Nghiên cứu thành phần hóa học cây mắt trâu.
177Tạp chí Hóa học, T. 42 (2), Tr. 177 - 181, 2004 Nghiên cứu thành phần hóa học cây mắt trâu (Micromelum hirsutum OLIV.) Đến Tòa soạn 14-7-2003 Trịnh Thị Thủy1, Trần Văn Sung1, Guenter Adam21Viện Hóa học, Viện Khoa học v$ Công nghệ Việt Nam 2Leibniz Institute of Plant Biochemistry, Germany SUMMARY Two coumarins micromelin and magnolioside and three flavonoides have been isolated from the leaves of Micromelum hirsutum. Their structures have been determined on the basis of MS, 1H and 13C NMR spectroscopy. I - Mở đầu Cây Mắt trâu hay còn đợc gọi l Lá méo, Mán chỉ, Chm hôi hay Kim sơng (Micro-melum hirsutum Oliv., Micromelum falcatum Lour. hoặc Aulacia falcata Lour.) họ Cam quýt (Rutaceae), l loại cây nhỏ, mọc hoang khắp miền rừng núi phía Bắc nớc ta nh H Bắc, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa [1, 2]. Dân gian Việt Nam dùng lá đắp lên viết thơng, vết loét hoặc sao vng ngâm rợu xoa bóp chữa tê thấp, teo cơ. Một số nơi còn dùng lá hay rễ sắc uống, chữa kinh nguyệt không đều, sốt, đau nhức, tê thấp. Các nghiên cứu trớc đây cho thấy các loiMicromelium có chứa nhiều indol ancaloit, cacbazol ancaloit, flavonoit v 6,8-prenyl cumarin. Song, cho đến năm 1999 cha thấy có nghiên cứu về thnh phần hóa học lá cây ny [3]. Tiến hnh nghiên cứu lá cây Mắt trâu thu hái tại Vờn Quốc gia Cúc Phơng, chúng tôi đ\ phân lập v xác định đợc cấu trúc hóa học của hai hợp chất cumarin l micromelin (1), magnoliosit (2) v ba hợp chất flavonoit (3 - 5). Cấu trúc hóa học của các chất tách ra đợc xác định bằng các phơng pháp phổ nh phổ khối (MS), phổ cộng hởng từ proton, cacbon 13 (1H-, 13C-NMR) vso sánh với các ti liệu đ\ công bố. OOHOCH3OOOH123456781'2'3'4'5'6' 12II - Thực Nghiệm Phổ cộng hởng từ hạt nhân đo trên máy VARIAN GEMINI-300 ở 300,24 MHz (1H) v75,5 MHz (13C) v máy VARIAN UNITY-500 ở 499,84 MHz (1H) v 125,5 MHz (13C) tại CHLB OCH3OOOOOHHOHOOH1'2'3'4'5'6'672 178Đức. Tetramethylsilan (TMS) dùng lm chất chuẩn cho phổ 1H v tín hiệu dung môi dùng lm chuẩn ở phổ 13C. Độ dịch chuyển hóa học ()đợc tính theo ppm so với TMS hoặc dung môi CDCl3v pyridin-d5, hằng số tơng tác (J) tính bằng Hz. Phổ tử ngoại đợc ghi trên máy UVIKON 940 CHLB Đức, sử dụng metanol tuyệt đối lm dung môi. Phổ khối EI-MS ghi trên máy ADM 402, 70 eV, CHLB Đức. Độ quay cực []Dghi trên máy JASCO Digital Polarimeter Ver. 100,19. Sắc ký lớp mỏng phân tích đợc tiến hnh trên bản mỏng nhôm silicagel Merck 60F245 tráng sẵn, độ dy 0,2 mm. Silicagel cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm đợc dùng cho SKC. Xử lý mẫu thực vật v phơng pháp chiết Mẫu cây Mắt trâu đợc thu hái ở rừng Quốc agia Cúc Phơng vo tháng 12 năm 1996. Tên cây do TS Trần Đình Đại xác định, tiêu bản số VN 53 (31/1/1996, Yên Châu, Sơn La) đợc lutại Viện Sinh thái v Ti nguyên sinh vật, Viện Khoa học v Công nghệ Việt Nam. 1,09 kg lá khô đợc ngâm chiết với dung dịch MeOH/H2O(95 : 5). Dịch chiết đợc loại bớt dung môi dới áp suất giảm, sau đó chiết lần lợt với n-hexan, EtOAc v n-butanol. Loại dung môi thu đợc18 g, 32 g v 23 g các cặn dịch chiết tơng ứng. Cặn dịch chiết EtOAc đợc phân tách bằng SKC trên silicagel, dung môi giải hấp CHCl3/MeOH (8 : 2) v cuối cùng tăng độ phân cực bằng cách thêm nớc [CHCl3/MeOH/H2O(65 : 35 : 5)] thu đợc 15 phân đoạn. Tinh chế tiếp phân đoạn 1 bằng SKC nhanh trên silicagel, dung môi n-hexan / etyl axetat v kết tinh lại thu đợc chất 1, 3, 4 v 5 sạch. Phân đoạn 15 đợctinh chế tiếp bằng SKC nhanh trên silicagel, dung môi giải hấp MeOH/EtOAc/H2O (2 : 12 : 1) thu đợc 22 mg chất 2 sạch. Micromelin (1): Tinh thể hình kim, mu trắng, điểm nóng chảy (đnc): 214oC - 216OC (EtOAc/ MeOH). Hm lợng: 0,0076% (so với nguyên liệu khô). Rf = 0,22, dung môi n-hexan/EtOAc (60 : 40). []D22 = -72O(CHCl3, c 0,5). UV maxMeOH (log): 320 (3,95), 224 (3,96). Phổ khối EI-MS (70 eV) m/z (%): 288 [M]+(100), 229 (45), 213 (35), 203 (15), 186 (16). Magnoliosit (2): Chất vô định hình, mu trắng. Hm lợng 0,0018%. []D25= 0O(pyridin, c 1,0). UV MeOHmax (log): 320 (3,94), 224 (3,90). EI-MS (70 eV) m/z (%): 192 [M-glc]+(100), 177 (30), 164 (10), 149 (12). ESI-MS (positive ions): 377 [M+Na]+(100), 193 [M+H-Glc]+; ESI-MS (negative ions): 399 [M+Cl]-(12), 191 [M-H-Glc]-(100). Chất 5,7-dihidroxy-3,6,4'-trimetoxyflavon (3):Tinh thể hình kim mu vng, đnc 173oC -175OC(EtOAc/MeOH). Hm lợng 0,0592%. HR-MS (70 eV) m/z (%): 344,0892 [M]+(100) (C18H16O7), 329 [M-15]+(100), 311 (5), 301 (8), 286 (14), 271 (4), 135 (6). 1H-NMR (CDCl3,300 MHz, ppm): 8,12 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2' v H-6'), 7,04 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3' v H-5'), 6,40 (1H, s, H-8); 13C-NMR (CDCl3, 75,5 MHz, ppm): 178,9, 161,8, 153,3, 155,6, 155,5, 148,2, 138,7, 130,0 (2C), 127,0, 122,7, 114,2 (2C), 105,4, 98,7, 61,8, 60,1, 55,4, 50,7. Chất 5,7-dihidroxy-3,6,8,4'-tetrametoxyflavon (4):Tinh thể hình kim mu vng, đnc 171oC -172OC(EtOAc/MeOH). Hm lợng 0,0592%. HR-MS (70 eV) m/z (%): 374 [M]+(45) (C19H18O8), 359 [M-15]+(100), 341 (8), 331 (5), 316 (5), 301 (3), 273 (4), 197 (5), 169 (4), 135 (7). 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm): 8,14 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2' v H-6'), 7,04 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3' v H-5'); 13C-NMR (CDCl3, 75,5 MHz, ppm): 179,3, 161,8, 155,8, 148,8, 148,0, 144,9, 138,4, 130,5, 130,1 (2C), 127,2, 122,8, 114,2 (2C), 105,0, 61,7, 60,9, 60,0, 55,4. Chất 7-hidroxy-3,5,6,8,4'-pentametoxyflavon (5):Tinh thể hình kim mu trắng, đnc 296oC -298OC(EtOAc/MeOH). Hm lợng 0,0010%. EI-MS (70 eV) m/z (%): 388 (80), 387 [M-H]+(5), 373 [M-15]+(100), 358 [M-30]+(5), 343 [M-45]+(8), 315 (5), 211 (8), 194 (5), 135 (10). 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm): 8,16 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2' v H-6'), 7,05 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3' vH-5'), 12,4 (s, OH). 13C-NMR (CDCl3, 75,5 MHz, ppm): 179,3, 161,9, 156,1, 152,9, 149,2, 144,9, 138,6, 136,1, 132,9, 130,3 (2C), 122,9, 107,5 (2C), 62,1, 61,7, 61,1, 60,1, 55,4. 179III - Kết quả v+ thảo luận Dịch chiết metanol 95% của lá cây sau khi loại dung môi dới áp suất giảm đợc phân bố lần lợt trong các dung môi n-hexan, etyl axetat v n-butanol. Cất loại dung môi thu đợc các cặn dịch chiết tơng ứng. Từ cặn dịch chiết etyl axetat bằng sắc ký cột (SKC) thờng, SKC nhanh (flash chromatography) v sắc ký lớp mỏng điều chế trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp đ\ phân lập đợc năm hợp chất 1, 2, 3, 4 v 5.Phổ tử ngoại của chất 1 v chất 2 cho thấy phân tử có nhân thơm qua cực đại hấp thụ MeOHmax (log ): 320 (3,95), 224 nm (3,96). Phổ khối va chạm electron (EI-MS) cho biết trọng lợng phân tử của chất 1 l 288 [M]+. Phổ 1H- NMR có cặp dublet có hằng số tơng tác (J = 9,6 Hz) của hai proton cạnh nhau ở 6,32 v7,67 (d, H-3 v H-4). Hai singulet 7,38 (H-5) v 6,88 (H-8), cho thấy C-6 v C-7 của cumarin có nhóm thế. Điều ny đợc khẳng định qua tín hiệu đơn của nhóm metyl ở 1,68 (Me-1'), metoxy 3,89 (MeO-7) v đợc thấy rõ hơn qua tín hiệu đơn của proton cạnh oxi ở 5,56 (H-4'),4,05 (H-5'). Phổ 13C-, APT-NMR có tín hiệu của hai nhóm CH ở 77,2 (C-4'), 63,5 (C-5'). Hai phổ ny cũng cho biết chất 1 có 15 nguyên tử cacbon, trong đó có một nhóm CH3, bảy nhóm CH; 7 cacbon bậc bốn, trong đó có hai nhóm cacbonyl có cờng độ tín hiệu thấp ở vùng trờng thấp 172,3 (C-2') v 159,9 (C-2). Qua phân tích số liệu phổ (bảng 1) v so sánh với số liệu đ\ công bố trong ti liệu [4, 5] đ\ xác định đợc cấu trúc của chất 1 l (1'R*,4'R*,5'R*)-4'-(7-metoxy-2-oxo-2H-1-benzopyran-6-yl)-1'-metyl -3',6'-dioxabixyclo[3.1.0] hexan-2'-one. Chất nylần đầu tiên đ\ đợc phân lập từ lá cây Micromelum minutum v có tên l micromelin hay micromelumin. Micromelin có hoạt tính kháng khối u cao. Từ micromelin các tác giả úcđ\ tổng hợp đợc dẫn xuất isomicromelin [4]. Phổ khối ion hóa bụi điện tử (ESI-MS) của chất 2 cho pic m/z 377 [M+Na]+, 193 [M+H-Glc]+(positive ions) v 399 [M+Cl]-(negative ions). Phổ khối EI-MS có pic cơ bản tại m/z 192[M-162]+(100), gợi ý cho thấy chất 2 có thể gắn với glucose. Điều ny đợc khẳng định qua các tín hiệu của nhóm metylenoxy 62,2 (C-6') v 4 nhóm CH của glucose (71,0, 74,6, 78,4 v79,1) ở phổ 13C v APT-NMR. Phổ 1H-NMR có dublet 5,79 (J = 7,1 Hz, H-1') của proton anome v các proton của glucose 4,19-4,53 (H-2'- H-6'). Chất 2 có phần cumarin phù hợp với chất 1 đợc thể hiện qua cặp dublet có hằng số tơng tác của hai proton cạnh nhau 6,32 (d, J = 9,6 Hz, H-3) v 7,66 (d, J = 9,3 Hz, H-4). Hai singulet 7,50 (H-5), 7,03 (H-8) v nhóm metoxy 3,89 (MeO-7) cho thấy C-6 v C-7 của nhân cumarin bị thế. Phổ 13C v APT-NMR cho biết chất 2 có 16 nguyên tử cacbon, trong đó có 10 cacbon bậc một, bậc ba v sáu cacbon bậc 2, bậc 4. Qua phân tích v so sánh với số liệu phổ đ\ công bố trong ti liệu [6] đ\ xác định đợc cấu trúc của chất 2 l 6-O--D-glucopyranosit-7-metoxy-2H-1-benzopyran-2-on. Chất ny lần đầu tiên đợctách ra từ cây Magnolia macrophyla v có tên lmagnoliosit [6]. Bảng 1: Số liệu phổ 1H- v13C-NMR của chất 1, 2 [giá trị (ppm), J (Hz)] Vị trí 1, dung môi CDCl32, dung môi Py-d5H(300 MHz) C(75,5 MHz) H(500 MHz) C(125,5 MHz) 2 159,9 161,13 6,32 d (9,6) 114,2 6,32 d (9,6) 109,8 4 7,67 d (9,6) 142,9 7,66 d (9,6) 143,7 5 7,38 s 127,6 7,50 s 114,06 120,2 147,07 160,4 151,2 1808 6,88 s 99,8 7,03 s 101,89 156,6 150,010 112,4 112,9 1' 57,2 5,79 d (7,1) 104,1 2' 172,3 4,19 m 74,6 3' 4,39 m 79,1 4' 5,56 s 77,2 4,38 m 71,0 5' 4,05 s 63,5 4,38 m 78.4 6'a 6'b 4,53 dd(12,1 v 2,2) 4,39 m 62,2 CH31,68 s 11,2 OCH33,89 s 56,4 3,71 s 56,2 Chất 3, 4 v 5 đều hấp thụ UV v có muvng đậm với thuốc thử vanilin/H2SO4, gợi ý cho thấy đây có thể l các flavonoit. Phổ 1H-NMR của ba chất đều có hai cặp dublet của hai cặp proton thơm 8,1 (2H, d, J = 9 Hz, H-2'; H-6') v 7,0 (2H, d, J = 9 Hz, H-3'; H-5'). Phổ 13C-NMR có hai tín hiệu đúp của bốn cacbon thơm ở130 (CH ì 2) v 114 (CH ì 2), cho thấy vòng C có nhóm thế ở vị trí C-4'. Phổ khối phân giải cao (HR-EI-MS) cho công thức phân tử của chất 3 l C18H16O7(m/z 344,0892); một số pic cơ bản m/z 329 [M-Me]+(100), 311 [M-Me-H2O]+v 135 cho thấy flavonoit có hai nhóm hidroxy v ba nhóm metoxy [8]. Pic cơ bản m/z 329 [M-15]+(100) cho thấy vòng A có hai nhóm hidroxy, một nhóm metoxy v chỉ có một nhóm metoxy ở vòng C, nh vậy có một nhóm metoxy ở C-3. Phổ 1H-NMR có singulet của proton thơm 6,40 (H-8). Qua phân tích v so sánh với số liệu phổ đ\ công bố trong ti liệu [7], đ\ xác định đợc cấu trúc của chất 3 l 5,7-dihidroxy-3,6,4'-trimetoxyflavon. Phổ EI-MS của chất 4 có pic ion phân tử m/z 374 (45) cho thấy flavonoit có hai nhóm hidroxy v 4 nhóm metoxy. Pic cơ bản m/z 359[M-15]+(100) v một số mảnh m/z 197 [A +COMe]+(5), m/z 169 [A]+, 135 [C + CO]+cho thấy vòng A có hai nhóm hidroxy, hai nhóm metoxy v chỉ có một nhóm metoxy ở vòng C.Qua phân tích v so sánh với số liệu phổ đ\công bố trong các ti liệu [8] v [9], đ\ xác định đợc cấu trúc của chất 4 l 5,7-dihidroxy-3,6,8,4'-tetrametoxyflavon. Chất ny lần đầu tiên đ\ đợc tách ra từ cây Ambrosia grayi [10]. Phổ 1H- 13C- v APT-NMR của chất 5 phù hợp với chất 4 nhng có hơn một nhóm metoxy, đợc thấy rõ qua pic ion phân tử m/z 388 ở phổ EI-MS. Qua phân tích phổ, so sánh với chất 4 v số liệu đ\ công bố trong ti liệu [8, 10], đ\ xác định đợc cấu trúc của chất 5 l7-hidroxy-3,5,6,8,4'-pentametoxyflavon. Chúng tôi xin chân th$nh cám ơn TS J. Schmidt (IPB, Halle/Saale, Germany) về việc 34: R = H5: R = CH36'5'4'3'2'1'10987654321CBAOHOCH3OOROCH3OOCH3OCH3OMeOHOCH3OOHOCH3O4: R = H5: R = CH 3 181đo phổ khối, TS Trần Đình Đại (Viện Sinh thái v$ T$i nguyên sinh vật, Viện Khoa học v$ Công nghệ Việt Nam) về việc xác định mẫu thực vật.T+i liệu tham khảo 1. Võ Văn Chi. Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Nh xuất Y học, Tp Hồ Chí Minh, Tr. 726 (1999). 2. Đỗ Tất Lợi. Những Cây thuốc v Vị thuốc Việt Nam, Nh xuất bản Khoa học v Kỹ thuật H Nội, Tr. 589 - 590 (1991). 3. Christine Kamperdick, Nguyen Minh Phuong, Tran Van Sung, Juergen Schmidt, and Guenter Adam. Phytochemistry, Vol. 52, P. 1671 - 1676 (1999). 4. John A. Lamberton and Trevor C. Morton. Australia Journal of Chemistry, Vol. 38,P. 1025 - 1030 (1985). 5. John A. Lamberton, J. R. Price, and A. H. Redclife. Australian Journal of Chemistry, Vol. 20, P. 973 (1967). 6. M. Victor Plouvier, M. Lucien Plantefol. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. Ser. D 266, P. 1526 (1968). 7. Christine A. Williams, Jeffrey B. Harbone, Hans Geiger, and J. Robin S. Hoult. Phytochemistry, Vol. 51, P. 417 - 423 (1999). 8. Yong-Long Liu and A. Mabry. Phytochemis-try, Vol. 21, P. 209 - 214 (1982). 9. F. Tomas, F. Ferreres, and A. Guirado. Phytochemistry, Vol. 18, P. 185 (1979). 10. Herz W. Anderson, H. Wagner, G. Maver, G. Flore, and Farkas. Tetrahedron Letters, P. 2571 (1973). . 177Tạp chí Hóa học, T. 42 (2), Tr. 177 - 181, 2004 Nghiên cứu thành phần hóa học cây mắt trâu (Micromelum hirsutum OLIV.) Đến. cumarin. Song, cho đến năm 1999 cha thấy có nghiên cứu về thnh phần hóa học lá cây ny [3]. Tiến hnh nghiên cứu lá cây Mắt trâu thu hái tại Vờn Quốc gia Cúc Phơng,