Thu nhận xác định đặc tính và khả năng ứng dụng chất kìm hãm tyrosinase

HÀ NGỌC LINH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - HÀ NGỌC LINH CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC THU NHẬN, XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA: 2012 - 2014 Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI HÀ NGỌC LINH THU NHẬN, XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐỖ BIÊN CƯƠNG Hà Nội – Năm 2014 I LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy Đỗ Biên Cƣơng – giảng viên Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, ngƣời hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, cán phịng thí nghiệm Bộ mơn Vi sinh, Hóa sinh Sinh học Phân tử tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tơi để hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln quan tâm, động viên, tạo điều kiện cho thời gian làm luận văn Hà Nội, ngày tháng 08 năm 2014 Học viên Hà Ngọc Linh Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học II LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung luận văn tơi thực dƣới hƣớng dẫn TS Đỗ Biên Cƣơng Các số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khoa học khác Hà Nội, ngày tháng 08 năm 2014 Học viên Hà Ngọc Linh Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học III MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 TYROSINASE 1.1.1 Cấu tạo 1.1.2 Cơ chế 1.1.3 Tính chất 1.2 CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE 10 1.2.1 Chất kìm hãm tyrosinase 10 1.2.2 Cơ chế kìm hãm tyrosinase 11 1.2.3 Protein peptide kìm hãm tyrosinase 12 1.2.3.1 Nguồn thu 12 1.2.3.2 Peptide liên kết kìm hãm tyrosinase 16 1.2.4 Một số nghiên cứu chất kìm hãm tyrosinase Việt Nam 20 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 2.1 VẬT LIỆU 22 2.1.1 Nguyên liệu 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Thiết bị 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Phƣơng pháp xác định hoạt độ protease theo Anson cải tiến 23 Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học IV 2.2.2 Thủy phân protein nguyên liệu nghiên cứu 24 2.2.3 Phƣơng pháp phân tích 24 2.2.3.1 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kìm hãm tyrosinase 24 2.2.3.2 Phƣơng pháp xác định tổng hàm lƣợng peptide 25 2.2.4 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng yếu tố đến trình thủy phân 25 2.2.4.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ bột đậu tƣơng enzyme đến khả thủy phân 25 2.2.4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả thủy phân 25 2.2.4.3 Ảnh hƣởng pH đến khả thủy phân 25 2.2.4.4 Ảnh hƣởng thời gian đến khả thủy phân 26 2.2.5 Phƣơng pháp làm peptide 26 2.2.5.1 Phƣơng pháp kết tủa cồn tuyệt đối 26 2.2.5.2 Phƣơng pháp sắc ký lọc gel 26 2.2.5.3 Phƣơng pháp lọc qua màng cut-off 3kDa 26 2.2.5.4 Phƣơng pháp điện di Tricine-SDS-PAGE 26 2.2.6 Phƣơng pháp ninhydrin xác định hàm lƣợng peptide/amino acid 27 2.2.7 Phƣơng pháp sắc ký mỏng TLC 28 2.2.8 Phƣơng pháp khối phổ ion hóa phun điện tử ESI 28 2.2.9 Phƣơng pháp xác định tính chất sản phẩm thủy phân 28 2.2.9.1 Xác định độ ổn định sản phẩm thủy phân 28 2.2.9.2 Xác định khả chống oxi hóa dịch thủy phân đậu tƣơng tinh 29 2.2.9.3 Xác định khả kìm hãm α – glucosidase 30 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học V 3.1 LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE 31 3.2 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN ĐẬU TƢƠNG KÌM HÃM TYROSINASE 32 3.2.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ E/S 32 3.2.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ thủy phân 33 3.2.3 Ảnh hƣởng pH thủy phân 34 3.2.4 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân 35 3.3 LÀM SẠCH CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE 36 3.4 KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE 41 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm 41 3.4.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính kìm hãm tyrosinase 42 3.4.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến độ bền hoạt tính chất kìm hãm 43 3.4.4 Ảnh hƣởng pH đến độ bền hoạt tính kìm hãm tyrosinase 44 3.4.5 Ảnh hƣởng điều kiện phản ứng Maillard đến hoạt tính kìm hãm 47 3.4.6 Khả chống oxi hóa kìm hãm α-glucosidase 46 3.4.7 Xác định nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase (IC50) 46 3.5 THĂM DỊ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE 49 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 58 Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học VI DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Chú thích Da Dalton DOPAchrome 2-cacboxy-2,3-dihydroindole-5,6quinon DOPAquinone 4-(2-Cacboxy-2-aminoetyl)-1,2benzoquinon ESI Ion hóa phun điện tử IC50 Nồng độ ức chế 50% hoạt tính kDa Kilo dalton KV Kilo volt L-DOPA L-3,4 dihydroxyphenylalanine MS Khối phổ 10 m/z Tỷ lệ khối lƣợng/ điện tích 11 OPA Dung dịch Ortho-Phthalaldehyde 12 TEMED Tetramethylethylenediamine 13 TYR Tyrosinase 14 V Volt 15 v/v Thể tích/ thể tích 16 w/v Khối lƣợng/ thể tích 17 4NPG 4-Nitrophenyl α-D- glucopyranoside Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học VII DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Tóm tắt q trình tinh 38 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng điều kiện phản ứng Maillard đến hoạt tính kìm hãm 45 Bảng 3.3 Phần trăm ức chế tyrosinase với nồng độ peptide khác nhau……….47 Bảng 3.4 Bổ sung dịch thủy phân đậu tƣơng vào sữa đậu nành 49 Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học VIII DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo trung tâm hoạt động tyrosinase Hình 1.2 Phản ứng tạo Hemocyanin từ Deoxy Tyrosinase Hình 1.3 Chu trình tyrosinase trạng thái đồng Hình 1.4 Phản ứng oxy hóa pirocatechol dƣới tác dụng catecholase Hình 3.1 Hoạt độ kìm hãm tyrosinase loại đậu 31 Hình 3.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ E/S đến khả kìm hãm tyrosinase 32 Hình 3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ thủy phânn protein đậu tƣơng 33 Hình 3.4 Tối ƣu pH thủy phân protein đậu tƣơng 34 Hình 3.5 Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến khả kìm hãm tyrosinase 35 Hình 3.6 Thí nghiệm zymogram dịch thủy phân mốc thời gian khác 36 Hình 3.7 Sắc ký đồ 37 Hình 3.8 Kết điện di Tricine-SDS-PAGE 39 Hình 3.9 Kết TLC 40 Hình 3.10 Kết khối phổ 41 Hình 3.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm tyrosinase 42 Hình 3.12 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính kìm hãm tyrosinase 43 Hình 3.13 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến độ bền hoạt tính chất kìm hãm 43 Hình 3.14 Ảnh hƣởng pH đến độ bền hoạt tính kìm hãm tyrosinase 44 Hình 3.15 Ảnh thí nghiệm Táo sau 48 Hình 3.16 Ảnh thí nghiệm Lê sau 48 Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 46 615 IU/L (đạt 80.1 % so với ban đầu), sau hoạt độ cịn lại 67.4 % Có thể xem xét để bổ sung sản phẩm kìm hãm thu từ dịch thủy phân bột đậu tƣơng vào sản phẩm bánh qui, bánh gạo thực phẩm nƣớng khác 3.4.6 Khả chống oxi hóa kìm hãm α-glucosidase 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) chất tạo gốc tự đƣợc dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể qua việc làm giảm màu DPPH, đƣợc xác định cách đo quang bƣớc sóng  = 517 nm Kiểm tra hoạt tính chống oxi hóa dịch đậu tƣơng tinh phƣơng pháp DPPH, cho thấy dịch đậu tƣơng tinh khơng có hoạt tính chống oxi hóa (EC50 > 128 µg/mL) Các peptide đậu tƣơng hoạt động nhƣ phức ion kim loại, có khả dập tắt oxi hoạt động gốc hydro tự từ dẫn tới khả chống oxi hóa peptide [36] Dịch thủy phân sau lọc gel có khả oxi hóa tạo phức với Fe, chuyển Fe3+ Fe2+ Khả tạo phức Fe là: 1.34 (mg Fe2+/g đậu tƣơng) Khảo sát dịch thủy phân đậu tƣơng tinh có khả kìm hãm αglucosidase khoảng 21% Thấp so với đậu tƣơng lên men nấm mốc có khả ức chế α-glucosidase 70% [3] 3.4.7 Xác định nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase (IC50) Khả kìm hãm tyrosinase đƣợc xác định dựa phần trăm kìm hãm I (%) Từ đó, ta tính đƣợc giá trị IC50, đại lƣợng đánh giá khả kìm hãm mạnh hay yếu hoạt chất IC50 đƣợc định nghĩa nồng độ chất kìm hãm mà ức chế đƣợc 50% hoạt tính enzyme Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 47 Bảng 3.3 Phần trăm ức chế tyrosinase với nồng độ peptide khác Nồng độ peptide (mg/mL) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Phần trăm kìm hãm I (%) 9.12 18.26 27.36 36.53 45.66 54.60 63.16 Từ bảng 3.3, chúng tơi tính đƣợc nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase dịch thủy phân tinh 1.09 mg/mL, thấp so với IC50 tinh dầu chiết từ Artemisia argyi (19.16 mg/mL) [43] xấp xỉ 18 lần 3.5 THĂM DÒ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE Hiệu sử dụng chất kìm hãm tyrosinase khơng phụ thuộc vào chất kìm hãm mà phụ thuộc vào enzyme chịu tác động liều lƣợng, thời gian tác động môi trƣờng phản ứng… Chúng tiến hảnh khảo sát hiệu chống thâm/ đen bƣớc đầu đánh giá tiềm sử dụng peptide bổ sung vào thực phẩm (sữa đậu) mỹ phẩm dƣỡng da da Cắt táo, lê thành lát tròn, mỏng Lát đối chứng: cho 1.5 mL nƣớc cất vào; lát dịch thô: cho 1.5 mL dịch thủy phân thô; lát dịch tinh sạch: cho 1.5 mL dịch thủy phân tinh Giữ mẫu nhiệt độ phòng Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 48 Đối chứng Dịch thơ Dịch tinh Hình 3.15 Ảnh thí nghiệm Táo sau Đối chứng Dịch thơ Dịch tinh Hình 3.16 Ảnh thí nghiệm Lê sau Kết hình 3.15 hình 3.16 cho thấy, khác tƣơng đối rõ màu sắc miếng táo, lê cho dịch thô dịch tinh so với mẫu đối chứng Có thể sử dụng dịch thủy phân đậu tƣơng để chống thâm cho loại thực phẩm sơ chế từ táo, lê (chế biến nƣớc hoa quả/pure…) Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 49 Bảng 3.4 Bổ sung dịch thủy phân đậu tƣơng vào sữa đậu nành Tỷ lệ dịch đậu tƣơng/sữa đậu nành (v/v) Hoạt độ kìm hãm tyrosinase (IU/L) 0% 10% 37.0 20% 82.0 30% 129.7 40% 190.2 50% 255 Kết đánh giá ảnh hƣởng bổ sung dịch thủy phân đậu tƣơng alcalase vào sữa đậu nành đƣợc thể bảng 3.4 Kết cho thấy peptide/ chất kìm hãm trì đƣợc hoạt tính mơi trƣờng sữa thành phẩm (đã bổ sung hóa chất bảo quản thơng thƣờng), sử dụng bổ sung tạo sản phẩm sữa đậu nành chức Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 50 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu, thực đề tài: “Thu nhận, xác định đặc tính khả ứng dụng chất kìm hãm tyrosinase”, chúng tơi có số kết luận sau: Xác định đƣợc dịch thủy phân đậu tƣơng đậu xanh có khả kìm hãm tyrosinase tốt, với hoạt độ kìm hãm tyrosinase dịch đậu tƣơng 930 IU/L Xác định đƣợc điều kiện thích hợp trình thủy phân dịch bột đậu tƣơng nhiệt độ 60oC, pH 8.0, tỷ lệ enzyme alcalase/bột đậu tƣơng 0.045 U/g, thời gian Kết hợp kết tủa cồn, sắc ký Sephadex G50 siêu lọc 3kDa làm phần chất kìm hãm tyrosinase từ dịch thủy phân đậu tƣơng, với hoạt tính kìm hãm đạt 1342.5 IU/L, hiệu suất thu hồi 6.1% Phân tích thành phân sản phẩm tinh TLC LC-MS cho thấy có mặt peptide mạch ngắn amino acid dịch kìm hãm tyrosinase Đã xác định số tính chất sản phẩm kìm hãm thu đƣợc từ trình thủy phân đậu tƣơng alcalase: o - Hoạt động tốt nhiệt độ 30 C, pH 6.5 - Bền nhiệt độ 20 – 30 C, pH 6.5 - Có khả tạo phức với sắt - Có khả kìm hãm α-glucosidase - Nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase (IC50) 1.09 mg/mL o Bƣớc đầu ứng dụng dịch thủy phân đậu tƣơng kìm hãm tyrosinase số loại bổ sung vào sữa Dịch thủy phân có tác dụng chống nâu hóa thể hoạt tính mơi trƣờng sữa đậu nành Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 51 KIẾN NGHỊ Tiếp tục hồn thiện q trình tinh dịch đậu tƣơng thủy phân Thử nghiệm peptide kìm hãm chống nâu hóa loại nơng sản da ngƣời, tiến tới sản xuất sản phẩm chứa peptide sinh học có hoạt tính ức chế tyrosinase, tác dụng chống lại hình thành melanin Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Xuân Duy, Hồ Bá Vƣơng (2013), Hoạt tính chống oxi hóa ức chế enzyme polyphenoloxidase số loại thực vật ăn đƣợc Việt Nam, Tạp chí Khoa học Phát triển, T 11, S 3: 364-372 Nguyễn Xuân Thụ, Lê Thị Lan Oanh, Trần Cảnh Đình (2008), Nghiên cứu số tính chất tyrosinase từ mực xà (Symplectoteuthis oualaniensis), Tạp chí Sinh học, 30(2):71-76 Nguyễn Thị Hƣơng Trà (2013), Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức từ đậu tƣơng lên men dùng cho ngƣời bệnh tiểu đƣờng, Viện Cơ điện nông nghiệp công nghệ sau thu hoạch Đỗ Minh Trung (2007), Nghiên cứu tách tinh chế, số đặc tính tyrosinase từ nấm ăn khảo sát điều kiện tạo kit tyrosinase phát nhanh dƣ lƣợng hợp chất phenol Nguyễn Tƣờng Vy, Nguyễn Hoài Nam, Nguyễn Tiến Đạt (2012), Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính ức chế enzym tyrosinase mần tƣới (Eupatorium fortunei Turcz.), Tạp chí Dược học, T 52, S 12 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Antonella F., Marcella C., Benedetta E., Benedetta M (2009), Tyrosinase inhibitor activity of coumarin-resveratrol hybrids, Molecules, 14: 2524 – 2520 Astarci E (2003), Production and biochemical character of polyphenol oxidase from Thermomyces lanuginosus, A Thesis Submitted To The Granduate School of Natural and Appied Sciens of The Middle East Technical University Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 53 Ates S., Pekyardimci S., Cokmus C (2001), Partial characterization of a peptide from honey that inhibits mushroom polyphenol oxidase, Food Biochemistry, 25: 127-137 Benathan M., and Labidi F (1997), Insulin inhibits tyrosinase activity and 5-Scysteinyldopa formation in human melanoma cells, Acta Dermato Venereologica, 77: 281-284 10 Burdock F.A., Soni M.G., Carabin I.G (2001), Evaluation of health aspects of kojic acid in food, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 33: 80-101 11 Cabanes J., Chazarra S., Garcia C F (1994), Kojic acid a cosmetic skin whitening agent is a slow-binding inhibitor of catecholase activity of tyrosinase, Pharmacy and Pharmacology, 46: 982-985 12 Canters G.W (2005), Structure and mechanism of the Type-3 copper protein tyrosinase, Armand Wilbrandt Jannes Wichert Tepper 13 Carrie C E (2008), Sigma's non-specific protease activity assay – casein as a substrate, J Vis Exp, 19: 899 14 Casanola M.G.M., Marrero P Y., Khan M.T.H., Ather A., Khan K.M., Torrens F., Rotondo R (2007), Dragon method for finding novel tyrosinase inhibitors: Biosilico identification and experimental in vitro assays, European Journal of Medicinal Chemistr, in press 15 Chen H.Y (1995), Antioxidant activity of various tea extracts, in relation to their antimutagenicity, J Agric Food Chem, 43:27-37 16 Daquinag A.C., Sato T., Koda H., Takao T., Fukuda M., Shimonishi Y., et al (1999), A novel endogenous inhibitor of phenoloxidase from Musca domestica has a cystine motif commonly found in snail and spider toxins Biochemistry, 38:2179– 88 Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 54 17 Decker H., Schweikardt T., Nillius D., Salzbrunn U., Jaenicke E., Tuczek F (2007), Similar enzyme activation catalysis in hemocyanins and tyrosinases, Gene, 398: 183-191 18 Dudley E.D., Hotchkiss J.H (1989), Cysteine as an inhibitor of polyphenol oxidase, Food Biochemistry, 13: 65-75 19 Dunn M J.(1992) Protein determination of total protein concentration, Protein Purification Methods, Harris E L V., Angal S., [Eds], Oxford: IRL Press 20 Fenn J B., Mann M., Meng C K., Wong S F., Whitehouse C M (1989), Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules, Science 246, 4926: 64–71 21 Garcia M.F., Munoz J.L., Tudela J (2006), A futher step in the kinetic characterisation of the tyrosinase enzymatic system, Mathematical Chemistry, 23: 125-130 22 Gary Siuzdak (1994), The emergence of mass spectrometry in biochemical research, Proceeding of the national Academy of Science of the United States of America, 1: 1290-11297 23 Girelli A M., Mattei E., Messina A., Tarola A M (2004), Inhibition of polyphenol oxidases activity by various dipeptides, J Agric Food Chem, 52(10): 2741-2745 24 Jan H (1997), L-DOPA is a substrate for tyrosine hydroxylase, Neurochemistry, 69: 1720-1728 25 Hwang M., Ederer G M (1975), Rapid hippurate hydrolysis method for presumptive identification of group B streptococci, J Clin Microbiol, 1: 114 Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 55 26 Kawagishi H., Somoto A., Kuranari J., Kimura A., Chiba S (1993), A novel cyclotetrapeptide produced by Lactobacillus helveticus as a tyrosinase inhibitor, Tetrahedron Letters, 34: 3439-3440 27 Kim H.J., Seo S.H., Lee B.G., Lee Y.S (2005), Identification of tyrosinase inhibitors from Glycyrrhiza uralensis, Planta Med, 71: 785-787 28 Kim Y.M., Yun J., Lee C.K., Lee H., Min K.R., Kim Y (2002), Oxyresveratrol and hydroxystilbene compounds, Inhibitory effect on tyrosinase and mechanism of action, J Biol Chem, 277: 16340-16344 29 Kim Y.J., Uyama H (2005), Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future Cell Mol Life Sci, 62: 1707-1723 30 Kobayashi Y., Kayahara H., Tadasa K., Tanaka H (1996), Synthesis of Nkojic-amino acid and N-kojic-amino acid-kojiate and their tyrosinase inhibitory activity, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6: 1303-1308 31 Koeni D., Popov A., Krebs B (2000), Crystal structure investigations on a tyrosinase from mushroom Insitut fur Biochemie, Universitat Munster, Hamburg Germany 32 Kong K.H., Hong N.P., Choi S.S., Kim Y.T., Cho S.H (2002), Purrification and characterization of a highly stable tyrosinase from Thermomicrobium roseum Biotechnol Appl Biochem, 31: 113-118 33 Kubo I., Kinst-Hori I., Kubo Y., Yamagiwa Y., Kamikawa T., Haraguchi H (2000), Molecular design of antibrowning agents, J Agric Food Chem, 48: 13931399 34 Li B., Huang Y., Paskewitz S.M (2006), Hen egg white lysozyme as an inhibitor of mushroom tyrosinase, FEBS Lett, 580: 1877-1882 Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 56 35 Mai Thanh Thi Nguyen, Nhan Trung Nguyen, Mai Ha Khoa Nguyen, Hai Xuan Nguyen, Ngan Kim Nguyen Bui (2012), Tyrosinase Inhibitors from the Wood of Artocarpus heterophyllus, J Nat Prod, 75: 1951−1955 36 Matoba Y., Kumagai T., Yamamoto A., Yoshitsu H., Sugiyama M (2006), Crystallographic evidence that the dinuclear coppercenter of tyrosinase is flexible during catalysis J Biol Chem, 281:8981–90 37 Nakajima M., Shinoda I., Samejima Y., Miyauchi H., Fukuwatari Y., Hayasawa H (1996), Kappa-casein suppresses melanogenesis in cultured pigment cells, Pigment Cell Research, 9: 235-239 38 Priham J B (1963), Enzyme chemistry of phenolic compounds, Pergamon press 39 Prieto P., Pineda M., Aguilar M (1999), Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: specific application to the mination of vitamin E., Anal Biochem, 269: 337-341 40 Prof G W C (2005), Structure and mechanism of the type-3 copper protein tyrosinase, Armand Wilbrandt Jannes Wichert Tepper 41 Richard F.C., Goupy P.M., Nicolas J.J (19920, Cysteine as an inhibitor of enzymatic browning, Kinetic studies, Agricultural and Food Chemistry, 40: 21082113 42 Salwanee S., Wanaida W M (2013), Enzyme concentration, temperature, pH, and time on the degree of hydrolysis of protein extract from viscera of tuna (Euthynnus affinis) by using alcalase, Sains Malaysiana, 42(3): 279–287 43 Shuang H C., Wang H F., Yih K.H., Chang L Z., Chang T M (2012), Dual Bioactivities of Essential Oil Extracted from the Leaves of Artemisia argyi as an Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 57 Antimelanogenic versus Antioxidant Agent and Chemical Composition Analysis by GC/MS, Int J Mol Sci, 13: 14679-14697 44 Supriti S., Sandipan S (2012), Separation of amino acids aased on thin-layer chromatography by a novel quinazoline based anti-microbial agent, Analytical Chemistry, 3: 669-674 45 Vijayan E., Husain I., Ramaiah A., and Madan N.C (1982), Purification of human skin tyrosinase and its protein inhibitor: Properties of the enzyme and the mechanism of inhibition by protein, Archives of Biochemistry and Biophysics, 217: 738-747 46 Villarama C D., Maibach H.I (2005), Glutathione as a depigmenting agent: an overview, Int J Cosm Sci, 27:147–153 47 Yamaki K., Mori Y (2006), Evaluation of alpha-glucosidase inhibitory activity in Colored Foods: A trial using slope factors of regression curves, Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi, 53(4): 229-231 48 Yamamoto A., Yoshitsu H., Sugiyama A (2006), Crystallographic evidence that the dinuclear copper center of tyrosinase is flexible during catalysis, J Biol Chem, 281(13): 8981–89 Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 58 PHỤ LỤC Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lê E/S đến trình thủy phân bột đậu tƣơng Tỷ lệ E/S (U/g bột) 0.023 0.045 0.068 0.09 0.113 Hoạt độ kìm hãm 829.8 940.5 704.8 575.0 478.8 (IU/L) Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình thủy phân bột đậu tƣơng Nhiệt độ 45 50 55 60 65 75 734.3 911.5 950.0 832.4 334.6 (oC) Hoạt độ kìm hãm (IU/L) 650.0 Khảo sát ảnh hƣởng pH đến trình thủy phân bột đậu tƣơng pH 6.5 7.5 8.5 Hoạt độ kìm 734.3 767.3 846.2 959.6 704.7 468.9 hãm (IU/L) Khảo sát ảnh hƣởng thời gian đến trình thủy phân bột đậu tƣơng Thời gian (giờ) Hoạt độ kìm 51.2 945.6 927.2 927 804.1 788.3 hãm (IU/L) Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 59 Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng peptide Đƣờng chuẩn phản ứng màu ninhydrin Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 60 Đƣờng chuẩn phản ứng tạo phức với sắt Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học ... tiến hành thực đề tài: ? ?Thu nhận, xác định đặc tính khả ứng dụng chất kìm hãm tyrosinase? ?? Mục tiêu đề tài: - Thu nhận chất kìm hãm tyrosinase - Xác định đặc tính chất kìm hãm tyrosinase Nội dung... liệu thu nhận chất kìm hãm tyrosinase - Tối ƣu điều kiện tạo chất kìm hãm tyrosinase - Tách làm chất kìm hãm tyrosinase - Xác định đặc tính chất kìm hãm tyrosinase - Thăm dị khả ứng dụng chất kìm. .. SẠCH CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE 36 3.4 KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CHẤT KÌM HÃM TYROSINASE 41 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm 41 3.4.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính kìm hãm tyrosinase