Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn staphylococcus aureus gây độc đường ruột nhóm b trong thịt lợn bán tại thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Staphylococcus aureus GÂY ĐỘC ĐƢỜNG RUỘT NHÓM B TRONG THỊT LỢN BÁN TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên1 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Vấn đề an toàn thực phẩm trở thành vấn đề quan trọng sức khỏe cộng đồng hầu phát triển nước phát triển Trong loại thực phẩm sử dụng hàng ngày thịt lợn loại thực phẩm thông dụng thường xuyên sử dụng để chế biến ăn thực đơn hàng ngày gia đình Tuy nhiên thời gian gần có nhiều bệnh dịch liên quan đến thịt lợn mà lợi ích trước mắt người sử dụng bỏ qua tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm - đe dọa sức khỏe người Các vụ ngộ độc có nhiều nguyên nhân do: hóa chất, thân thực phẩm chứa sẵn số chất độc, thực phẩm chứa vi sinh vật gây bệnh,…Trong đó, vụ ngộ độc thực phẩm nhiễm vi sinh vật gây phát triển nhanh chóng với hậu nghiêm trọng Ngộ độc thực phẩm bệnh cấp tính xảy ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn, độc tố vi khuẩn có chứa chất có tính chất độc hại người Trong số vi sinh vật sinh độc tố gây bệnh có tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thức ăn tụ cầu vàng ăn, uống phải độc tố ruột tụ cầu vàng vốn cư trú đường ruột chiếm ưu số lượng Điều đáng ý số độc tố chúng bền với nhiệt khó bị phân hủy nhiệt độ cao, số độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) SEB tác nhân gây ngộ độc thực phẩm thường gặp S aureus Hơn chúng lại có khả kháng methiciline, penicillin, gặp điều kiện thuận lợi cịn lây lan gây bệnh nguy hiểm Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu cho nhiễm độc độc tố nhóm này, phương pháp phịng ngừa đặc hiệu khơng có, việc phịng bệnh điều trị bệnh ngộ độc tụ cầu gặp nhiều khó khăn khơng phát kịp thời tác nhân gây bệnh Vì vậy, việc xác định có mặt SEB mẫu bệnh phẩm thực phẩm đóng vai trị quan trọng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên2 http://www.lrc-tnu.edu.vn Mặt khác, việc giết mổ bán thịt lợn chủ yếu tư nhân thực hiện, phương tiện vận chuyển, dụng cụ bán thịt chưa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y Việc kiểm tra vệ sinh thú y cán kiểm dịch cịn gặp nhiều khó khăn dừng lại mức độ kiểm tra cảm quan thịt bán chợ Xuất phát từ lí trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm số đặc tính vi khuẩn Staphylococcus aureus gây độc tố đường ruột nhóm B thịt lợn Thái Nguyên.” 2.Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tỉ lệ nhiễm đặc tính độc tố nhóm B vi khuẩn Staphylococcus aureus thịt lợn, từ làm sở để nhà dịch tễ học có biện pháp nhằm khắc phục tình trạng ngộ độc thực phẩm Nội dung nghiên cứu - Khảo sát tình hình giết mổ xác định tỉ lệ nhiễm Staphylococcus aureus - Xác định đặc tính sinh hoá chủng Staphylococcus aureus phân lập - Xác định độc lực chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập chuột bạch khoẻ - Phân lập xác định trình tự gen độc tố đường ruột Enterotoxin nhóm B chủng Staphylococcus aureus - Xác định tính mẫn cảm chủng Staphylococcus aureus phân lập số loại kháng sinh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên3 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình nhiễm trùng, nhiễm độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm bệnh cấp tính xảy ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn độc tố vi khuẩn thức ăn có chứa chất độc hại người ăn Bệnh có tính chất đột ngột, nhiễm độc cho nhiều người thời điểm họ tiêu thụ loại thức ăn Ngộ độc thực phẩm có triệu chứng bệnh cấp tính nơn mửa, tiêu chảy v.v kèm theo triệu chứng khác tùy theo loại tác nhân gây ngộ độc [34] Thực phẩm ô nhiễm vi sinh vật độc tố vi sinh vật nguyên nhân gây bệnh phổ biến tồn cầu, xảy nước có khoa học y học phát triển nước lạc hậu phát triển [31] Hiện nay, loài người phải đối mặt với nguy nhiễm 200 bệnh truyền nhiễm thông qua thực phẩm Các triệu chứng lâm sàng đa dạng, từ mức viêm dày, ruột nhẹ nhiễm trùng, nhiễm độc nặng với nguy tử vong cao, dẫn tới biến chứng phức tạp, ảnh hưởng tới đời sống bệnh nhân Hậu thiệt hại kinh tế bệnh lây truyền qua thực phẩm lớn có xu hướng ngày tăng Ví dụ, năm Hoa Kỳ có khoảng 76 triệu ca mắc bệnh loại thực phẩm nhiễm, 325 nghìn ca nhập viện nghìn ca tử vong [23] Các chi phí điều trị cho bệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm Các loại mầm bệnh gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm: Người tiêu dùng mắc bệnh sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm mầm bệnh vi sinh vật, độc tố vi sinh vật số kim loại độc Trong số 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật xác định vai trò gây bệnh [15] Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng virus, loại vi khuẩn gây tới 90% số ca bệnh tử vong người Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên4 http://www.lrc-tnu.edu.vn Thế giới kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản xuất phân phối sản phẩm thực phẩm khơng bị bó hẹp khơng gian địa lý dẫn đến khả lan tràn khắp giới bệnh thực phẩm ô nhiễm Đồng thời, q trình cơng nghiệp hóa, thực phẩm sản xuất hàng loạt làm khả nhiều người tiêu dùng mắc bệnh tăng cao Số ca mắc bệnh thực phẩm nhiễm tăng đáng kể vịng 10 năm trở lại [23] Mặc dù y học phát triển, song tác nhân gây bệnh trực tiếp từ thực phẩm chưa phát đầy đủ Tại Hoa Kỳ, có 14/76 triệu ca mắc, 60/325 nghìn ca nhập viện 1,8/5 nghìn ca tử vong nhiễm trùng độc thực phẩm chẩn đốn xác ngun nhân [23] Trong số nguyên nhân xác định, có số mầm bệnh có khả gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao như: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholera, Salmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica.v.v [15] Listeria monocytogenes thường gặp sữa sản phẩm từ sữa, thịt, cá rau Vi khuẩn gây viêm màng não, nhiễm khuẩn đường tiết niệu tử vong, đặc biệt nguy hiểm với người suy giảm miễn dịch có khả lây nhiễm cao như: ung thư, AIDS, nghiện rượu, đái tháo đường Escherichia coli có mặt tất loại thực phẩm chết biến không vệ sinh, có nhiều chủng với khả gây bệnh khác chủng gây ỉa chảy (EPEC); chủng sinh độc tố ruột (ETEC) gây ỉa chảy trẻ em khách du lịch.v.v…[28] Ở nước châu Á, tụ cầu vàng (S aureus) nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc [3] 1.1.2 Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B Tụ cầu S aureus loài vi khuẩn gây bệnh ghi nhận sớm vào đầu năm 1880 Sự liên quan tụ cầu tới nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn biết đến từ năm 1914, tới năm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên5 http://www.lrc-tnu.edu.vn 1930, Dack cs xác định nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu gây độc tố ruột có dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [5] Từ năm 1969 1990, Anh, 53% trường hợp ngộ độc thực phẩm S aureus ghi nhận tiêu thụ sản phẩm từ thịt (đặc biệt ruốc); 22% trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ sản phẩm liên quan sữa, 7% từ cá, sò, ốc v.v… 3,5% từ trứng [30] Tại Pháp, số thực phẩm nhiễm S aureus ghi nhận hai năm (1999-2000) có sản phẩm từ sữa (đặc biệt pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá hải sản (11%), trứng sản phẩm từ trứng (11%) sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [19] Tại Hoa Kỳ, số trường hợp ngộ độc thực phẩm S aureus báo cáo năm 1975 1982 36% tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1% đến 1,4%, lại từ sản phẩm liên quan tới sữa hải sản [33] Ở châu Á vụ nhiễm S aureus chủ yếu nước Nhật Bản, Trung Quốc khu vực Đông Nam Á Ở Trung Quốc năm 2008 xảy vụ ngộ độc S aureus trẻ em uống sữa bị nhiễm S aureus Còn Nhật có vụ ngộ độc S aureus lớn vào tháng năm 1955 làm ngộ độc 1936 em học sinh trường tiểu học Tokyo tháng năm 2006 làm 14780 người bị ngộ độc vùng Kansai Nguyên nhân vụ ngộ độc họ uống sữa có nhiễm S aureus tập đồn Snow Trong khu vực Đơng Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc S aureus cao Indonesia Philippines Việt Nam nước có tỷ lệ nhiễm S aureus cao khu vực châu Á Như vậy, nước khác loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu khác Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn độc tố chúng đa dạng, thường gặp thực phẩm đường phố ăn (46,6%), xúc xích Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên6 http://www.lrc-tnu.edu.vn (96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%) v.v Đáng ý vi khuẩn S aureus thường tìm thấy thực phẩm bị nhiễm khuẩn [7] Tình trạng ngộ độc thực phẩm không diễn thành phố lớn mà tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh thực phẩm diễn phổ biến nhiều địa phương khác nước [30] Tuy nhiên, Việt Nam thực tế chưa có thống kê cụ thể số ca mắc hay tử vong ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB Có nhiều ngun nhân gây khó khăn cho q trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm SEB: - Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm điều trị sở chuyên khoa - Chẩn đoán khoa cấp cứu bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu gần giống bệnh SEB gây ra, nên chưa kết luận bệnh - Việc tiến hành nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm độc tố ruột SEB tụ cầu vàng Việt Nam mẻ, chủ yếu dựa vào phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức thời gian kéo dài Do đó, bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu nội độc tố SEB gặp nguy hiểm gấp bội SEB siêu kháng ngun có độc tính mạnh, tác động nhanh , dẫn tới tử vong người Dựa theo bảng 1.1 đây, nhận thấy tình trạng xuất vi sinh vật S aureus loại thực phẩm diễn phổ biến nước Vi khuẩn gây ngộ độc cấp tính cho nhiều người thời điểm họ tiêu thụ loại thực phẩm Ngộ độc thực phẩm S aureus xảy với đối tượng Tuy nhiên, người già, trẻ em người có hệ miễn dịch dễ mắc biểu triệu chứng nhiễm độc nặng nề [4] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên7 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.1 Sơ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng tồn quốc từ 2007 – 2012 Địa điểm STT Thời gian Số ngƣời mắc bệnh Đặc điểm bệnh nhân Mầm non bán công Vĩnh Thọ - Phú Thọ 9/2007 100 Học sinh Mầm non Vườn Hồng, P9 – Tân Bình; Tiểu học Âu Cơ, Q11 – TP HCM 12/2007 65 Trẻ em (từ 2-5 tuổi) Minh Long – Quảng Ngãi 2/2008 53 Người dân Hà Nội 5/2008 122 Khách dự đám cưới Cty TNHH Alliace One, KCN Giao Long, Bến Tre 6/2008 100 Công nhân Sơn La 9/2008 581 Người dân Tiểu học Tam Bình, Q.Thủ Đức – TP HCM 11/2008 51 Học sinh phụ huynh Cty Phú Nguyên, KCN An Đồng, Hải Dương 8/2009 160 Công nhân 4/2012 300 Khách dự đám cưới Bản Hùn xã Chiềng Cọ Sơn La Việc tìm phương pháp phát sớm S aureus độc tố SEB gây nhiễm trùng, nhiễm độc trực tiếp thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng cấp thiết, nhằm loại bỏ có biện pháp xử lý sớm thực phẩm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên8 http://www.lrc-tnu.edu.vn nhiễm độc nhiễm trùng Nhưng trước hết cần phải tìm hiểu đặc tính sinh hoá nghiên cứu mức độ phân tử làm tảng Chính vậy, việc tiến hành đề tài nhu cầu thực tiễn cấp bách 1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 1.2.1 Lịch sử phát Staphylococcus aureus Robert Koch phát năm 1878 sau thực phân lập từ mủ ung nhọt Năm 1880 Louis Paster tiến hành phân lập nghiên cứu Staphylococcus aureus Ngày 09/04/1880 bác sĩ người Scotland Alexander Ogston trình bày hội nghị lần thứ hội phẫu thuật Đức báo cáo khoa học, ơng sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) trình bày tương đối đầy đủ vai trò vi khuẩn bệnh lý sinh mủ lâm sàng Đến năm 1881 Ogston thành công việc gây bệnh thực nghiệm, tiền đề cho nghiên cứu S aureus sau Đến năm 1884 Rosenbach thực loạt nghiên cứu tỉ mỉ vi khuẩn Và ông đặt tên cho vi khuẩn Staphylococcus aureus Năm 1926 Julius von Daranyi người phát mối tương quan diện hoạt động men coagulase huyết tương vi khuẩn với khả gây bệnh Tuy nhiên đến năm 1948 phát chấp nhận rộng rãi 1.2.2 Đặc điểm phân loại Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus Tên khoa học: Staphylococcus aureus [12] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên9 http://www.lrc-tnu.edu.vn Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có coagulase tụ cầu khơng có coagulase S aureus gây bệnh ngộ độc thực phẩm tụ cầu có coagulase Nhờ enzyme mà mơi trường ni cấy có máu, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc màu vàng nên gọi tụ cầu vàng Phân loại tụ cầu dựa kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic vách tế bào vi khuẩn Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn khó khăn Phân loại tụ cầu dựa phage (phage type): tụ cầu phân vào nhóm I, II, III, IV Đây phương pháp sử dụng nhiều phân loại S aureus [5] 1.2.3 Đặc điểm vi khuẩn học 1.2.3.1 Hình dạng kích thƣớc Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với “staphyle” có nghĩa chùm nho) Tế bào tụ cầu khuẩn S aureus hình trịn, đường kính 0,51m, khơng di động, khơng sinh nha bào, khơng có vỏ capsule (giáp mơ), khơng có lơng, bắt màu Gram dương Trong bệnh phẩm tụ cầu thường tụ tập thành đám nhỏ chùm nho Trong môi trường canh khuẩn xếp thành đám lớn (Hình 1.1) Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn S aureus kính hiển vi điện tử Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn Staphylococcus aureus seb gene for enterotoxin B, complete cds, strain: OS7 AB479116.1 98% Staphylococcus aureus seb gene for enterotoxin B, complete cds, strain: NN43 AB462487.1 98% Staphylococcus aureus strain CMCC 26075 enterotoxin B gene, partial cds AY856382.1 98% Staphylococcus aureus enterotoxin B (seb) gene, partial cds AY852244.1 98% Staphylococcus aureus subsp aureus COL, complete genome CP000046.1 98% Staphylococcus aureus pathogenicity island 3, complete sequence S.aureus enterotoxin B gene, complete cds 10 Staphylococcus aureus strain F127 enterotoxin B precursor (seb) gene, partial cds AF410775.1 98% M11118.1 98% DQ997829.1 98% Từ bảng 3.9 hình 3.11 chúng tơi nhận thấy: Gen SEB chủng M62 có mức tương đồng với chủng công bố ngân hàng gen (NBCI) 98% chứng tỏ trình tự gen SEB chủng M62 nghiên cứu xác [36], [37]  Chủng M99: ctggatttga tggaatatga aagttttgta tgatgataat tatgtatcag caataaacgt taaatctata gatcaatttc tatactttga cttaatatat tctattaagg acactaagtt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn agggaattat gataatgttc gagtcgaatt taaaaacaaa gatttagctg ataaatacaa agataaatac gtagatgtgt ttggagctaa ttattattat caatgttatt tttctaaaaa aacgaatgat attaattcgt atcaaactga caaacgaaaa acttgtatgt atggtggtgt aactgagcat aattgaa Hình 3.12 Trình tự Nucleotid gen SEB chủng 99 Bảng 3.10 Độ tương đồng gen SEB chủng M99 với số chủng vi khuẩn ngân hàng gen giới (NCBI) TT Tên trình tự gen tƣơng đồng với gen SEB Mã số Tỉ lệ tƣơng NCBI đồng (%) CP003166.1 100% AB479118.1 100% AB479116.1 100% AB462487.1 100% AB479117.1 100% AY856382.1 100% AY852244.1 100% CP000046.1 100% Staphylococcus aureus subsp aureus M013, complete genome Staphylococcus aureus seb gene for enterotoxin B, complete cds, strain: PM36 Staphylococcus aureus seb gene for enterotoxin B, complete cds, strain: OS7 Staphylococcus aureus seb gene for enterotoxin B, complete cds, strain: NN43 Staphylococcus aureus seb gene for enterotoxin B, complete cds, strain: PM1 Staphylococcus aureus strain CMCC 26075 enterotoxin B gene, partial cds Staphylococcus aureus enterotoxin B (seb) gene, partial cds Staphylococcus aureus subsp aureus COL, complete genome Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 http://www.lrc-tnu.edu.vn Staphylococcus aureus pathogenicity island 3, complete sequence 10 S.aureus enterotoxin B gene, complete cds AF410775.1 100% M11118.1 100% Từ bảng 3.10 hình 3.12 chúng tơi nhận thấy: Chủng vi khuẩn M99 nghiên cứu so với số chủng công bố ngân hàng gen giới có độ tương đồng tuyệt đối 100% chủng có độ tương đồng cao chủng vi khuẩn nghiên cứu là: M5; M38; M62; M99 Từ kết trên, chúng tơi có sở vững để khẳng định nghiên cứu chúng tơi hồn tồn xác thống với công bố tác giả ngồi nước Tóm lại, qua nghiên cứu chủng vi khuẩn mang gen seb nhận thấy chủng có mức độ tương đồng với số chủng vi khuẩn nghiên cứu công bố ngân hàng gen giới (NCBI) với tỉ lệ khác Trong đó, tỉ lệ tương đồng chủng M5 96%, tiếp đến chủng M62 98% chủng M38 có tỉ lệ tương đồng với số chủng ngân hàng gen (NCBI) 99%, đặc biệt, chủng vi khuẩn M99 có mức độ tương đồng cao tỉ lệ 100% Các kết qủa thống với nghiên cứu tác giả khác giới Đồng thời kết việc ứng dụng sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc gen SEB vi khuẩn gây ngộ độc, bước đầu thành cơng hồn tồn ứng dụng giải trình tự gen để phát vi khuẩn S aureus có độc tố nhóm B Việt Nam Chẩn đốn vi khuẩn gây ngộ độc phương pháp giải trình tự gen rút ngắn thời gian xuống khoảng - ngày thay thời gian kéo dài từ - tháng phương pháp kinh điển trước Vấn đề có ý nghĩa lớn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn công tác điều trị kiểm sốt ngộ độc nước có mức độ bệnh nhân bị ngộ độc S aureus ngày cao nước ta 3.5 Xác định tính mẫn cảm với số loại kháng sinh hóa dƣợc chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập đƣợc Chúng tiến hành thử tí nh mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược vi khuẩn S aureus phân lập được, kết trình bày bảng 3.11 Bảng 3.12: Kết quả thử tí nh mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập được Đánh giá mức độ mẫn cảm Tên kháng sinh Stt & hóa dược Sớ chủng Rất thử mẫn cảm Mẫn cảm Kháng trung th́c bình + % + % + % Ceftazidime 0 60,0 40,0 Colistin 40,0 60,0 0 Gentamicin 60,0 20,0 20,0 Kanamicin 20,0 80,0 0 Neomicin 4 80,0 20,0 0 Norfloxacin 0 40,0 60,0 Enroflxacin 20,0 60,0 20,0 Spectinomycin 20,0 40,0 40,0 40,0 40,0 20,0 0 60,0 40,0 10 Trimethoprim/Sulfametho xazole Tetracycline Kết từ bảng 3.12 cho thấy, S aureus mẫn cảm với Gentamicin, Neomicin tỷ lệ 60,0%-80,0% Hầu hết loại kháng sinh Ceftazidime, Colistin, Kanamicin, Enroflxacin, Tetracycline mẫn cảm trung bình với S Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 http://www.lrc-tnu.edu.vn aureus tỷ lệ 60,0% - 80,0% Tuy nhiên, S aureus lại kháng với Norfloxacin mạnh tới 60,0%; loại kháng sinh khác kháng thuốc với tỷ lệ thấp (20,0% - 40,0% chủng thử nghiệm) Qua đó, chúng tơi thấy việc điều trị bệnh vi khuẩn S aureus phức tạp, phải có kết hợp nhiều loại kháng sinh với liều lượng phác đồ điều trị phù hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN Qua khảo sát tình hình giết mổ lợn số chợ địa bàn thành phố Thái Nguyên cho thấy có 73,3% đến 80,4% số mẫu thịt nhiễm S aureus; cường độ nhiễm trung bình từ 1,3x103CFU/g -5,2x103CFU/g Có 33,3% đến 47,7% mẫu thịt nhiễm Staphylococcus aureus không đạt tiêu chuẩn kỹ thuật; cường độ nhiễm trung bình từ 2,2x102CFU/g đến 3,8x102CFU/g Các chủng Staphylococcus aureus phân lập thể đặc tính sinh hố đặc trưng Các chủng phân lập có độc lực mạnh: Tỷ lệ gây chết 85% Đã nhân thành công đoạn gen SEB 336 bp chủng vi khuẩn S aureus nghiên cứu (M5; M38; M62; M99) Đã xác định phân tích trình tự nucleotid chủng vi khuẩn mang gen SEB Trình tự gen SEB chủng M5, M38, M62, M99 có độ tương đồng cao với số chủng S aureus khác công bố ngân hàng gen giới ( NCBI) Gen SEB chủng M99 có độ tương đồng cao 100%, chủng M38 với mức tương đồng 99%, tiếp đến mức tương đồng chủng M62 M5 tương ứng 98% 96% Các chủng S aureus mẫn cảm mạnh với Gentamicin, Neomicin từ 60,0% đến 80,0% Ceftazidime, Colistin, Kanamicin, Enroflxacin, Tetracycline mẫn cảm trung bình với S aureus tỷ lệ 60,0% - 80,0% S aureus lại kháng Norfloxacin mạnh tới 60,0%; loại kháng sinh khác kháng thuốc với tỷ lệ thấp (20,0%-40,0% chủng thử nghiệm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 http://www.lrc-tnu.edu.vn KIẾN NGHỊ Trên sở kết xác định trình tự gen SEB chủng S aureus phân lập Thái nguyên - Việt Nam, tiếp tục nghiên cứu mở rộng để chuẩn bị nguồn kháng nguyên tái tổ hợp cho việc tạo kít chẩn đốn nhanh ngộ độc thực phẩm độc tố vi khuẩn S aureus Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Huy Chính (2003), Vi sinh y học, Nxb Y học, Hà Nội Chu Văn Mẫn, Đào Hữu Hồ (2002), Thống kê sinh học, Nxb ĐHQG HN Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thanh Yến, Phan Thị Kim, Nguyễn Thị Sợt, Nguyễn Thị Khánh Sâm (2005), Tình hình nhiễm vi khuẩn nhận thức vệ sinh an toàn thực phẩm người kinh doanh thức ăn đường phố Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, www.vfa.gov.vn Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc Việt Nam năm 2008, dự báo giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009, Cục an tồn vệ sinh thực phẩm, http://vfa.gov.vn/news.asp?ID=21322.9 Đơng Phương (2008), Đề phòng ngộ độc thực phẩm tụ cầu vàng, http://news.restaurants.com.vn/?page=tintuc&code=home&id=587 Lê Minh Sơn (2002), “Kết phân lập xác định số độc tố độc lực vi khuẩn Staphylococcus aureus thịt lợn vùng hữu ngạn sông Hồng”, Tạp chí KHKT Thú y Đỗ Ngọc Thúy (2006), “Đánh giá tình hình nhiễm số loại vi khuẩn gây bệnh thịt tươi địa bàn Hà Nội”, Tạp chí KHKT Thú y, 13(3) Phương pháp định lượng staphylococus aureus có phản ứng dương tính coagulase (staphylococcus aureus loài khác) đĩa thạch Phần 2: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ TCVN-4830 Phương pháp lấy mẫu thịt lợn tươi theo TCVN 4833-1:2002 TCVN 4833-2:2002, Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn 10.Phương pháp xác định tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus 1gam thịt lợn tươi thạch Chapman- TCVN-5256-90 Tài liệu tiếng nƣớc 11.Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K (2008), Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands, J Bacteriol, 190(1), 300310 12.Baba T., Takeuchi F., Kuroda M., Yuzawa H., Aoki K., Oguchi A., Nagai Y., Iwama N., Asano K., Naimi T., Kuroda H., Cui L.,Yamamoto K., Hiramatsu K (2002), Genome and virulence determinants of high virulence community- acquired MRSA, Lancet, 359(9320), 1819-1827 13.Bergdoll M S (1989), Staphylococcus aureus, Foodborne Bacterial Pathogens (Doyle, M.P., ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, 463-523 14.Bruce A G., KermitD.H.(2009),CBRNE-Staphylococcal Enterotoxin B, http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview 15 CAST (1994) CAST report: Foodborne Pathogens: Risks and Consequences Task Force Report No 122, Washington, DC: Council for Agricultural Science and Technology 16.Christopher L J., Saleem A K (1986), Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus, J bacteriology, 166(1), 29-33 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn 17.Gill S R., Fouts D E., Archer G L., Mongodin E F., Deboy R T., Ravel J., Paulsen I T., Kolonay, J F., Brinkac L., Beanan M., Dodson R J., Daugherty S C., Madupu R., Angiuoli S V., Durkin A S., Haft D H., Vamathevan J., Khour I H., Utterback T., Lee C., Dimitrov G., Jiang L., Qin H., Weidman J., Tran K., Kang K., Hance I R., Nelson K E., Fraser C M (2005), Insights on evolution of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early methicillinresistant Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing methicillinresistant Staphylococcus epidermidis strain, J Bacteriol, 187, 2426-2438 18.Greenfield R A., Brown B R., Huntchins J B., Iandolo J J., Jackson R., Slater L N., Bronze M S (2002), Microbiological, biological, and chemical weapons of warfare and terrorism, The American Journal of the Medical Science, 323(6), 326-340.9 19.Haeghebaert S., Le Q F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V (2002), Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000, Bull Epidémiol Hebdo, 23, 105-109 20.Holden M T.,Feil E J., Lindsay J A., Peacock S J., Day N P., Enright M C., Foster T J., Moore C E., Hurst L., Atkin R.,Barron A., Bason N., Bentley S D., Chilling W C., Chilling W.T., Churcher C., Clark L., Corton C., Cronin A.,Doggett J., Dowd L., Feltwell T., Hance Z., Harris B., Hauser H.,Holroyd S., Jagels K., James K D., Lennard N., Line A., Mayes R.,Moule S., Mungall K., Ormond D., Quail M A., Rabbinowitsch E., Rutherford K., Sanders M., Sharp S., Simmonds M., Stevens K.,Whitehead S., Barrell B G., Spratt B G., Parkhill J (2004), Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance, Proc Natl Acad Sci USA, 101(26), 9786-9791 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn 21.Huang L Y., Bergdoll M S (1970), The primer structure of staphylococcal enterotoxin B, J Biol Chem, 245, 3518-3525.(20h) 22.Kuroda M., Ohta T., Uchiyama I., Baba T., Yuzawa H., Kobayashi I., Cui L., Oguchi A., Aoki K., Nagai Y., Lian J., Ito T., Kanamori M., Matsumaru H., Maruyama A., Murakami H., Hosoyama A., Mizutani U Y., Takahashi N K., Sawano T., Inoue R., Kaito C., Sekimizu K., Hirakawa H., Kuhara S., Goto S., Yabuzaki J., Kanehisa M., Yamashita A., Oshima K., Furuya K., Yoshino C., Shiba T., Hattori M., Ogasawara N., Hayashi H., Hiramatsu K (2001), Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus, Lancet, 357(9264), 1225-1240 23.Mead, P.S., Slutsker, L., Griffin, P.M and Tauxe, R.V (1999) Food – related illness and death in the United State Emerging Infect Dis 5: 607 – 652 24.Nema V., Agrawal R., Kamboj D V., Goel A K., Singh L (2007), Isolation and characterization of heat resistant enterotoxigenic Staphylococcus aureus from a food poisoning outbreak in Indian subcontinent, Int J Food Microbiol, 117(1), 29-35 25.Ono H K., Omoe K., Imanishi K., Iwakabe Y., Hu D L., Kato H (2008), Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins, types S and T, Infect Immun, 76(11), 4999-5005 26.Quinn.P.J, Carter.M.E, Markey.B.K, Carter.G.R (1994), Clinical Veterinary Microbiology Wolfe publishing Mosby-Year Book Europe Limited 27.Rosec J P., Gigaud O (2002), Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France, Int J Food Microbiol, 77, 61-70 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn 28.S Reinstein, J T Fox, X Shi, and T G Nagaraja Prevalence of Escherichia coli O157:H7 in Gallbladders of Beef Cattle Applied and Environmental Microbiology, February 2007, p 1002 – 1004, Vol.73, No 29.Steven R G., Derrick E F., Gordon L A (2005), Insights on Evolution of Virulence and Resistance from the Complete Genome Analysis of an Early Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strain and a Biofilm-Producing Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis Strain, J Bacteriol, 187(7), 2426–2438 PMCID: PMC1065214 30.Wallace,.D.J, Van Gilder,T., Shallow, S., Fiorentino, T., Segler, S.D., Smith, K.E., Shiferaw, B., Etzel, R., Garthright, W.E., Angulo, F.J and the FoodNet Working Group (2000) Incidence of Foodborne Illesses Reported by the Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet)-1997.J Food Prot 63: 807 – 809 31.Wieneke A A., Roberts D., Gilbert R J (1993), Staphylococcal food poisoning in the United Kingdom, 1969-90, Epidemiol Infect, 110, 519-531 32.Yarwood J M., McCormick J K., Paustian M L., Orwin P M., Kapur V., Schlievert P M (2002), Characterization and expression analysis of staphylococcus aureus pathogenicity island Implications for the evolution of staphylococcal pathogenicity islands, J Biol Chem, 277(15), 13138-13147 33.Yves L L., Florence B., Michel G (2003), Staphylococcus aureus and food poisoning, Genet Mol Res, 2(1), 63-76 Tài liệu internet 34.http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/dai-cuong-an-toan-thucpham.271194.html Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn 35.http://vi.wikipedia.org/wiki/Cơ_chế_độc_lực_của_vi_khuẩn 36.http://vi.wikipedia.org/wiki/Tụ_cầu_khuẩn 37.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn Phụ lục 2.1: Thiết kế mồi Staphylococcus aureus enterotoxin B (seb) gene, partial cds >gi|56673482|gb|AY852244.1| Staphylococcus aureus enterotoxin B (seb) gene, partial cds GAGAGTCAACCAGATCCTAAACCAGATGAGTTGCACAAATCGAGTAAATTCACTGGTTTGATGGAAAATA TGAAAGTTTTGTATGATGATAATCATGTATCAGCAATAAACGTTAAATCTATAGATCAATTTCTATACTT TGACTTAATATATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGAATTATGATAATGTTCGAGTCGAATTTAAAAAC AAAGATTTAGCTGATAAATACAAAGATAAATACGTAGATGTGTTTGGAGCTAATTATTATTATCAATGTT ATTTTTCTAAAAAAACGAATGATATTAATTCGCATCAAACTGACAAACGAAAAACTTGTATGTATGGTGG TGTAACTGAGCATAATGGAAACCAATTAGATAAATATAGAAGTATTACTGTTCGGGTATTTGAAGATGGT AAAAATTTATTATCTTTTGACGTACAAACTAATAAGAAAAAGGTGACTGCTCAAGAATTAGATTACCTAA CTCGTCACTATTTGGTGAAAAATAAAAAACTCTATGAATTTAACAACTCGCCTTATGAAACGGGATATAT TAAATTTATAGAAAATGAGAATAGCTTTTGGTATGACATGATGCCTGCACCAGGAGATAAATTTGACCAA TCTAAATATTTAATGATGTACAATGACAATAAAATGGTTGATTCTAAAGATGTGAAGATTGAAGTTTATC TTACGACAAAGAAAAAGTGA ESQPDPKPDELHKSSKFTGLMENMKVLYDDNHVSAINVKSIDQFLYFDLIYSIKDTKLGNYDNVRV EFKNKDLADKYKDKYVDVFGANYYYQCYFSKKTNDINSHQTDKRKTCMYGGVTEHNGNQLDKYRSI TVRVFEDGKNLLSFDVQTNKKKVTAQELDYLTRHYLVKNKKLYEFNNSPYETGYIKFIENENSFWY DMMPAPGDKFDQSKYLMMYNDNKMVDSKDVKIEVYLTTKKK* A segment of gene encoding four desired histidines only (336 nucleotides, 112 codons) TTGCACAAATCGAGTAAATTCACTGGTTTGATGGAAAATA TGAAAGTTTTGTATGATGATAATCATGTATCAGCAATAAACGTTAAATCTATAGATCAATTTCTATACTT TGACTTAATATATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGAATTATGATAATGTTCGAGTCGAATTTAAAAAC AAAGATTTAGCTGATAAATACAAAGATAAATACGTAGATGTGTTTGGAGCTAATTATTATTATCAATGTT ATTTTTCTAAAAAAACGAATGATATTAATTCGCATCAAACTGACAAACGAAAAACTTGTATGTATGGTGG TGTAACTGAGCATAAT Primers used for amplifying a segment of gene encoding four desired histidines P-SEB-F: 5’ ATGTTGCACAAATCGAGTAAATTC 3’ (24 mer) p-SEB-R: 5’ TCAATTATGCTCAGTTACACCACC 3’ (24 mer) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm số đặc tính vi khuẩn Staphylococcus aureus gây độc tố đường ruột nhóm B thịt lợn Thái Nguyên. ” 2.Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tỉ lệ nhiễm đặc tính... thức ăn b? ?? nhiễm vi khuẩn, độc tố vi khuẩn có chứa chất có tính chất độc hại người Trong số vi sinh vật sinh độc tố gây b? ??nh có tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) nguyên nhân gây ngộ độc thực... mầm b? ??nh vi sinh vật xác định vai trò gây b? ??nh [15] Các mầm b? ??nh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng virus, loại vi khuẩn gây tới 90% số ca b? ??nh tử vong người Số hóa Trung tâm Học