Đang tải... (xem toàn văn)
Trong bài thực hành này, các bạn sẽ tập làm quen với cách sử dụng micropipette: cách cầm, điều chỉnh thể tích, hút và nhả dung dịch sao cho chính xác.. Cách sử dụng:.[r]
(1)Nhóm thực hành:……… Học kỳ:………Năm học:……… Họ tên SV:……….MSSV:………Lớp:………
……….MSSV:……….Lớp:………
MỤC LỤC
Bài Tách chiết ADN
Phần I Thao tác với Micropipette Phần II Tách chiết ADN từ máu heo Bài Polymerase Chain Reaction (PCR)
Phần I Pha loãng nồng độ ADN Phần II Chạy phản ứng PCR Bài Điện di kết
Phần I Điện di
(2)Bài 1: TÁCH CHIẾT ADN
Phần 1: Thao tác với micropipette
Micropipette thiết bị dùng để thao tác thể tích cấp độ micro lit (µl) Trong thực hành này, bạn tập làm quen với cách sử dụng micropipette: cách cầm, điều chỉnh thể tích, hút nhả dung dịch cho xác
A. Cách sử dụng:
Mỗi micropipette tích đo lường khác Biên độ đo thể tích ghi rõ pipette Khi điều chỉnh hút dung dịch phải ý chọn pipette phù hợp điều chỉnh thể tích nằm biên độ cho phép Tuyệt đối không điều chỉnh thể tích vượt ngồi biên độ
a Cái móc: cầm Pipet nghiêng phía cách lỏng lẻo sống bàn tay không sử dụng, làm tay bị sức
b Cầm chặt bàn tay Tránh cầm pipet chặt để giảm mỏi tay vai sau sử dụng pipet lâu
c Để lộ phần ghi số thể tích: nhìn suốt thời gian để kiểm sốt thể tích lấy sử dụng
d Nút nhấn lớn: nhấn để đẩy đầu tip khỏi pipette e Vặn điều chỉnh thể tích; nhấn/thả để hút/đẩy dung dịch
(3)B Cách lấy mẫu
Mỗi micropipette có biên độ đo thể tích khác sử dụng đầu tip khác
- Chọn loại đầu tip cho pipette tương ứng Ấn pipette vào đầu tip kết hợp xoay nhẹ Nếu không xoay có khe hở đầu tip pipette dẫn đến thể tích hút thực bị sai pipette bị nhỏ giọt
Cầm pipet tư thắng đứng
Ấn tới nấc dừng thứ Nhúng đầu pipet tip khoảng – mm vào dung
dịch
Thả pittông từ từ
Để cho mẫu, ấn tới nấc
dừng thứ
Chuyển tất phần lại chất lỏng đầu pipet tip ra, ấn tới nấc dừng thứ hai (để hết dung dịch khỏi pipet tip) Dung tích đo lường
(4)Dưới số kích thước pipette thường sử dụng Pipette Biên độ đo
lường (µl)
Lưu ý
P10 0.0 – 10.0 Không điều chỉnh thể tích 10 P20 2,0 – 20,0 Khơng điều chỉnh thể tích 20 P40 5,0 – 40,0 Không điều chỉnh thể tích 40 P100 10 - 100 Khơng điều chỉnh thể tích 10
100
P200 20 - 200 Không điều chỉnh thể tích 20 200
P1000 100 - 1000 Khơng điều chỉnh thể tích 100 1000
a. Dựa vào bảng pipette thực tế nhóm, chọn pipette đầu tip cho phù hợp để đo lường thể tích sau đây:
Thể tích Loại pipette Biên độ đo lường Màu sắc tip tương ứng 2.3 µl
154.6 µl 783 µl 36,2 µl 19.0 µl
C. Thực hành thao tác với micropipette:
Mỗi sinh viên cung cấp dụng cụ gồm pipette kích cỡ khác nhau, đĩa petrie có lót sẵn giấy thấm kích thước khác nhau, màu nhuộm
2 sinh viên nhóm nhỏ, làm chung mẫu
Mỗi nhóm nhỏ hút dung dịch nhỏ vào bên đĩa petrie theo kích thước cho bên quan sát dung dịch đĩa petrie nhóm đối diện
Đĩa petrie A: 250µl Đĩa petrie B: 90 µl Đĩa petrie C: 5µl
(5)Phần Tách chiết ADN từ máu heo A. Tách lọc bạch cầu
Thông thường lấy mẫu về, trước tách chiết ADN, thường có bước đầu thao tác nhằm loại bỏ thành phần tạp chất hay thành phần khơng có chứa ADN, nhằm góp phần giúp thu ADN tinh sau hồn tất quy trình tách chiết
Trong phần thực hành này, sinh viên thao tác tách chiết thành phần khơng có chứa ADN máu động vật hữu nhũ (heo)
Lưu ý: mặc áo blue đeo găng tay thao tác (tự chuẩn bị) 2 SV làm chung mẫu
Rửa ống nghiệm dơ sau thao tác
Dụng cụ, thiết bị: Máy ly tâm, Ống nghiệm chứa 15ml chứa mẫu, micropippete loại, đầu tip loại, lọ chứa dung dịch bỏ
Hóa chất: dung dịch NaCl 0,2% Thao tác:
1 Hút 8ml NaCl 0,2% vào ống nghiệm có chứa sẵn 1ml máu heo, trộn đều, ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút phút
2 Hút bỏ phần Tiếp tục cho vào 8ml NaCl 0.2%, trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút phút
3 Lập lại thao tác bốn lần
a. Thành phần máu bao gồm gì?
(6)B. Tách chiết ADN
Lưu ý: mặc áo blue đeo găng tay thao tác (tự chuẩn bị) 2 SV làm chung mẫu
Rửa ống nghiệm dơ sau thao tác
Dụng cụ, thiết bị: Máy ly tâm, ống nghiệm chứa mẫu, micropippete loại, đầu tip loại, lọ chứa dung dịch bỏ
Hóa chất: Lysis Buffer, Proteinase K, Phenol, CIAA (Chloroform/Isoamyl Alcohol), Ethanol 95%, Ethanol 70%, TE 1X
Thao tác:
1 Cho 3ml Lysis Buffer + 30 µl Proteinase K vào ống mẫu trên, trộn đều, ủ 550C qua đêm ( tối thiểu tiếng)
c. Proteinase K (PK) gì? Tác dụng PK?
2 Cho vào 3ml Phenol, trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút phút
d. Ở bước xuất hiện tượng kết tủa? Kết tủa gì? Tại xuất kết tủa?
3 Hút phần chuyển vào ống nghiệm mới, sau thêm vào 3ml Phenol/CIAA, trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút phút
(7)4 Hút phần chuyển vào ống nghiệm mới, sau thêm vào 3ml CIAA
(Chloroform/Isoamyl Alcohol), trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút phút
f. ADN lúc nằm đâu? Phần loại bỏ bao gồm gì?
5 Hút phần chuyển vào ống nghiệm có chứa sẵn 5ml Ethanol 95% lạnh
g. Hiện tượng kết tủa xuất Chất kết tủa gì?
6 Ly tâm 6000 vòng/phút phút Hút cạn phần dung dịch bỏ Lưu ý đừng loại bỏ ADN
7 Cho vào 3ml Ethanol 70% Trộn Ly tâm 3000 vòng/phút phút
h. Tác dụng EtOH 70% bước gì?
8 Hút cạn phần dung dịch bỏ Làm mẫu Cho vào 200 µl TE 1X Ủ 370C qua đêm
i. Tác dụng dung dịch TE 1X?
(8)Bài 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Phần I Pha loãng nồng độ ADN
Tùy theo lượng mẫu thao tác, nồng độ ADN thu không giống sau tách chiết (thường nồng độ đậm đặc) Và phản ứng PCR, lượng ADN mẫu đưa vào có khác biệt Vì cần phải pha loãng ADN theo nồng độ phù hợp trước thực PCR nhằm đơn giản thao tác phản ứng xảy xác
Chuẩn bị: ống eppendorf, micropipette, nước cất TE 1X Thao tác:
1 Ghi nhận kết đo nồng độ mẫu ADN nhóm vào cột C (Giáo viên cung
cấp số liệu cho bạn)
2 Hãy tính tốn lượng ADN lượng nước/TE 1X bạn cần thêm vào để có tổng thể tích mẫu 200µl với nồng độ 100ng ADN/µl theo công thức sau: Nồng độ ban đầu x thể tích mẫu gốc = nồng độ cần pha lỗng x thể tích mẫu cần pha
Hay ta có D = (A x B)/C
Lượng nước/TE 1X bạn cần thêm vào để có tổng thể tích 200µl với nồng độ 10ng ADN/µl? E = B – D
Mẫu A B C D E
Nồng độ cần pha lỗng
Thể tích mẫu cần pha
Nồng độ gốc ban đầu
Thể tích mẫu gốc cần thêm vào
Thể tích nước/TE 1X cần thêm vào 100ng/ µl 200 µl
(9)Phần II Chạy phản ứng PCR
Để phản ứng PCR xảy tốt dễ dàng dự đốn điều chỉnh thành phần để kết thu rõ ràng hơn, cần phải tính tốn trộn lượng hỗn hợp tổng cho xác Hỗn hợp tổng chuẩn bị bao gồm mẫu đối chứng (N)
1 Chuẩn bị ống eppendorf 1,5ml để trộn hỗn hợp tổng Ghi số nhóm thực lên nắp ống
2 Tính tốn thành phần để chạy phản ứng + phản ứng đối chứng (N) a Tính tốn thể tích thành phần cho phản ứng Điền kết vào cột C
Sử dụng cơng thức sau để tính thể tích thành phần : - Cơng thức tam suất
- C = B x V∑/A
- H2O = V∑ - Các thành phần biết
-b Tính tốn điền kết thành phần tổng vào cột D Thành phần A (Nồng độ gốc) B (Nồng độ
phản ứng)
C (Thể tích cho phản ứng)
D (Thể tích cho phản ứng +1)
ADN 100ng/ µl 50ng (**)
Nước cất
Dung dịch đệm 10X 1X
dNTPs 1.0mM 150µM
Mồi xi F 10pmol/µl 50pmol Mồi ngược R 10pmol/µl 50pmol
MgCl2 25mM 2,25mM
Enzyme (Taq DNA polymerase)*
5UI/ µl 1UI
Tổng (V∑) 25 µl(**)
*: đưa vào hỗn hợp cuối cùng; **: số liệu thay đổi tùy theo nhóm thực hành Hút thành phần tính vào ống eppendorf 1,5ml Trộn nhẹ nhàng cho
đều
4 Chuẩn bị ống eppendorf 200 µl Đánh số từ 1->4 eppendorf ghi chữ N Dùng micropipette hút …… µl hỗn hợp vào eppendorf 200 µl
(10)7 Phản ứng PCR chạy theo quy trình sau: Bước 1: tiền biến tính 940C, 10phút
Bước 2: Biến tính 940C, 30 giây
Bước 3: Ủ bắt cặp 550C, 45 giây Lặp lại 35 lần Bước 4: Kéo dài 720C, 45 giây
Bước 5: Bù thêm 720C, 5phút Bước 6: Giữ mẫu 40C
a. Tổng thời gian chạy phản ứng PCR kéo dài bao lâu?
(11)Bài 3: ĐIỆN DI KẾT QUẢ
Phần I Điện di
A. Pha agarose nồng độ 1%
1 Cân 1g agarose + 100ml dd TAE 1X
Nếu muốn pha 100ml dd agarose có nồng độ 1,5%, cần gram agarose?
2 Microwave cho agarose tan đều, sôi khoảng lần
3 Đợi dd agarose nguội, khoảng 500C, thêm µl ETBR vào Chú ý lắc nhẹ bình chứa agarose đá bào theo chiều kim đồng hồ lắc ngược lại để ETBR tan gel tránh bọt khí
a. ETBR gì? Tác dụng ETBR?
b. Tại phải tránh tạo bọt khí q trình đổ gel?
4 Đổ gel vào khuôn gắn lược, chờ gel đông đặc
B. Load mẫu:
1 Hút µl Ladder 100 (ABM) cho vào giếng
(12)d. Theo hình, Ladder 100 giếng:………
e. Xem hình bên điền kích thước tương ứng với band ladder
2 Hút µl mẫu cho vào giếng khác - Điện di 100 V 30 phút
Phần II Phân tích kết
Mỗi nhóm nhận kết điện di sản phẩm PCR nhằm xác định vật ni có nhiễm bệnh sau: PRRS PED
f. PRRS viết tắt của:………
PRRS bệnh: ……… Có tên gọi khác là……… xảy trên……… ……… virus……… ……… ……gây
g PED viết tắt của………
PED bệnh: ……… xảy trên……… ……… virus……… ……… gây ra.
Primer Trình tự (5’ – 3’) Đối tượng phát hiện
Vùng gen khuếch đại
Kích thước sản phẩm ORF6-F GTGGCAACCCCTATAACCAGAG
PRRSV ORF6 780 bp
ORF6-R ACGACAGACACAATTGCCGCTCAC E pro-F CGCAGTTTACACACCTATAGGG
Coronavirus E&M 412 bp
(13)h. F viết tắt của……….R viết tắt của………
i Hãy tìm gạch trình tự Nucleotid quy định mồi xuôi mồi ngược trong đoạn gien giải mã dây:
(Lưu ý: Khi xác định trình tự mồi ngược, trước tiên nhóm phải viết lại trình tự Nucleotid bắt cặp theo chiều 3’.)
LOCUS AY612613
14281 GCAAAGTTGA GGTCGAAGGT CATCTGATCG ACCTCAAAAG AGTTGTGCTT GATGGTTCCG 14341 TGGCAACCCC TATAACCAGA GTTTCAGCGG AACAATGGGG TCGTCCTTAG ATGACTTCTG 14401 TCATGATAGC ACGGCTCCAC AAAAGGTGCT TTTGGCGTTT TCTATTACCT ACACGCCAGT 14461 GATGATATAT GCCCTAAAGG TGAGTCGCGG CCGACTGCTA GGGCTTCTGC ACCTTTTGAT 14521 CTTCCTGAAT TGTGCTTTCA CCTTCGGGTA CATGACTTTC GCGCACTTTC AGAGTACAAA 14581 TAAGGTCGCG CTCACTATGG GAGCAGTAGT TGCACTCCTT TGGGGGGTGT ACTCAGCCAT 14641 AGAAACCTGG AAATTCATCA CCTCCAGATG CCGTTTGTGC TTGCTAGGCC GCAAGTACAT 14701 TCTGGCCCCT GCCCACCACG TTGAAAGTGC CGCAGGCTTT CATCCGATTG CGGCAAATGA 14761 TAACCACGCA TTTGTCGTCC GGCGTCCCGG CTCCACTACG GTCAACGGCA CATTGGTGCC 14821 CGGGTTAAAA AGCCTCGTGT TGGGTGGCAG AAAAGCTGTT AAACAGGGAG TGGTAAACCT 14881 TGTCAAATAT GCCAAATAAC AACGGCAAGC AGCAGAAGAG AAAGAAGGGG GATGGCCAGC 14941 CAGTCAATCA GCTGTGCCAG ATGCTGGGTA AGATCATCGC TCAGCAAAAC CAGTCCAGAG 15001 GCAAGGGACC GGGAAAGAAA AATAAGAAGA AAAACCCGGA GAAGCCCCAT TTTCCTCTAG 15061 CGACTGAAGA TGATGTCAGA CATCACTTTA CCCCTAGTGA GCGGCAATTG TGTCTGTCGT 15121 CAATCCAGAC CGCCTTTAAT
//
(14)LOCUS JQ282909
25561 GCTTCACTTG TCACCGGTTG TGTAATAGCG CAGTTTACAC ACCTATAGGG CGTTTGTATA 25621 GAGTTTATAA GTCTTACATG CAAATAGACC CCCTCCCTAG TACTGTTATT GACGTATAAA 25681 CGAAATATGT CTAACGGTTC TATTCCCGTT GATGAGGTGA TTCAACACCT TAGAAACTGG 25741 AATTTCACAT GGAATATCAT ACTGACGATA CTACTTGTAG TGCTTCAGTA TGGCCATTAC 25801 AAGTACTCTG CGTTCTTGTA TGGTGTCAAG ATGGCTATTC TATGGATACT TTGGCCTCTT 25861 GTGTTAGCAC TGTCACTTTT TGATGCATGG GCTAGCTTTC AGGTCAATTG GGTCTTTTTT 25921 GCTTTCAGCA TCCTTATGGC TTGCATCACT CTTATGCTGT GGATAATGTA CTTTGTCAAT 25981 AGCATTCGGT TGTGGCGCAG GACACATTCT TGGTGGTCTT
//
Mồi xuôi:……… Mồi ngược:……… Kích thước sản phẩm PCR:………
j. Sau khuếch đại đoạn gien cặp mồi cho trên, kích thước sản phẩm PCR phát PRRSv là……….bp PEDv là……… bp
Dựa theo kết nhận được, mẫu xét nghiệm*……….: Dương tính hay âm tính:……… Kích thước sản phẩm:………bp
(15)k Nếu có nhiều kích thước giếng đối chứng âm tính, điều có ý nghĩa như nào?
l. Nếu có nhiều kích thước mẫu xét nghiệm PRRS/ PED điều có ý nghĩa như nào?
BÀI TẬP TỔNG HỢP
Dựa vào báo (Giáo viên cung cấp), trả lời điền thông tin (bằng tiếng Việt) vào nội dung sau:
1 Tên báo, tên tác giả
(16)3 Đối tượng lấy mẫu số lượng mẫu thực nghiên cứu?
4 Điền thành phần/thông tin cần thiết để thực phản ứng PCR vào bảng sau:
Thành phần tham gia phản ứng
Nồng độ/thể tích phản ứng
Quy trình chạy
phản ứng Nhiệt độ Thời gian
ADN Tiền biến tính
Nước cất Biến tính
Dung dịch đệm Ủ bắt cặp
dNTPs Kéo dài
Mồi xuôi F Bù thêm
Mồi ngược R Số chu kỳ
MgCl2
Tổng thời gian chạy hết phản ứng:
…………giờ………phút…………giây……… Enzyme (Taq DNA
polymerase)* Tổng (V∑)