Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng và đột biến gene jak2 v617f trên bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát tại bệnh viện trung ương thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ HẠNH HUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÊ HẠNH HUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐỘT BIẾN GENE JAK2 V617F TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG TIỂU CẦU TIÊN PHÁT TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Hướng dẫn khoa học: Ts Nguyễn Thế Tùng Ts Nguyễn Thị Hải Yến THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố cơng trình Mọi kết thu khơng chỉnh sửa, chép từ nghiên cứu khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Lê Hạnh Huyên Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Các thầy cô cán Khoa Công nghệ Sinh học tận tình dạy dỗ, truyền dạy kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho năm qua Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Ts Nguyễn Thế Tùng cô giáo Ts Nguyễn Thị Hải Yến, người thầy định hướng nghiên cứu tận tình hướng dẫn, bảo cho tơi suốt thời gian tơi thực hồn thành luận văn Trong suốt q trình thực đề tài, tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ từ khoa Miễn dịch-Di truyền phân tử Bệnh viện Trung ƯơngThái Ngun, gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, người ln động viên, khích lệ, tạo cho tơi động lực niềm say mê nghiên cứu khoa học Tôi vô biết ơn tất tình cảm tốt đẹp mà người dành cho Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả Lê Hạnh Huyên Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 1.1.1 Giới thiệu bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 1.1.2 Cơ chế bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 1.1.4 Chẩn đoán tăng tiểu cầu tiên phát 10 1.2 Tổng quan nghiên cứu gene JAK2 V617F 12 1.2.1 Gene JAK2 12 1.2.2 Đột biến gene JAK2 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 16 2.1.1 Vật liệu 16 2.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 16 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 17 2.4.2 Phân tích đặc điểm cận lâm sàng 18 2.4.3 Xét nghiệm phát đột biến gene JAK2 V617F 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iv 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 22 3.2 Các số huyết học đối tượng nghiên cứu 23 3.4 Kết nghiên cứu tỉ lệ đột biến JAK2 V617F đặc điểm huyết học nhóm có khơng có đột biến JAK2 V617F 27 3.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số Thực phản ứng AS-PCR kiểm tra đột biến JAK2 V617F từ mẫu máu bệnh nhân 27 3.4.2 Tỉ lệ đột biến JAK2 V617F đặc điểm huyết học nhóm có khơng có đột biến JAK2 V617F 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 PHỤ LỤC 42 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Giải nghĩa tiếng Anh Giải nghĩa tiếng Việt Từ viết tắt AS - PCR Alen Specific – Polymerase chain Reaction CEL Chronic eosinophilic leukemia Bạch cầu mạn dòng acid CML Chronic megakaryocytic leukemia Bạch cầu mạn dòng tủy CNL Chronic neutrophilic leukemia Bạch cầu mạn dịng trung tính DNA Deoxyribonucleic Acid ECC Endogenous erythroid colony Cụm sinh hồng cầu ET Essential Thrombocythemia Tăng tiểu cầu nguyên phát GH Growth hormone Hormon tăng trưởng Hgb Hemoglobin Huyết sắc tố JKA2 Janus kinase LDH lactate dehydrogenase LH Luteinizing hormone Nội tiết tố LH MCV Mean corpuscular volume Thể tích trung bình hồng cầu MPN myeloproliferative neoplasm Hội chứng tăng sinh tủy MPV Mean Platelet Volume Thể tích trung bình tiểu cầu Nhiễm sắc thể NST PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymerase PLT Platelets Tiểu cầu PV polycythemia vera Đa hồng cầu tiên phát RBC Red blood cell Hồng cầu WBC White Blood cell Bạch cầu WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Phân bố giới tính độ tuổi của đối tượng nghiên cứu 22 Bảng 3.2 Các số dịng tiểu cầu nhóm đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) 23 Bảng 3.3 Tần xuất đối tượng nghiên cứu theo mức số lượng tiểu cầu 23 Bảng 3.4 Chỉ số dòng hồng cầu nhóm đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) 24 Bảng 3.5 Một số số hồng cầu lưới máu ngoại vi nhóm đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) 24 Bảng 3.6 Tần xuất đối tượng nghiên cứu theo mức số hồng cầu lưới máu ngoại vi 25 Bảng 3.7 Số lượng tỉ lệ loại bạch cầu đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) 25 Bảng 3.8 Một số số hóa sinh nhóm đối tượng nghiên cứu theo giới (X ± SD) 26 Bảng 3.9 Các số dòng tiểu cầu nhóm đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến nhóm khơng có đột biến (X ± SD) 29 Bảng 3.10 Tần xuất nhóm nghiên cứu nhóm có đột biến khơng có đột biến theo mức số lượng tiểu cầu 29 Bảng 3.11 Các số dòng hồng cầu nhóm đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến khơng có đột biến (X ± SD) 30 Bảng 3.12 Một số số hồng cầu lưới máu ngoại vi đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến khơng có đột biến (X ± SD) 31 Bảng 3.13 Tần xuất đối tượng nghiên cứu nhóm có đột biến khơng có đột biến theo mức số hồng cầu lưới máu ngoại vi 31 Bảng 3.14 Số lượng tỉ lệ loại bạch cầu đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến khơng có đột biến (X ± SD) 32 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tiểu cầu máu ngoại vi Hình 1.2 Hình ảnh đột biến gene JAK2 V617F gây bệnh tăng sinh tủy Hình 1.3 Tiêu máu dàn bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát Hình 1.4 Vị trí nhiễm sắc thể chứa gene JAK2 13 Hình 1.5 Đột biến gene liên quan đến bệnh tiểu cầu 14 Hình 3.1 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm AS-PCR xác định đột biến gene JAK2 V617F từ mẫu máu bệnh nhân 28 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Hội chứng tăng sinh tủy (Myeloproliferative neoplasm - MPN) nhóm bệnh tủy xương phát triển riêng dòng tất dòng tế bào tạo tủy Theo Tổ chức Y tế giới (WHO) nhóm bao gồm bệnh: Bạch cầu mạn dòng tủy (CML), Bạch cầu mạn dòng Neutrophil (CNL), Bạch cầu mạn dòng Eosinophil (CEL), Đa hồng cầu nguyên phát (PV), Tăng tiểu cầu nguyên phát (ET), Xơ tủy vô tăng sinh tế bào Mast Tất có nguyên nhân từ tế bào máu gốc vạn sản sinh mức nhiều dịng tế bào, số bệnh thuộc nhóm chuyển thành bạch cầu cấp Các bệnh đa hồng cầu nguyên phát, Tăng tiểu cầu tiên phát xơ tủy vơ chuyển dạng lẫn [4], [5] Bệnh nhân mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, số lượng tiểu cầu thường tăng từ 500 đến 1000 G/l Số lượng tiểu cầu tăng cao bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát thường kèm theo tăng thêm một vài yếu tố nguy biến chứng Trên thực tế, số lượng tiểu cầu cao không thiết có dấu hiệu lâm sàng trường hợp mắc bệnh thường phát qua việc xét nghiệm công thức máu Tuy nhiên, cần khai thác rõ tiền sử để loại trừ khả mắc bệnh tăng tiểu cầu thứ phát Ngày nhờ tiến sinh học phân tử di truyền tế bào, bệnh tăng tiểu cầu tiên phát biết đến có liên quan đến đột biến gene JAK2 vị trí 617, Guanine (G) thay Thymine (T) kết Valine (V) thay Phenylalanine (P) Đột biến làm xáo trộn dẫn truyền qua trục gene JAKSTAT, làm sản sinh mức tế bào máu khơng kiểm sốt Nhóm bệnh có tiên lượng tốt, phương pháp điều trị kinh điển gồm thuốc Hydroxyurea, Busulfan, Interferon, Bipobroman kiểm sốt bệnh kéo dài thời gian sống 10 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 31 Bảng 3.12 Một số số hồng cầu lưới máu ngoại vi đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến khơng có đột biến (X ± SD) Đối tượng nghiên cứu (n=19) Có đột biến (n = 14) Không đột biến (n = 5) RET (%) ± SD 1,2 ± 0,5 1,3 ± 0,7 p1-2 > 0,05 RET (T/l) ± SD 0,05 ± 0,04 0,08 ± 0,05 p1-2 > 0,05 IRF(%) ± SD 0,39 ± 0,05 0,32 ± 0,04 p1-2 > 0,05 MRV (fl) ± SD 232 ± 25 111 ± 31 p1-2 > 0,05 Tỉ lệ % hồng cầu lưới ngoại vi tỉ lệ hồng cầu lưới nhóm có đột biến nhóm khơng có đột biến tương đương nhau, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p1-2 > 0,05 Bảng 3.13 Tần xuất đối tượng nghiên cứu nhóm có đột biến khơng có đột biến theo mức số hồng cầu lưới máu ngoại vi Mức tỉ lệ hồng cầu lưới Nhóm Đối tượng < 0,5 % Từ 0,5 đến 1,5 % > 1,5 % n % n % n % Có đột biến (n = 14) 21,4 50,0 28,6 Không đột biến (n = 5) 0,0 60,0 40,0 P p > 0,05 p < 0,05 p > 0,05 Phân tích số lượng tỷ lệ loại bạch cầu đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến khơng có đột biến cho thấy: Số lượng bạch cầu nhóm đối tượng có đột biến khơng có đột biến tương đương (p 1-2 > 0,05); Số lượng loại BC lymphô, BC ưa axít, BC ưa base nhóm đối tượng có đột biến khơng có đột biến có giá trị không tương đương (p < 0,05) Số lượng loại BC trung tính, BC mơnơ có giá trị tương đương Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 32 (p > 0,05) Đối tượng nghiên cứu nhóm có đột biến có tỉ lệ % hồng cầu lưới > 1,5% chiếm tỉ lệ thấp (28,6%), thấp nhóm đối tượng bệnh nhân khơng có đột biến (40%), khác biệt khơng có ý nghĩa với p >0,05 Bảng 3.14 Số lượng tỉ lệ loại bạch cầu đối tượng nghiên cứu theo nhóm có đột biến khơng có đột biến (X ± SD) Đối tượng nghiên cứu (n = 19) Có đột biến Khơng đột (n = 14) biến (n = 5) 7,5 ± 1,4 7,3 ± 1,7 SL (G/l) ± SD 3,7 ± 1,01 3,1 ± 1,9 p1-2 > 0,05 Tỷ lệ % 54,5 44,7 p1-2 > 0,05 SL (G/l) ± SD 2,1 ± 0,3 2,5 ± 0,3 p1-2 > 0,05 Tỷ lệ % 31,1 32,0 p1-2 > 0,05 SL (G/l) ± SD 0,4 ± 0,04 0,7 ± 0,04 p1-2 > 0,05 Tỷ lệ % 6,9 7,1 p1-2 > 0,05 SL (G/l) ± SD 0,3 ± 0,01 0,5 ± 0,08 p1-2 > 0,05 Tỷ lệ % 6,8 6,5 p1-2 > 0,05 SL (G/l) ± SD 0,08 ± 0,02 0.04 ± 0,02 p1-2 > 0,05 Tỷ lệ % 1,40 1,30 p1-2 > 0,05 Chỉ số dòng bạch cầu WBC (G/l) ± SD NEU LYM MONO EO BASO P p1-2 > 0,05 Janus kinase (JKA2) non-recepter tyrokinase họ Janus kinase tham gia vào trình truyền tín hiệu với họ cytokinase recepter Các đột biến JKA2 liên quan với bệnh đa hồng cầu nguyên phát, tăng tiểu cầu nguyên phát rối loạn tăng sinh tủy khác Đột biến V617K chuyển Valin thành Phenilalanine vị trí 617 chuỗi protein làm cho tế bào máu nhạy cảm với yếu tố tăng trưởng erythropoietin thrombopoietin Do recepter cần JKA2 cho đường truyền tín hiệu DNA bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 33 tăng tiểu cầu nguyên phát phân tích đột biến gen V617F giải trình tự gen sản phẩm PCR tương ứng Bước đầu nghiên cứu 19 bệnh nhân Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên, kết thu tương đồng với tác giả khác nước Khi quan sát thấy độ tuổi tuổi thường gặp bệnh nhân lâm sàng 41 – 62 tuổi, nam nhiều nữ, phần lớn bệnh nhân phát đỏ da niêm (92%), tăng huyết áp (70%), nhức đầu (52%) Kết tương đương với kết tác giả Huỳnh Hương, Berlin [3], [2]; huyết khối chiếm 10% tương đương với tác giả Vannucchi [7] nồng độ Hb trung bình 18,77 g/dL tương đương với tác giả nước, cao số nghiên cứu nước [7] Trong nghiên cứu nhận thấy tỉ lệ bệnh nhân giảm EPO 83%, cao nghiên cứu nước [11], 87% bệnh nhân có hình ảnh tủy tăng sinh Khi khảo sát đột biến gen kỹ thuật AS‐PCR, phát 73,3% bệnh nhân có mang đột biến JAK2V617F Kết thấp so với tác giả Huỳnh Hương, Tefferi, Zhao, Baxter, tương đương với tác giả Levine [5] So sánh số đặc điểm huyết học nhóm có khơng có đột biến JAK2V617F, chúng tơi ghi nhận hai nhóm có nồng độ Hemoglobin trung bình tương đương nhau, nhóm đột biến có độ tuổi lớn nhóm khơng có đột biến (p > 0,05) Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dựa kết nghiên cứu thu được, đưa số kết luận sau: Độ tuổi trung bình bệnh nhân đến khám ban đầu bệnh tăng tiểu cầu tiên phát 52,37 % ± 16,22%, nam mắc bệnh nhiều nữ (tỉ lệ 1,14) Phân tích số huyết học đối tượng nghiên cứu cho thấy: Chỉ số lượng tiểu cầu TB, thể tích trung bình tiểu cầu nam nữ khơng có khác biệt; Các số số lượng RBC, Hgb, MCH, MCV MCHC nam nữ nhóm đối tượng nghiên cứu khơng có khác biệt; Số lượng WBC nam nữ nhóm đối tượng nghiên cứu tương đương nhau, nhiên số lượng loại bạch cầu (LYM, EO, BASO) nam nữ có giá trị khơng tương đương Các số hóa sinh hàm lượng Albumin, Protein nam nữ nhóm đối tượng nghiên cứu tương đương nhau; hàm lượng Bilirubin toàn phần Bilirubin trực tiếp nam nữ giá trị tương đương Phân tích đột biến gene JAK2 V617F 19 bệnh nhân kết thu 14/19 dương tính với phản ứng AS - PCR (chiếm 73%) Phân tích đặc điểm huyết học nhóm có khơng có đột biến gene JAK2 V617F cho thấy: Tỉ lệ đối tượng có PLT từ 400 đến