Đánh giá khả năng chịu lạnh và tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh từ các giống lúa xuân châu hương q5 c27 khang dân u17 và nhị ưu 63 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TĂNG THỊ NGỌC MAI ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG, Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – Năm 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực Một số kết công bố TĂNG THỊ NGỌC MAI PGS TS Nguyễn Thị Tâm, phần lại chưa cơng bố cơng trình khác ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH Tác giả DÒNG VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG, Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Tăng Thị Ngọc Mai Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.46.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên – Năm 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực Một số kết công bố PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Tăng Thị Ngọc Mai Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng (phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào vi sinh), KTV Đào Thu Thủy (phịng thí nghiệm Di truyền - Sinh học đại) Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm, khoa Sau đại học, môn Sinh học phân tử Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN thầy cô giáo, cán khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hoàn thành luận văn Tác giả luận văn Tăng Thị Ngọc Mai Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4D – Axit dichlorphenoxyacetic ADN Axit deoxyribo nucleic BAP – Benzyl amino purin bp Cặp base (base pair) cs Cộng cADN Sợi ADN bổ sung tổng hợp từ mARN nhờ enzym phiên mã ngược ĐC Đối chứng ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ EDTA Axit ethylen diamin tetra axetic kb Kilobase MS Môi trường Murashige Skoog mARN ARN thông tin NAA Axit α – naphthyl axetic (α – naphthyl acetic acid) PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase R0 Cây tái sinh từ mô sẹo R1 Thế hệ thứ tái sinh RAPD Random Amplified Polymorphic DNA - Phân tích đa hình ADN nhân ngẫu nhiên TAE Tris axetat EDTA TTC 2,3,5, Trichloterazolium- chlorid CTAB Cetyl trimetyl amoni bromua Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt iii Mục lục i Danh mục bảng iv Danh mục hình v MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lúa 1.1.1 Nguồn gốc phân loại lúa 1.1.2 Giá trị kinh tế lúa 1.1.3 Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam 1.1.4 Đặc điểm sinh học lúa nước 1.2 Lạnh chế chịu lạnh 1.2.1 Khái niệm tính chịu lạnh thực vật 1.2.2 Tác động lạnh lên thực vật 1.2.3 Cơ chế chịu lạnh thực vật khả khắc phục 1.2.4 Tác hại lạnh tính chịu lạnh lúa 10 1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá nâng cao khả chống chịu trồng 11 1.3.1 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá khả chống chịu trồng mức độ mô - tế bào 11 1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả chống chịu trồng 12 1.4 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích hệ gen thực vật .14 1.4.1 Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) 14 1.4.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 14 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu .17 2.1.1 Vật liệu thực vật 17 2.1.2 Hoá chất thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 18 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng 20 2.2.3 Phương pháp phân tích hố sinh 21 2.2.4 Phương pháp phân tích sinh lý 23 2.2.5 Phương pháp sinh học phân tử 24 2.2.6 Xử lý kết tính tốn số liệu 26 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết đánh giá khả chịu lạnh giống lúa 27 3.1.1 Khả chịu lạnh giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm 27 3.1.2 Khả chịu lạnh giống lúa giai đoạn mạ 33 3.1.3 Khả chịu lạnh giống lúa mức độ mô sẹo 37 3.2 Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh giống lúa nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro 45 3.2.1 Kết sàng lọc dòng tế bào chịu lạnh 45 3.2.2 Phân tích mức độ biến động di truyền quần thể R0 46 3.2.3 Kết phân tích đa hình ADN số dòng lúa nghiên cứu kỹ thuật RAPD .47 3.2.3.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ lúa số dịng R1 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh giống XCH 48 3.2.3.2 Phân tích đa hình kỹ thuật RAPD 49 3.2.3.3 Mối quan hệ di truyền dòng lúa nghiên cứu 58 3.2.3.4 Kết luận phân tích đa hình ADN hệ gen dịng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh giống XCH kỹ thuật RAPD 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .61 CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm giống lúa nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Trình tự nucleotit 10 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3.1 Hàm lượng đường khử giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C 27 Bảng 3.2 Hoạt độ α - amylase giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C 30 Bảng 3.3 Tương quan hoạt độ α - amylase hàm lượng đường khử 32 Bảng 3.4 Tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại xử lý lạnh 40C± 0,50C 32 giai đoạn mạ giống nghiên cứu .34 Bảng 3.5 Hàm lượng diệp lục lúa sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C giai đoạn mạ giống lúa nghiên cứu 35 Bảng 3.6 Khả tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng khả tái sinh giống lúa 38 Bảng 3.7 Tỷ lệ sống sót mô sẹo sau xử lý lạnh 50C ± 0,50C nuôi phục hồi tuần 39 Bảng 3.8 Giá trị OD 485 nm mô sẹo giống lúa nghiên cứu .40 Bảng 3.9 Tốc độ sinh trưởng tương đối mô sẹo sau xử lý lạnh 41 Bảng 3.10 Khả tái sinh chồi mô sẹo sau xử lý lạnh 43 Bảng 3.11 Mức độ biến động số tiêu nông học quần thể R0 tái sinh từ mô sẹo chịu lạnh giống XCH .46 Bảng 3.12 Độ tinh hàm lượng ADN mẫu lúa nghiên cứu .48 Bảng 3.13 Tổng số phân đoạn ADN nhân mẫu lúa phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 49 Bảng 3.14 Phân tích đa hình phân đoạn ADN nhân với 10 mồi ngẫu nhiên mẫu lúa nghiên cứu .50 Bảng 3.15 Thống kê phân đoạn ADN nhân phản ứng RAPD với mồi ngẫu nhiên 57 Bảng 3.16 Hệ số đồng dạng di truyền dòng hệ R1 giống gốc XCH.58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 18 Hình 3.1 Hàm lượng đường khử giống lúa nghiên cứu giai đoạn nảy mầm xử lý lạnh 120C ± 0,50C 29 Hình 3.2 Hoạt độ α - amylase giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C 31 Hình 3.3 Tỷ lệ chết tỷ lệ thiệt hại xử lý lạnh 40C± 0,50C giai đoạn mạ giống nghiên cứu 34 Hình 3.4 Hàm lượng diệp lục giống sau xử lý lạnh 120C ± 0,50C 36 Hình 3.5 Tỷ lệ mơ sẹo sống sót sau xử lý lạnh ni phục hồi .40 Hình 3.6 Tốc độ sinh trưởng tương đối mô sẹo sau xử lý lạnh 42 Hình 3.7 Khả tái sinh chồi mô sẹo sau xử lý lạnh .43 Hình 3.8 Một số hình ảnh nuôi cấy in vitro 45 Hình 3.9 Kết điện di ADN tổng số tách từ mẫu lúa giống XCH 48 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M2 51 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M4 52 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M7 53 Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M8 54 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M10 55 Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 56 Hình 3.16 Sơ đồ so sánh dòng hệ R1 giống gốc XCH mức độ phân tử sử dụng mồi M2, M4, M7, M8, M10, M14 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Lúa trồng thân thiết, lâu đời Việt Nam nhiều nước khác giới, đặc biệt nước châu Á Khoảng 40% dân số giới sử dụng lúa gạo làm nguồn lương thực Trên giới có 110 quốc gia sản xuất tiêu thụ gạo với mức độ khác Lượng lúa sản xuất mức tiêu thụ cao tập trung khu vực châu Á Ở Việt Nam, lúa trồng chiếm vị trí quan trọng kinh tế quốc dân Lúa gạo không nguồn cung cấp lương thực thiết yếu mà nguồn thu ngoại tệ đáng kể Theo số liệu thống kê năm 2010 Cục Trồng trọt, sản lượng lúa nước năm 2010 mức 39,9 triệu tấn, đó, tỉnh phía Nam chiếm 23,5 triệu tấn, riêng vùng đồng sông Cửu Long đạt sản lượng 21,5 triệu với suất bình quân 5,47 tấn/ha [55], [57], [58] Cây lúa (Oryza sativa L.) loại trồng mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Các yếu tố ngoại cảnh bất lợi thường xuyên tác động đến trình sinh trưởng phát triển lúa là: nhiệt độ cực đoan, hạn hán hay ngập úng, độ mặn, ánh sáng bất lợi… Một yếu tố nhiệt độ thấp Vùng núi phía Bắc, đồng sơng Hồng Bắc Trung Bộ khu vực thường xuyên chịu ảnh hưởng lạnh nguyên nhân giảm suất lúa vùng Lúa vụ đông xuân chịu tác động mạnh nhiệt độ thấp Vì vậy, nghiên cứu khả chịu lạnh tăng cường khả chống chịu với nhiệt độ thấp nhằm nâng cao suất ổn định sản lượng giống lúa yêu cầu thiết thực tỉnh miền Bắc khu vục Bắc Trung Bộ [3], [4] Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật lĩnh vực nhằm cải tiến trồng, đặc biệt chọn dịng tế bào có khả chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi Đây hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng sử dụng tạo giống trồng có khả chống chịu cao thời gian ngắn so với phương pháp truyền thống [2] Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: ‘‘Đánh giá khả chịu lạnh tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn dịng chịu lạnh từ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 Trong băng ADN nhân trên, xuất băng so với ĐC với kích thước 1,4 kb; 1,1 kb; 0,75 kb 0,6 kb Dịng D36 có băng ADN nhân bản, xuất thêm băng có kích thước 1,8 kb 0,6 kb Dịng 45 có băng ADN nhân xuất thêm băng ADN kích thước 1,35 kb so với ĐC Hai dịng D26 D32 có băng ADN nhân bản, có băng xuất có kích thước khoảng 1,1 kb băng có kích thước 0,8 kb Như vậy, đoạn mồi thể tính đa hình nhiều tổng số 10 đoạn mồi sử dụng phản ứng RAPD * Mồi M8 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M8 đuợc thể bảng 3.15 hình 3.13 XCH D05 D26 D32 D36 D45 M 10 kb 6kb 3kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M8 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN so giống gốc Băng ADN xuất so với giống gốc Hình 3.13 cho thấy, nhân ngẫu nhiên ADN mẫu lúa với mồi M8 thu băng ADN có kích thước dao động từ 0,4 - 1,9 kb có băng ADN thể tính đa hình chiếm 57,14 % tổng số băng ADN Dịng D26 có số băng ADN nhân nhất, có băng bị so với ĐC có kích thước 0,8 kb Dịng D32 D45 xuất băng ADN băng giống với ĐC Dịng D05 D36 có số băng ADN nhân nhiều với băng, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 có băng ADN xuất so với ĐC với kích thước 1,9 kb, 1,5 kb 1,25 kb * Mồi 10 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M10 đuợc thể bảng 3.15 hình 3.14 M XCH D05 D26 D32 D36 D45 10 kb kb kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M10 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN so giống gốc Băng ADN xuất so với giống gốc Kết điện di sản phẩm RAPD với mồi M10 hình 3.14 cho thấy, có băng ADN nhân có kích thước khoảng 0,55kb - 2,1 kb với 3/8 băng ADN đa hình chiếm 37,5% Dịng D05 D32 có nhiều băng ADN nhân so với ĐC (8 băng), dòng D26, D36 có băng ADN nhân Dịng có băng ADN nhân dòng D45 (5 băng) Trong dịng lúa ni cấy mơ có dòng (D05, D26, D32, D36) xuất băng ADN có kích thước khoảng 0,75 kb so với ĐC Riêng hai dòng D05 D32 xuất thêm băng ADN có kích thước vào khoảng 1,4kb 0,55 kb Dịng D45 có băng ADN giống với ĐC Như vậy, dịng D05 D32 có sai khác genome nhiều so với ĐC dòng nghiên cứu * Mồi 14 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 đuợc thể bảng 3.15 hình 3.15 Điện di sản phẩm phản ứng RAPD với mồi M14 (hình 3.15), chúng tơi thu tổng số băng ADN có kích thước dao động từ 0,85 - 3,2 kb Trong tổng số băng ADN có tới băng ADN biểu tính đa hình chiếm 55,56 % Dịng D05, D26, D32 D36 có băng ADN nhân (7 băng) Dịng có băng ADN D45 (6 băng) M XCH D05 D26 D32 D36 D45 10 kb kb kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm RAPD mẫu lúa với mồi M14 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN so giống gốc Băng ADN xuất so với giống gốc Tất dịng có sai khác so với ĐC xuất băng 1,8 kb băng có kích thước khoảng 1,7 kb 0,85kb so với ĐC Ba dòng D26, D32 D36 xuất thêm băng có kích thước 1,9kb Dịng D05 xuất thêm băng ADN có kích thước 1,0 kb Như vậy, xuất hay biến băng ADN với mồi M14 lần chứng tỏ dịng lúa R1 có có thay đổi mức độ genome so với giống gốc Qua kết phân tích sản phẩm RAPD mồi ngẫu nhiên với mẫu lúa nghiên cứu cho thấy, mẫu lúa có khác mặt di truyền Để thiết lập mối quan hệ tương đồng di truyền, chúng tơi tiến hành mã hố số liệu băng ADN thu ký tự theo qui ước 1= xuất băng ADN, 0= không xuất băng ADN Kết thống kê băng ADN mẫu lúa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 nghiên cứu tiến hành phản ứng RAPD với mồi đa hình trình bày bảng 3.15 Bảng 3.15 Thống kê băng ADN nhân phản ứng RAPD với mồi ngẫu nhiên Mồi M2 M7 M8 Kb Dòng Gốc 05 26 32 36 45 Mồi Kb Dòng Gốc 05 26 32 36 45 2,6 1 1 1 2,0 1 0 1,8 1 1 1 1,75 1 1 1,55 1 1 1,5 1 1 1,25 0 0 1,2 0 1,1 1 1 1 1,0 1 1 1 0,8 1 1 1 0,75 1 1 1 0,75 1 1 0,6 1 1 1 0,7 0 0,5 1 1 1 0,6 0 0 0,4 1 1 1 2,0 1 1 1 2,1 1 1 1 1,8 0 0 1 1,4 1 0 1,55 0 0 1,3 1 1 1 1,4 0 0 1,1 1 1 1 1,35 0 0 0,8 1 1 1 1,25 1 1 1 0,75 1 1 1,1 1 0 0,65 1 1 1 1,0 1 1 1 0,55 1 0 0,8 1 0 3,4 1 1 1 0,75 0 0 2,5 1 1 1 0,6 0 1,9 0 1 1,9 0 1,8 1 1 1,5 0 1,7 1 1 1,25 0 0 1,5 1 1 1,1 1 1 1 1,25 1 1 1 0,8 1 1 1,0 0 0 0,55 1 1 1 0,85 1 1 1 0,4 1 1 1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên M4 M10 M14 http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 Với tổng số 221 băng ADN thu mẫu lúa nghiên cứu, tiến hành xử lý số liệu phần mềm NTSYS 2.0 để thiết lập mối quan hệ di truyền sơ đồ hình 3.2.3.3 Mối quan hệ di truyền dòng lúa nghiên cứu Dựa xuất biến băng ADN dòng nghiên cứu so với giống gốc điện di sản phẩm RAPD với mồi M2, M4, M7, M8, M10 M14, xác định hệ số đồng dạng di truyền dòng nghiên cứu so với giống gốc mức độ phân tử Dựa xuất hay không xuất băng ADN dòng điện di sản phẩm RAPD thống kê, thiết lập mối quan hệ dòng mức độ phân tử Số liệu tính tốn phân tích theo chương trình NTSYSpc version 2.0 (theo quy ước 1: xuất hiện; 0: khơng xuất hiện) để tìm sai khác dịng lúa thơng qua biểu đồ hình cây, theo phương pháp tính hệ số di truyền giống (DICE) kiểu phân nhóm (UPGMA) Kết trình bày bảng 3.16 hình 3.16 Bảng 3.16 Hệ số đồng dạng di truyền dòng hệ R1 giống gốc XCH XCH D05 D26 D32 D36 XCH 1.0000 D05 0,5472 1,0000 D26 0,7736 0,6604 1,0000 D32 0,7358 0,7359 0,9245 1,0000 D36 0,7169 0,7548 0,8302 0,7925 1,0000 D45 0,8302 0,6038 0,8679 0,8301 0,8113 D45 1,0000 Bảng 3.16 cho thấy, hệ số tương đồng di truyền dòng lúa nghiên cứu giống gốc XCH dao động từ 0,5472 - 0,9245 Hệ số tương đồng thấp so sánh D05 với XCH, cặp giống D26 với D32 Kết so sánh khác dòng nghiên cứu so với giống gốc cho thấy, dòng hệ R1 giống gốc có hệ số tương đồng di truyền sai khác chia làm hai Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 nhánh cây: Nhánh gồm dòng D05 có hệ số sai khác so với giống gốc XCH 0,4528 (1 - 0,5472) sai khác so với dòng khác 0,0566 (0,6604 - 0,6038) Nhánh hai chia thành nhánh phụ: - Nhánh phụ giống gốc XCH - Nhánh phụ hai gồm hai nhánh nhỏ, nhánh nhỏ gồm dòng D26, D32, D45, nhánh nhỏ hai có dịng D36 Trong hai dịng D26, D32 có hệ số sai khác so với giống gốc 0,2264 (1 - 0, 7736) 0,2831 (1 - 0,7358) Đồng thời, hệ số sai khác hai dòng nhỏ 0,0755 (1 - 0,9245) XCH D26 D32 D45 D36 D05 0,66 0,73 0,80 0,86 0,92 Hệ số đồng dạng Hình 3.16 Sơ đồ so sánh dòng hệ R1 giống gốc XCH mức độ phân tử sử dụng mồi M2, M4, M7, M8, M10, M14 Hình 3.16 cho thấy, khác mức độ phân tử biểu hệ số sai khác dòng so với đối chứng Như vậy, sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích đa dạng di truyền dòng lúa so với giống gốc Sự đa hình sản phẩm RAPD kết thay đổi điểm gắn mồi (đột biến điểm) thay đổi nhiễm sắc thể vùng nhân (thêm đoạn, hay đảo đoạn) gây thay đổi kích thước hay ngăn cản nhân ADN mẫu Do đa hình thường nhận có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 mặt hay vắng mặt sản phẩm nhân từ locus Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu chọn dòng chịu hạn, chịu nóng với giống CR203 [27] chọn dịng chịu lạnh giống C71 [8] Các nghiên cứu gần rằng, kỹ thuật RAPD sử dụng để xác định đặc tính có nguồn gốc từ ni cấy mơ tế bào 3.2.3.4 Kết luận phân tích đa hình ADN hệ gen dịng lúa có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu lạnh giống XCH kỹ thuật RAPD (1) Đã tách chiết ADN với hàm lượng chất lượng tốt đảm bảo cho nghiên cứu (2) Phân tích đa hình mẫu lúa với 10 mồi ngẫu nhiên có 6/10 mồi cho tính đa hình Trong đó, mồi M7 cho tính đa hình cao (63,64%) mồi M10 cho tính đa hình thấp (37,5%) (3) Phân tích băng ADN nhân sử dụng đoạn mồi M2, M4, M7, M8, M10 M14 xác định hệ số sai khác dòng giống gốc dao động từ 0,0755 (1 - 0,9245) đến 0,4528 (1 - 0,5472) (4) Biểu đồ hình hệ số tương đồng di truyền mẫu lúa nghiên cứu xếp thành nhánh chính: nhánh gồm dịng D05, nhánh gồm nhánh phụ (nhánh phụ 1: giống gốc XCH; nhánh phụ gồm nhánh nhỏ: nhánh nhỏ gồm dòng D26, D32 D45; nhánh nhỏ gồm D36) Như vậy, dòng nghiên cứu hệ R1 có thay đổi đáng kể mức độ phân tử gen Sự thay đổi sở để lựa chọn vật liệu khởi đầu cho công tác cải tạo giống lúa chịu lạnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Ở giai đoạn hạt nảy mầm, tác động nhiệt độ thấp 120C ± 0,50C, hoạt độ α - amylase, hàm lượng đường khử có xu hướng tăng từ đến ngày tuổi, bắt đầu giảm ngày tuổi Sự biến động hoạt độ α -amylase, hàm lượng đường khử biểu khác giống Trong đó, hàm lượng đường khử hoạt độ enzyme α - amylase cao giống XCH, thấp giống C27 Ở giai đoạn mạ lá, giống lúa phản ứng khác lạnh Sau xử lý lạnh, hàm lượng diệp lục giảm nhiều giống C27 giảm giống XCH Tỷ lệ chết thiệt hại cao giống C27 thấp giống XCH Xử lý mô sẹo nhiệt độ 50C ± 0,50C với ngưỡng thời gian ngày không làm ảnh hưởng tới sinh trưởng mô sẹo, ngược lại cịn kích thích sinh trưởng mô sẹo Tăng thời gian xử lý lạnh lên 9, 11, 13, 15 ngày làm ức chế sinh trưởng mô sẹo so với đối chứng Mô sẹo giống sau xử lý lạnh có tỷ lệ tái sinh cao đối chứng ngưỡng 1, ngày Ngưỡng chọn dòng chịu lạnh giống U17, NƯ, KD, XCH 15 ngày, ngưỡng chọn dòng chịu lạnh giống Q5 13 ngày ngưỡng chọn dòng chịu lạnh giống C27 11 ngày 50C ± 0,50C Kết tạo 86 dịng mơ 210 dịng xanh Quần thể R0 có mức độ biến động di truyền cao nhiều tính trạng nơng học, cho phép lựa chọn dịng có tính trạng mong muốn Khả chịu lạnh giống nghiên cứu xếp theo thứ tự sau: XCH > U17 > KD > NƯ > Q5 > C27 Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen số dòng hệ R1 so với giống gốc XCH cho thấy: (a) Trong 10 mồi có mồi biểu tính đa hình, mồi M7 cho tính đa hình cao (63,64 %) mồi M10 cho tính đa hình thấp (37,5%) (b) Các dịng nghiên cứu hệ R1 có mức độ khác biệt di truyền so với giống gốc dao động từ 0,0755 đến 0,4528 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục theo dõi dòng thu hệ tiến hành phân tích sinh lý, hóa sinh sinh học phân tử dòng chọn lọc làm sở tuyển chọn dòng mang nhiều đặc điểm ưu việt để bồi dưỡng thành giống lúa có khả chịu lạnh cao Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Thị Tâm, Tăng Thị Ngọc Mai, Chu Hoàng Mậu (2011), “Đánh giá khả chịu lạnh giống lúa Xuân Châu Hương, Q5, C27, Khang dân, U17 Nhị ưu 63 kỹ thuật ni cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, tập 82, số 6, trang 103 - 108 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Vân Anh (2005), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền khả chịu hạn số giống lúa cạn địa phương, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả chịu lạnh chịu khô mức độ mơ sẹo lúa giống có nguồn gốc sinh thái khác nhau”, Tạp chí Sinh học, 17 (1), tr 25 – 29 Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu thiệt hại môi trường lúa, NXB Nơng nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo dục, tr 54 - 55 Phan Văn Chi cộng (1997), “Sử dụng số primer ngẫu nhiên để xác định RAPDs lúa DT - 33 Tám thơm”, Tạp chí Di truyền ứng dụng, 4, tr 15 - 18 Nguyễn Lân Dũng (1979), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 3, NXB Giáo dục, Hà Nội, tr 116 - 120 Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phịng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (1999), “Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá tính đa hình DNA số dịng chọn lọc từ mơ sẹo giống C71”, Hội nghị Công nghệ Sinh học tồn quốc, Hà Nội, tr.1341 - 1347 Trương Đích (2000), Kỹ thuật trồng giống lúa nước, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2007), „„Cấu trúc vector plasmid mang gen kháng sâu ứng dụng tạo trồng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens‟‟, Hội nghị Khoa học Công nghệ 2007, tr 345 - 350 11 Nguyễn Thu Giang (2008), Đánh giá khả chịu hạn tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK kỹ thuật nuôi cấy in vitro, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 12 Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), „‘Tạo thuốc kháng thuốc trừ cỏ côn trùng ‟‟, Hội nghị Khoa học Công nghệ 2007, tr 351 - 357 13 Nguyễn Thị Thu Hoài (2005), Nghiên cứu khả chịu hạn mối quan hệ di truyền số giống lúa cạn địa phương, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên 14 Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên 15 INGER, IRRI (1996), Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa, Xuất lần thứ 4, Tài liệu dịch Viện Khoa học kỹ thuật Việt Nam, 59 trang 16 Nguyễn Thị Hồng Liên (2010), Đánh giá khả chịu mặn tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu mặn từ giống lúa OM4498, VND95 - 20, IR64, CR203 kỹ thuật nuôi cấy in vitro, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên 17 Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hố sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội 18 Nguyễn Hồng Lộc (1992), Chọn dịng chịu muối NaCl chịu nước thuốc (Nicotiana tabacum L.), Luận án phó Tiến sĩ Sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học Hà Nội 19 Nguyễn Hồng Lộc, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1992), “Nghiên cứu khả chịu nước mô sẹo thuốc ni cấy in vitro”, Tạp chí Sinh học, 14, tr 31 -37 20 Chu Văn Mẫn (2001), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội 21 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, Nxb Đại học Sư phạm Thái Nguyên 22 Hồ Hữu Nhị, Hoàng Thị Yên (2001), “Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn công tác chọn tạo giống lúa”, Những vấn đề khoa học sống, tr 105 - 110 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 65 23 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dịng chịu hạn lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học ,Hà Nội 24 Đinh Thị Phịng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995), “Sử dụng cơng nghệ tế bào thực vật để chọn dịng chịu nước lúa”, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 27-38 25 Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn tú, Phạm Xuân Hội (2009), “Nghiên cứu phân lập chuyển gene MtOsDREB2A điều khiển tính chịu hạn vào giống lúa Chành trụi thơng qua Agrobacterium”, Tạp chí Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, 31(2),tr 79-88 26 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dịng chịu nóng lúa cơng nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 27 Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thu Giang (2008), “Đánh giá đa hình ADN số dịng lạc có nguồn gốc từ mơ sẹo nước”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, số 4, tập 1, tr 58 - 64 28 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hố sinh hạt tính đa dạng di truyền số giống đậu xanh có khả chịu hạn khác nhau, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên 29 Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2010), “Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử số giống ngô (Zea mays L.) kỹ thuật RAPD”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, số 10, tr 69 - 73 30 Lị Thị Mai Thu, Chu Hồng Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Bình (2008), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống lúa cạn có khả chịu hạn khác nhau”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, số 3, tập 1, tr 57 - 63 31 Nguyễn Thanh Tường, Nguyễn Bảo Vệ, Võ Công Thành (2005), “Khả chịu mặn đa dạng di truyền protein dự trữ số giống lúa trồng ven biển đồng sơng Cửu Long”, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, số 3, tr 49 - 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 66 32 Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1994), Chọn dịng chịu muối lúa cơng nghệ nuôi cấy tế bào thực vật, Kỉ yếu Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, tr 19 - 27 33 Viện Nơng hóa thổ nhưỡng (1998), Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, trồng, Nxb Nơng nghiệp 34 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1999), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 35 Adkins S W., Shiraishi T., Kunanuvatchaidach R., Godwin I D (1995), “Somaclonal variation in rice drought - tolerance and other agrnomic characters”, Aust J Bot 4, pp 201 - 209 36 Alia, Hayashi H., Sakamoto A., Murata N (1998), “Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine”, Plant J 16 (2), pp 155 - 161 37 Benze Xiao (2007), “Over - expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field condition”, Theor Appl Genet, 115, pp 35 - 46 38 Bertin P., Bouharmont J., Kinet J M (1997), “Somaclonal variation and improvement of chilling tolerance in rice: Chance in chilling-induce chlorophyll fluorescence”, Crop Sci, 37, pp 1727-1735 39 Bouharmont J., Dekeyser A (1989), “In vitro selection for cold and salt tolerance in rice”, Review of Advance in Plant Biotechnology, 1985 - 88 IMWIC & IRRI, pp 308 - 313 40 Bertin P., Kinet J M., Bouharmont J (1995), “Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal variation and cell line selection”, Aust J Bot, 44, pp 91-105 41 Dang Minh Tam, Nguyen Thi Lang (2003), “In vitro selecsion for salt tolerance in rice”, Omonrice, pp 68-73 42 Foolad M.R., Siva A., and Rodriguez L R (1995), Application of polymerase chain reaction (PCR) to plant genome analysis, In: Tissue and organ culture, Fundamental method, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, pp 281- 298 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 67 43 Gamborg O L., Phillip G C (1995), Basal media for plant cell and tissue culture in: Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental methods, Springer Heidelberg, pp 301 - 306 44 Honghong Hu., Xiong Lizhong (2004), “Transcription factor gene OsNACx from rice and use thereof for improving plant tolerance to drought and salt”, Patent Application Publication 45 M Al - Forkan, M A Rahim, T Chowdhury, P Akter and L Khaleda (2005), “Deverlopment of highly in vitro callogeenesis and regeneration system for some salt tolerance rice cultivars of bangladesh”, Biotechnology (3), pp 230 - 234 46 Monna L., Miyao A., takakazu L., Fukuora S (1994), “Detremination of APD maker in rice and their conversion into sequence tagged sites (STSs and STS Specific primer”, Research 1, pp 139 - 148 47 Mundy J., Chua H N (1998), “Abcisis acid and water stress induce the expression of a novel rice gene”, EMBOJ, 8, pp 2279 - 2286 48 Nakamura T., Yokota S., Muramoto Y., (1997), “Expression of a betaine aldehyde dehydrogenase gene in rice, a glycine betaine nonaccumulator and possible localization of its protein in peroxisomes”, Plant J 11, pp 1115 - 1120 49 Qiuyun Wang, Yucheng Guan, Yaorong Wu, Honglin Chen, Fan Chen, Chengcai Chu (2008), “Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt, drought, and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice”, Plant Mol Biol, 67, pp 589 - 602 50 Renata Pereira da Cruz, Sandra Cristina Kothe Milach (2004), “Cold tolerance at the germination stage of rice: methods of evaluation and characterization of genotypes”, Sci Agric (Piracicaba, Braz.), v.61, n.1, pp 1- 51 Sakamoto A., Alia, Murata N., Murata A., (1999), “Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and and tolerance to salt and cold”, Plant Mol Biol, 40(1), pp 195 52 Towill L E., Mazur P (1975), “Studies on the reduction of 2, 3, triphenyltetrazolium chloride as a viability assay for plant tissue cultures”, Can J Bot 53, pp.1097 - 1102 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 53 Welsh J., McClelland M (1991), “Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primer”, Nucleic Acids Res 18, pp 7213- 7218 54 Williams J.G.K., Kubelic A.E., Levak K.J., Rafajski J.A., Tingey S.V (1990), “DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic marker”, Nucl Acids Res 18 (22), pp 6531- 6535 Trang web 55 http://agro.gov.vn 56 http://www.baomoi.com/San-xuat-lua-gao-nam-nay-ra-sao/45/5703715.epi 57 http://fao.org.vn 58 http://kinhtenongthon.com.vn 59 http://www.agro.gov.vn/news/newsdetail.aspx?targetid=18467 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU LẠNH Tác giả DÒNG VÀ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN CHỊU LẠNH TỪ CÁC GIỐNG LÚA XUÂN CHÂU HƢƠNG, Q5, C27, KHANG DÂN, U17 VÀ NHỊ ƢU 63 BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO. .. hại lạnh tính chịu lạnh lúa 10 1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh giá nâng cao khả chống chịu trồng 11 1.3.1 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc đánh. .. chịu lạnh giống lúa giai đoạn hạt nảy mầm 27 3.1.2 Khả chịu lạnh giống lúa giai đoạn mạ 33 3.1.3 Khả chịu lạnh giống lúa mức độ mô sẹo 37 3.2 Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu lạnh