Khao sat hoat tinh uc che men glucosidase cao chiet hat muop dang

Các chất có tác dụng ức chế men glucosidase đã được dùng làm thuốc hạ đường huyết bằng đường uống nhằm kiểm soát sự tăng đường huyết ở các bệnh nhân tiểu đường type 2 – không phụ thuộc vào insulin. Cao chiết bởi các dung môi khác nhau từ hạt mướp đắng đã được khảo sát tác dụng ức chế theo cơ chế này. Kết quả khảo sát bước đầu cho thấy, cao cồn có tác dụng ức chế mạnh nhất (IC50 =31,25μgml), cao clorofom có tác dụng yếu hơn, trong khi cao ete petrol không thể hiện hoạt tính.hạt mướp đắng, ức chế men glucosidase, khảo sát hoạt tính ức chế men glucosidase từ cao chiết hạt mướp đắng

Tạp chí Khoa học 2007:7 130-137 Trường Đại học Cần Thơ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN -GLUCOSIDASE CỦA CÁC CAO CHIẾT HẠT MƯỚP ĐẮNG Phạm Thị Diệu Hạnh1, Phùng Văn Trung2, Nguyễn Ngọc Hạnh2 Nguyễn Đông Trúc2 ABSTRACT Agents with -glucosidase inhitbitory activity have been useful as oral hypoglycemia in patients with type 2, non-insulin dependent, diabetes melitus Some extracts of different solvents from the seed of Momordica charantia L were investigated Preliminary results showed that the alcohol extract gives the greatest glucosidase inhitbitory activity (IC50=31,25 µg/ml); chloroform extract is weakly and the etherpetroleum extract is inactivity Keywords: Momordica charantia L., α-glucosidase, diabetes melitus Title: Investigation on -glucosidase inhibitory activity of some extracts from the seeds of Momordica charantia L TĨM TẮT Các chất có tác dụng ức chế men -glucosidase dùng làm thuốc hạ đường huyết đường uống nhằm kiểm soát tăng đường huyết bệnh nhân tiểu đường type – không phụ thuộc vào insulin Cao chiết dung môi khác từ hạt mướp đắng khảo sát tác dụng ức chế theo chế Kết khảo sát bước đầu cho thấy, cao cồn có tác dụng ức chế mạnh (IC50 =31,25µg/ml), cao clorofom có tác dụng yếu hơn, cao ete petrol khơng thể hoạt tính Từ khố: Mướp đắng, Momordica charantia L., α-glucosidase, tiểu đường ĐẶT VẤN ĐỀ Chứng tăng đường huyết cao sau ăn đóng vai trò quan trọng tiến triển bệnh tiểu đường type 2, phương pháp ức chế men -glucosidase điều trị tiểu đường type phương pháp sử dụng phổ biến Cơ chế phận tiêu hóa khơng tham gia tụy tạng Các thuốc ức chế men -glucosidase có mặt thị trường nhóm thuốc Arcabose Voglibose Phương pháp in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế men -glucosidase dựa nguyên tắc: men -glucosidase gặp nối -D-glucose cắt đứt nối để giải phóng đường D-glucose Hoạt động sản sinh nhiều glucose sau ăn làm gia tăng hàm lượng glucose máu, cần ức chế hoạt động men -glucosidase để làm chậm chuyển hoá số loại thức ăn thành glucose Vì vậy, người ta sử dụng chất có liên kết  với đường D-glucose như: p- Đại học Cần Thơ Viện Cơng nghệ Hóa học 130 Tạp chí Khoa học 2007:7 130-137 Trường Đại học Cần Thơ Nitrophenyl--D-glucopyranoside, maltose… để xây dựng phương pháp thử hoạt tính ức chế men -glucosidase phịng thí nghiệm Trong báo cáo này, xây dựng phương pháp thử hoạt tính ức chế men glucosidase chất p-Nitrophenyl--D-glucopyranoside khảo sát yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện tối ưu Trên sở đó, khảo sát hoạt tính ức chế số cao chiết từ hạt Mướp Đắng (Momordica charantia L.) trồng Việt Nam ĐỐI TƯỢNG VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Trái mướp đắng thu mua tai khu vực Thành phố Hồ Chí Minh trái già, gần chín tách lấy hạt Chọn lấy hạt già, sấy đến trọng lượng không đổi 60oC 2.2 Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình thử hoạt tính ức chế men α-glucosidase phịng thí nghiệm Khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase cao chiết từ hạt mướp đắng PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Hoá chất - A Dung dịch p-Nitrophenyl--D-glucopyranoside (PNP-Glc) 1mM (pha nước khử ion) (Merck) - Dung dịch p-Nitrophenol (PNP) chuẩn 0,1mM (Merck) -  - glucosodase (-glc) 0,9 U/ml (pha nước khử ion lạnh) (Sigma) - Đệm phosphat pH 6,8 (Prolabo) - Đệm natricacbonat pH 9,6 (Prolabo) - Cao chiết - Nước khử ion 3.2 Thiết bị - Spectrophotometer DR 2000 - Incubator KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng quy trình thử nghiệm 4.1.1 Nguyên tắc p-Nitrophenyl--D-Glucopyranoside α-Glucosidase -D-Glucose + p-Nitrophenol Theo phản ứng, lượng glucose sinh tỉ lệ với PNP Vì đo độ hấp thu PNP 400nm để xác định lượng glucose sinh So sánh hàm lượng glucose 131 Tạp chí Khoa học 2007:7 130-137 Trường Đại học Cần Thơ sinh mẫu có chất ức chế mẫu khơng có chất ức chế để xác định % ức chế Dựng đường biểu diễn % ức chế nồng độ chất ức chế để xác định số IC50 Điều kiện phản ứng: T=37oC, pH = 6,8 Các bước tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch thử chuẩn (enzym, chất nền, dung dịch đệm, chất ức chế…) - Trộn lẫn dung dịch gồm: đệm pH 6,8; enzym; chất ức chế với thể tích định trước - Hoạt hoá hỗn hợp 37oC thời gian Ta - Thêm chất nền, trì phản ứng 37oC, thời gian Tr - Kết thúc phản ứng đệm pH 9,6 - Đo độ hấp thu A 400nm, dựa vào đường chuẩn để xác định lượng glucose sinh ra, từ xác định % ức chế suy số IC50 4.1.2 Xây dựng đường chuẩn Pha dung dịch PNP có nồng độ bảng đo độ hấp thu A bước sóng 400nm Bảng 1: Kết đo độ hấp thu A theo nồng độ PNP [PNP] (mM) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 ĐƯỜ NG CHUẨ N A y = 8.5855x 0.9 0.8 0.7 0.6 Độ hấp thu A 0,1770,011 0,3400,007 0,5020,009 0,6840,013 0,8690,010 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 [PNP] mM/ l Hình 1: Tương quan độ hấp thu A nồng độ PNP 4.1.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng (a) Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất - Thực nghiệm: pha dung dịch theo bảng sau Bảng 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất Tác chất Mẫu Mẫu Nước khử ion (G) 0,7ml 0,5ml Đệm phosphat (D) 5,0ml 5,0ml Enzym (C) 0,2ml 0,2ml o Ủ 37 C 30 phút sau thêm: PNP – Glc (B) 0ml 0,2ml Mẫu 0,3ml 5,0ml 0,2ml Mẫu 0,1ml 5,0ml 0,2ml Mẫu ml 5,0ml 0,2ml 0,4ml 0,6ml 0,7ml Các mẫu lắc thật ủ tiếp 37oC 20 phút Từ mẫu, lấy 2ml dung dịch cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 8ml đệm carbonat pH 9,6 (E), lắc đem đo độ hấp thu A 400nm 132 Tạp chí Khoa học 2007:7 130-137 Trường Đại học Cần Thơ - Kết Bảng 3: Kết đo độ hấp thu A theo nồng độ chất PNP-Glc (ml) (mM) 0,0 0,2 0.,34 0,4 0,068 0,6 0,101 0,7 0,118 AÛnh hưởng nồng độ chất A 0.350 Độ hấp thu A 0.300 0.250 0,0890,003 0,1810,011 0,2760,005 0,3050,007 0.200 0.150 0.100 0.050 [PNP-glc] 0.000 0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0.140 Hình 2: Tương quan độ hấp thu A nồng độ chất - Nhận xét: độ hấp thu A thay đổi tuyến tính bậc với nồng độ chất Tuy nhiên, sử dụng nồng độ cao 0.1mM tỉ lệ khơng cịn tuyến tính bậc Vì chọn nồng độ chất 0,085mM thích hợp cho qui trình (b) Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzym - Thực nghiệm: pha dung dịch theo bảng sau Bảng 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzym Tác chất Mẫu Nước khử ion (G) 0,4ml Đệm phosphat (D) 5ml Enzym (C) 0ml Ủ 37oC 30 phút sau thêm: PNP – Glc (B) 0,5ml Mẫu 0,3ml 5ml 0,1ml Mẫu 0,2ml 5ml 0,2ml Mẫu 0,1ml 5ml 0,3ml Mẫu 0ml 5ml 0,4ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml Các mẫu lắc thật ủ tiếp 37oC 20 phút Từ mẫu, lấy 2ml dung dịch cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 8ml đệm carbonat pH 9,6 (E), lắc đem đo độ hấp thu A 400nm - Kết Bảng 5: Kết đo độ hấp thu A theo nồng độ enzym Enzym (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 Độ hấp thu A (U/ml) 0,015 0,031 0,046 0.061 A Ảnh hưởng nồng độ enzym 0.300 0.250 0.200 0,13660,008 0,2770,005 0,2820,012 0,2840,003 0.150 0.100 0.050 [enzym] 0.000 0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070 Hình 3: Tương quan độ hấp thu A nồng độ enzym - Nhận xét: Qui trình ổn định khoảng nồng độ enzym 0,031U/ml (c) Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng Tr - Thực nghiệm: Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bảng 133 Tạp chí Khoa học 2007:7 130-137 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 6: Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng Tr Tác chất Mẫu trắng Nước khử ion (G) 0,4ml Đệm phosphat (D) 5,0ml Enzym (C) ml o Ủ 37 C 30 phút sau thêm: PNP – Glc (B) 0,5ml Mẫu thử 0,2ml 5,0ml 0.2ml 0,5ml Hỗn hợp lắc thật tiếp tục trì 37 oC, sau phút lấy đo độ hấp thu A 400nm đến A không đổi lần đo - Kết Bảng 7: Kết đo độ hấp thu A theo thời gian phản ứng Tr (phút) 10 15 20 25 30 35 40 45 A 0,000 0,081 0,176 0,236 0,300 0,314 0,312 0,320 0,312 0,318 A Ảnh hưởng thời gian phản ứng 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0.000 phuùt 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 Hình 4: Tương quan độ hấp thu A thời gian phản ứng - Nhận xét: Độ hấp thu A tăng tuyến tính khoảng 23 phút phản ứng, chọn thời gian thích hợp cho phản ứng 20 phút (d) Khảo sát ảnh hưởng thời gian hoạt hóa enzym Ta - Thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu tương tự bảng Bảng 8: Khảo sát ảnh hưởng thời gian hoạt hóa enzym Tác chất Mẫu trắng Mẫu thử Nước khử ion (G) 0,4ml 0,2ml Đệm phosphat (D) 5,0ml 5,0ml Enzym (C) ml 0,2ml o Mỗi mẫu ủ 37 C 0; 10; 20; 30; 40; 50; 60 phút sau thêm: PNP – Glc (B) 0,5ml 0,5ml Mỗi hỗn hợp lắc thật ủ tiếp 37oC 20 phút Lấy 2ml hỗn hợp, cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 8ml dung dịch đệm carbonat pH 9.6 (E), lắc đem đo độ hấp thu A 400nm - Kết 134 Tạp chí Khoa học 2007:7 130-137 Trường Đại học Cần Thơ Ảnh hưởng thời gian hoạt hoaù Bảng 9: Kết đo độ hấp thu A theo thời gian hoạt hoá enzym Ta (phút) 10 20 30 40 50 60 A 0.25 A 0,1570,007 0,2020,012 0,2230,005 0,2310,005 0,2350,003 0,2370,007 0,2350,003 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 20 30 40 50 60 70 phút Hình 5: Tương quan độ hấp thu A thời gian hoạt hóa enzym - Nhận xét: Qui trình ổn định sau 30 phút hoạt hóa mẫu 4.2 Thử hoạt tính cao chiết 4.2.1 Điều chế cao chiết Hạt mướp đắng sấy khô (400g) chiết Shoxlet với ete petrol, clorofom cồn Sau lọc cô loại dung môi áp suất kém, thu cao tương ứng H1 (42g), H2 (15g) H3 (25g) Các cao chiết dùng để thử hoạt tính 4.2.2 Thử hoạt tính cao chiết - Thực nghiệm Chuẩn bị dịch chiết H1, H2, H3 có nồng độ 2.95mg/ml tương ứng với nồng độ 100g/ml hỗn hợp phản ứng Pha lỗng để có nồng độ Ci: 100, 75, 50, 25 g/ml Thực nồng độ loại cao chiết theo bảng sau Bảng 10: Thử hoạt tính cao chiết THỀ TÍCH (ml) TÁC CHẤT Mẫu trắng Nước khử ion (G) 0,2 Đệm phosphat (D) 5,0 Enzym (C) Chất ức chế (F) có nồng độ Ci 0,2 o Ủ 37 C 30 phút sau thêm: PNP – Glc (B) 0,5ml Mẫu ức chế 5,0 0,2 0,2 0,5ml Hỗn hợp lắc thật ủ tiếp 37oC 20 phút Lấy 2ml hỗn hợp, cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 8ml dung dịch đệm carbonat pH 9,6 (E), lắc đem đo độ hấp thu A 400nm - Kết Hoạt tính ức chế cao chiết tính theo công thức % ức chế = [glc] – [glc] i [glc]0 Do [glc] tỉ lệ với [PNP] nên 135 Tạp chí Khoa học 2007:7 130-137 Trường Đại học Cần Thơ % ức chế = [PNP] – [PNP] i [PNP]0 Hay % ức chế = [A] – [A] i [A]0 Trong - [glc]0 : Nồng độ glucose sinh không sử dụng chất ức chế (mM/l) - [glc]i : Nồng độ glucose sinh sử dụng chất ức chế nồng độ i (mM/l) - [PNP]0: Nồng độ PNP sinh không sử dụng chất ức chế (mM/l) - [PNP]i: Nồng độ PNP sinh sử dụng chất ức chế nồng độ i (mM/l) - [A]0: Độ hấp thu không sử dụng chất ức chế - [A]i: Độ hấp thu sử dụng chất ức chế nồng độ i Bảng 11: Kết đo A tính tốn % ức chế Nồng độ chất ức chế (g/ml) 25 50 75 100 H1 A 0,0550,005 0,0650,010 0,0640,007 0,0720,003 0,0690,011 % ƯC H2 A -18,18 -16,36 -30,91 -25,45 0,0960,003 0,0980,004 0,0740,006 0,0820,002 0,0730,007 % ƯC H3 A % ƯC -2,08 22,92 14,58 23,96 0,2800,002 0,1680,003 0,0730,002 0,0340,004 0,003,001 40,00 73,93 87,86 98,93 Hoạ t tính ứ c chế củ a H1, H2, H3 120 100 % Ức chế 80 H1 H2 H3 60 40 20 -20 20 40 60 80 100 120 -40 Nồng độ (g/ml) Hình 6: Tương quan % ức chế nồng độ chất ức chế - Nhận xét: Cao H1 hoạt tính ức chế men -glucosidase, cao H2 có hoạt tính yếu, cao H3 có hoạt tính mạnh (IC50=31,25 g/ml) 136 Tạp chí Khoa học 2007:7 130-137 Trường Đại học Cần Thơ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - Đã xây dựng qui trình in vitro thử hoạt tính kháng tiểu đường theo chế ức chế men -glucosidase với điều kiện sau: (i) Dùng chất p-Nitrophenyl--D-glucopyranoside, nồng độ 0,085M/ml (ii) Nồng độ enzym thích hợp 0,031U/ml (iii) Thời gian hoạt hố 30 phút (iv) Thời gian phản ứng 20 phút - Đã thử hoạt tính cao chiết từ hạt mướp đắng Kết cao H2 có hoạt tính yếu, cao H3 có hoạt tính mạnh (IC50=31,25 g/ml) - Cần thực phương pháp chiết tách cô lập hoạt chất từ cao H3 để tìm kiếm hoạt chất có khả ức chế men α-glucosidase - Tiếp tục thử nghiệm hoạt tính ức chế men α-glucosidase cao H3 chất cô lập từ cao H3 động vật sống (in vivo) TÀI LIỆU THAM KHẢO -Glucosidase assay (Colorimetric for quantitative determination of -glucosidase (maltase) in human semen research samples), Roche, 1/2005 Haimin Chen, Xiaojun Yan, Wei Lin, Li Zheng and Weiwei Zhang, A new method for screening  - glucosidase inhibitors and application to marine microorganisms, Pharmaceutical Biology, Vol.42, No.6, pp 416-421, 2004 Hideyuki Matsuura, Chikako Asakawa, Masanori Kurimoto, Junia Miyutani, -glucosidase inhibitor from the seeds of Balsam pear (Momordica chrantia L.) and the fruit bodies of Grifola frondosa, Biosci Biotechnol Biochem, Vol.66, No.7, pp 1576-1578, 2002 Kyoshi Matsumoto, Kayoko Takemata et al A novel method for the assay of -glucosidase inhibitory activity using a multi-chanel oxigen sensor, Analytical Sciences, Vol.18, 2002 Sigma, Enzymatic assay of -glucosidase, 1994 137 ... hoạt chất có khả ức chế men α -glucosidase - Tiếp tục thử nghiệm hoạt tính ức chế men α -glucosidase cao H3 chất cô lập từ cao H3 động vật sống (in vivo) TÀI LIỆU THAM KHẢO  -Glucosidase assay (Colorimetric... ức chế men α -glucosidase phịng thí nghiệm Khảo sát hoạt tính ức chế men α -glucosidase cao chiết từ hạt mướp đắng PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Hoá chất - A Dung dịch p-Nitrophenyl--D-glucopyranoside... p-Nitrophenyl--D-Glucopyranoside α -Glucosidase -D-Glucose + p-Nitrophenol Theo phản ứng, lượng glucose sinh tỉ lệ với PNP Vì đo độ hấp thu PNP 400nm để xác định lượng glucose sinh So sánh hàm lượng glucose