệm kỹ thuật ELISA vào kit DAG .46 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1: Tỉ số OD+/OD-theo hiệu giá KT độ pha loãng cộng hợp 35 Biểu đồ 3.2: Tỉ số OD+/OD- theo hiệu giá KT sử dụng KN dịch nang 37 Biểu đồ 3.3: Tỉ số OD+/OD-theo nồng độ KN hiệu giá kháng thể .41 DANH MỤC CÁC HÌNH - ẢNH Trang Hình Hình 1.1 Kỹ thuật ELISA Hình 1.2 Trứng Taenia solium 10 Hình 1.3 Đầu Taenia solium, C cellulosae .11 Hình 1.4 Chu trình lây nhiễm sán dãi heo 11 Hình 1.5 Tóm tắt chu trình phát triển sán dải heo phƣơng pháp chẩn đoán 12 Ảnh Ảnh 3.1: Kết phản ứng KN-KT với chất giá nhựa 39 Ảnh 3.2: Các băng protein đặc hiệu bệnh C cellulosae .44 Ảnh minh họa Hình ảnh: Gạo heo Plate ELISA .58 Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae 59 Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae .59 Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae tồn thân 60 Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae toàn thân 61 Nang C.cellulosae dƣới da 61 Hình ảnh soi thấy ấu trùng sán đáy mắt 62 Tiểu phẩu bóc tách nang ấu trùng .62 Hình ảnh vi thể nang ấu trùng 63 Hình nang sán gây u não chẩm phải 63 MRI: hình ảnh tổn thƣơng ứ nƣớc ảnh hƣởng vỏ chất xám vỏ não dƣới vỏ .64 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh GẠO HEO (Cysticercus cellulosae) ngƣời bệnh tự nhiễm nuốt phải trứng Taenia solium Cùng với bệnh Taenia solium, bệnh Cysticercus cellulosae bệnh phổ biến nƣớc phát triển Theo nhận định Burneo, Gacia, Takayanagui O.M (2001) giới có khoảng 2,5 triệu ngƣời mắc bệnh Taenia solium, 20 triệu ngƣời mắc bệnh Cysticercus cellulosae có khoảng 50.000 ngƣời chết năm bệnh [28],[45] Theo tài liệu Tổ chức Y tế giới bệnh Cysticercus cellulosae phổ biến nƣớc Châu Á, Châu Phi Châu Mỹ latinh Theo nghiên cứu tỉ lệ mắc Cysticercus cellulosae ngƣời giới từ 0,7% - 22,6% [20],[22],[23], [25], [26],[28] Tại Việt Nam theo kết điều tra Viện Ký sinh trùng sốt rét côn trùng tỉ lệ mắc Cysticercus cellulosae vùng đồng từ 0,5-2%, vùng trung du miền núi từ 3,8-6% Bệnh gạo heo Cysticercus cellulosae theo nghiên cứu Annette E cs tỉnh Bắc Ninh tỉ lệ phát kháng thể kháng Cysticercus cellulosae 5,7% [1], [20] Gạo heo Cysticercus cellulosae gây bệnh cơ, dƣới da, mắt, hệ thần kinh trung ƣơng Bệnh Cysticercus cellulosae dƣới da đƣợc chẩn đoán trực tiếp phƣơng pháp sinh thiết Bệnh Cysticercus cellulosae nội tạng khó chẩn đốn khơng thể thực sinh thiết đƣợc, bệnh chẩn đốn đƣợc hình ảnh học nhƣ CT scan, MRI nhƣng chẩn đốn hình ảnh học đắt tiền khó chẩn đốn phân biệt với tổn thƣơng nguyên nhân khác [3],[9] Để góp phần chẩn đốn bệnh Cysticercus cellulosae, nhà khoa học có xu hƣớng dùng kỹ thuật huyết chẩn đoán nhƣ kỹ thuật cố 57 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu KN sử dụng kỹ thuật ELISA cách phân tích KN tồn phần từ KN dịch nang, từ tách đƣợc KN đặc hiệu Trong hoàn cảnh nƣớc ta, trang thiết bị không nhiều, dùng kỹ thuật ELISA với KN dịch nang điều chế từ Cysticercus cellulosae với tất khả có đƣợc, xác định đƣợc độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dƣơng, giá trị tiên đoán âm thu đƣợc kết khả quan Nếu kết cơng trình đƣợc tin cậy, đƣợc áp dụng để phục vụ nghiên cứu khoa học sử dụng sở y tế nƣớc sau đƣợc cấp phép lƣu hành quan chức 57 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA 58 Hình ảnh: - Gạo heo - Plate ELISA 59 Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae 60 Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae tồn thân 61 Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae toàn thân Nang C.cellulosae dƣới da 62 Hình ảnh soi thấy ấu trùng sán đáy mắt Tiểu phẩu bóc tách nang ấu trùng 63 Hình ảnh vi thể nang ấu trùng Hình nang sán gây u não chẩm phải 64 MRI: hình ảnh tổn thƣơng ứ nƣớc ảnh hƣởng vỏ chất xám vỏ não dƣới vỏ TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn Đề cs (2001), “Nghiên cứu dịch tễ chẩn đoán điều trị bệnh ấu trùng sán dải lợn Bắc Ninh”, Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, tr 87-93 Nguyễn Văn Đề cs (2001), “Thông báo loài sán dây (Taenia asiatica) ký sinh ngƣời Hà Nội, Việt Nam”, Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, tr 80-86 Trần Kim Ngọc, Phạm Văn Ý, Nguyễn Hữu Hoàn, Vũ Anh Nhị (2001), “Hình thái lâm sàng nhiễm ký sinh trùng hệ thần kinh trung ƣơng”, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, tập 5, phụ 4, tr 210-219 Trần Vinh Hiển, Trận Thị Kim Dung (1997), “Nhân 23 trƣờng hợp bệnh gạo ngƣời phát phƣơng pháp huyết miễn dịch học”, Cơng trình nghiên cứu khoa học Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, tr 32-35 Trần Vinh Hiển (1991), Ký sinh học, trƣờng Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Võ Văn Huy, Võ Hồng Lan, Hoàng Trọng (1997), Ứng dụng SPSS for window để xử lý phân tích liệu nghiên cứu, NXB khoa học kỹ thuật Trần Xuân Mai (1983), “Bạch cầu toan tính bệnh ký sinh trùng”, Nội san Y khoa 1(6), tr 106-110 Trần Xuân Mai, Trần Thị Kim Dung, Ngơ Hồng Dũng, Lê Thị Xn, Phan Anh Tuấn (2002), “Tăng bạch cầu toan tính bẹnh ký sinh trùng”, Ký sinh trùng Y học NXB Đà Nẵng, tr 492-501 Vũ Anh Nhị (2001), “Viêm màng não bán cấp sán dải heo”, Thần kinh học lâm sàng điều trị, NXB Cà Mau, tr.457-464 10 Lê Hoàng Ninh (1995), “Dịch tễ học khống chế bệnh tật”, Dịch tễ học bản, NXB Y học Thành phố Hồ Chí Minh, tr 267-285 11 Nguyễn Xuân Phách (1995), “Tính cỡ mẫu”, Thống kê Y học, NXB Y học tr 130-139 12 Nguyễn Thị Minh Tâm, Phạm Hoàng Thế, Phạm Văn Thân, Phạm Trí Tuệ, Hồng Tân Dân, Trƣơng Kim Phƣơng, Phan Thị Hƣơng Liên (1998), “Bệnh ấu trùng sán lợn”, Ký sinh trùng Y học, NXB Y học, Hà Nội, tr 218-226 13 Lê Văn Thành (1992), “Các phƣơng pháp thăm dò chức xét nghiệm dịch não tủy”, Bệnh học thần kinh, NXB Y học, tr 300305 14 Ngô Đăng Thục, Ngô Đức Hinh, Nguyễn Chƣơng (1999), “Kén sán não: số kinh nghiệm chẩn đốn điều trị”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, chuyên đề thần kinh học, 3(3), tr 10-16 15 Hứa Văn Thƣớc cs (2001), “Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ kết điều trị nang ấu trùng sán dây lợn ngƣời Bệnh viện Đa khoa Trƣơng Thái Nguyên”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, chuyên đề ký sinh trùng, Phụ tập 5, số 1, tr 55-58 16 Phạm Trí Tuệ (1997), “Đánh giá hiệu áp dụng kỹ thuật miễn dịch để chẩn đoán số bệnh ký sinh trùng”, Kỉ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học, tr 100-108 17 Phạm Trí Tuệ, Nguyễn Thị Minh Tâm (1991), “Điều chế thăm dị tính đặc hiệu kháng ngun ấu trùng sán lợn ứng dụng phản ứng miễn dịch men ELISA chẩn đoán bệnh ấu trùng sán lợn ngƣời”, Tạp chí Y học thực hành, 4, tr 23-28 18 Phan Anh Tuấn, Trần Thị Kim Dung,Vũ Anh Nhị (2001), “Ứng dụng kỹ thuật chẩn đoán ELISA để xác định thể lâm sàng bệnh ấu trùng sán dải heo ngƣời” Tạp chí Y học chuyên đề Ký sinh trùng 19 Phan Anh Tuấn (2004) với cơng trình: “Ứng dụng kỹ thuật ELISA kháng ngun dịch nang để chẩn đoán Cysticercus cellulosae đặc điểm bệnh bệnh viện TP Hồ Chí Minh năm 1992 – 2000” Luận văn Tiến sĩ Khoa học Y dƣợc TIẾNG NƢỚC NGOÀI 20 Annette E et al (2002), “Taenia solium cysticercosis in a village in Northern Viet Nam: seroprevalence study using an ELISA for detecting circulating antigen” Trans Roy Soc Trop Med Hyg, 96, pp 270-272 21 Balogou et al (2000), “Cysticercose et epilepsie au nord du Togo dans la Tone”, Revue Neurologique (Paris), pp270-273 22 Baily G.G (1998), “Serological diagnosis of neurocysticercosis: evaluation of ELISA test sung cyst fluid and orther compoment of Tacnia solium custicerci as antigen” Trans R Soc Trop Med Hyg, 82, pp 295-299 23 Baily G.G (1996), “Cysticercosis”, Manson’ s tropical disease WB Saunder Company Ltd, pp 1501-1516 24 Barcelos I.S et al (2001), “Detection of IgG in cerebrospinal fluid for diagnosis of neurocysticercosis: coaluation of saline and SDS extracts from Taenia solium and Taenia crassiceps metacestodes by ELISA and immunoblot assay” Trop Med Int Health, (3), pp 219-226 25 Brant, Cong de, Pdorny, Erhart, et al (2000), “Taenia solium cysticercosis in Northern Viet Nam” Join International Tropical Medicine Meeting 2000 The Royal Rive Hotel, Bangkok Thailand, pp 95 26 Bueno E.C et al (2000), “Specific taenia crassiceps and Teania solim antigenic peptides for neurocysticercosis immunodiagnosis using serum samples” J Clin Microbiol, 38 (1), pp 146-151 27 Bueno E.C et al (2000), “Detection of IgG, IgA and IgE antibodies in cerebrospinal fluid, serum and saliva samples by ELISA with Tania solium and Taenia crassiceps antigens” Arq neurospiquiatr, 58 (1), pp 18-24 28 Burneo, Garcia (2001), “Neurocysticercosis” Emedical J, 3, pp 1-20 29 Costa J.M (1986), “Immunoenzymatic test (ELISA) in the diagnosis of neurocysticercosis: a study of various antigenic extracts in the detection of IgG antibodies in serum and cerebrospinal fluid samples” Arq Neropiquiatr, 44(1), pp 15-31 30 Dekumyoy P et al (1998), “Use of delipidized antigens of Taenia solium metacetodes in IgG ELISA for detection of neurocysticercosis” Southeast Asian J Trop Med Public Health, 29(3), pp 572-578 31 Diwan A., Coker Vann M, et al (1982), “Enzyme-liked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibody to cysticerci of Taenia solium” Am J Trop Med Hyg, 31, pp 364-369 32 Dumas M et al (1990), “Cysticercose et neurocysticercose: enquete epidemiologique dans le nord du Togo”, Bull.Soc.Pathol Exot, 83, pp.263-274 33 Grunitzky et al (1995), “La cysticercose chez des malades neurologiques en milieu hospitalier a lome, Togo” Annalesde medicineltern, 146, pp 419-422 34 Grunitzky et al (1995), “La cysticercose chez des malades neurologiques en milieu hospitalier lomé togo” Annales de Médicine Intern, 146, pp 419-422 35 Garcia N J et al (2001), “An epidermiological study of epilepsy and epileptic seizure in two rural Guatemalan communities,Ann- TropMed- Parasitol, 95(3),pp 167-175 36 Garcia H.H et al (1991), “Diagnosis of cysticercosis in endemic region” Lancet, 338, pp 549-551 37 Garcia H.H et al (1994), “Discrepancies between cerebral computed tomography and Western Blot in the diagnosis of neurocysticercosis” Am J Trop Med Hyg, 50(2), pp 152-157 38 Molinari J.L et al (1998), “Impairment of the inflammatory reaction on implanted Taenia solium metacestode in mice: a scanning electron microscopy study” Parasitol Res 84(3), pp 173-180 39 Molinari J.L et al (2002), “Discrimination between active and inactive neurocysticercosis by metacestode excretory/secretory antigens of Taenia solium in an enzyme-linked immunosorbent assay” Am J Trop Med Hyg, 66(6), pp 777-781 40 Nguyen Van De , hoa le , phan thi huong lien and keeseon s eom(2014) , Curent status of Taeniasis and cysticercus in Vietnam Korean J Parasitol, 2014 apr, 52(2) , pp 125-129 41 Shika et al (1991), “Sero-epidermological studies of cysticercosis in school children from two sural areas of Transkei, South Africa” Annal of Tropical Medicine and Parasitology, 85, pp 349-355 42 Shiguekawa K.Y et al (2000), “ELISA and Western Blotting test in the detection of IgG antibodies to Tania solium metacestode in serum samples in human neurocysticercosis” Trop Med In Health, 5(6), pp 443-449 43 Silva A.D et al (2000), “A quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the immunodiagnosis of neurocysticercosis using a purified fraction from Taenia solium cysticerci” Diagn Microbiol Infect Dis, 37(2), pp 87-92 44 Sloan L, Schneider S, et al (1995), “Evaluation enzyme-linked immunoassay for serological diagnosis of cysticercosis” J Clin Microbiol, 33(120), pp 3124-3128 45 Takayanagui O.M, Leite J.P (2001), “Neurocysticercosis” Rev Soc Bras Med Trop, 34(3), pp 283-290 46 Wang K.H, Xu Z.Y, et al (1997), “Comparative study on antigens of cysticercus cellulosae by EITB and ELISA” Clin J Parasitol Parasit Dis, 11, pp 53-56 47 Wilson M, Bryan R.T, et al (1997), “Clinical evaluation of the cysticercosis enzym-linked immunoelectro-transfer blot assay (EITB) in patients with neurocysticercosis” J Infect Dis, 164, pp 107-109 48 Xu L, et al (1995), “Characteristics and present trends in endemicity of human parasitic diseases in China” Chung Kuo Chi Sheng Chung Hsuh Yu Chi Sheng Chung Ping Tsa Chih, 13(3), pp 214-217 ... kỹ thuật ELISA Kit chẩn đoán bệnh gạo heo Cysticercus cellulosae MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu tổng quát Xác định giá trị chẩn đoán bệnh Cysticercus cellulosae kit kỹ thuật ELISA bệnh nhân bệnh. .. học nghiên cứu kỹ thuật ELISA để chẩn đoán bệnh ký sinh trùng, có bệnh gạo heo Cysticercus cellulosae, [12],[17],[5] Chúng nghiên cứu vấn đề sử dụng kháng nguyên dịch nang để thực kỹ thuật ELISA. .. trị chẩn đoán Các xét nghiệm: - Xét nghiệm máu thấy bạch cầu toan tính tăng - Xét nghiệm dịch não tủy - Kỹ thuật huyết chẩn đoán (các kết nghiên cứu kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh Cysticercus cellulosae