Toluene degradation of biofilm formed by photosynthetic purple bacteria isolated from oil polluted water samples taken at cau da port khanh hoa

T p h ho h HQGHN: ho h T nhi n v C ng ngh T p 33 S 2S (2017) 71-76 Hi u suất phân hủy toluene ủ m ng sinh h h i hủng vi khuẩn t qu ng hợp phân l p từ nướ nhiễm dầu ảng Cầu hánh Hò t o th nh Nguyễn Thị Minh Nguy t1,2,*, ỗ Thị Li n3 Cung Thị Ng Ho ng Phương H 2,3 L Thị Nhi C ng2,3 M i3 , Trường ĐHSP Hà Nội 2, Xuân Hoà, Phúc Yên, Vĩnh Phúc, Việt Nam H c viện hoa h c ng nghệ, V ST, Hoàng u c Việt, Hà Nội, Việt Nam Viện ng nghệ Sinh h c, V ST, Hoàng u c Việt, Hà Nội, Việt Nam Nh n ng y 16 tháng năm 2017 Chỉnh sử ng y 20 tháng năm 2017; Chấp nh n đăng ng y 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Toluene l hợp hất hydro rbon thơm ó t nh độ o l i khó bị phân huỷ t nhi n Do vi nghi n ứu phương pháp xử lý nhiễm toluene đ ng trở th nh vấn đề ấp bá h Trong s phương pháp phân huỷ toluene phương pháp xử lý sinh h hủng vi khuẩn t qu ng hợp đượ nh kho h tr n giới v Vi t N m qu n tâm nghi n ứu Từ mẫu nướ biển nhiễm t i Cảng Cầu Nh Tr ng hánh Ho húng t i phân l p đượ hủng vi khuẩn CC Py2 CC Py9 vừ ó khả phân huỷ toluene vừ ó khả t o biofilm t t hi nu i tr n m i trường DSMZ – 27 th h khuẩn l ủ hủng CC Py2 ó nhân lồi trịn bề mặt bóng m u nâu v ng d = - mm; khuẩn l ủ hủng CC Py9 hình trịn m u hồng nh t ó nhân rì d = - mm H i hủng n y sinh trưởng t t 30 oC, pH nồng độ mu i 5% Biofilm hủng CC Py2 v hủng CC Py9 t o th nh ó khả phân huỷ đượ 96 1% v 97 2% toluene với nồng độ b n đầu l 150 mg/l H i hủng n y ó thể đượ sử dụng để xây d ng sưu t p hủng vi khuẩn t qu ng hợp t o m ng sinh h phân huỷ toluene nói ri ng v phân huỷ hydro rbon thơm dầu mỏ nói Từ khoá: M ng sinh h phân hủy sinh h phân huỷ toluene vi khuẩn t qu ng hợp Mở đầu vịng benzene v y khó bị phân huỷ v độ với on người động v t ũng sinh thái Với đặ t nh dễ b y hợp hất hydro rbon thơm đơn nhân ó nhóm gắn với benzene nh u ảnh hưởng đến khả phân huỷ ủ vi sinh v t [1-2] Trong hợp hất hydro rbon thơm tr n toluene l hợp hất hữu ó nhóm CH3 gắn với vịng benzene v y ng khó bị phân hủy t nhi n Nhiều nghi n ứu hỉ r rằng, toluene ó ảnh hưởng nghi m tr ng Toluene, benzene, ethylbenzene xylene (TBEX) l hợp hất hydro rbon thơm đơn nhân ó xăng dầu mỏ ( khoảng 28%) Với đặ t nh dễ b y t n t t nướ v ó nhóm li n kết hặt hẽ ngo i _  Tá giả li n h T.: 84-978669773 Email: minhnguyet104@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4625 71 72 N.T.M Nguyệt nnk / Tạp chí hoa h c ĐH GHN: hoa h c Tự nhiên đến sứ khoẻ on người ảnh hưởng đến h thần kinh th m h ó thể gây tử vong bị tiếp xú tr tiếp hoặ thời gi n d i [3] Do t nh hất độ h i v ấu trú khó phân huỷ t nhi n n n vi phân huỷ toluene trở th nh vấn đề ấp bá h ần đượ qu n tâm Hi n bi n pháp v t lý v hó h xử lý nh nh v ó hi u tứ thời kh ng bi n pháp n y l i kh ng xử lý toluene h tri t để đượ Vi xử lý toluene theo phương pháp phân hủy sinh h v đ ng đượ nhiều nh kho h tr n giới ũng nướ qu n tâm Phương pháp n y ó ưu điểm vượt trội như: n to n với m i trường đơn giản xử lý tri t để kh ng gây r hi n tượng nhiễm thứ ấp hi ph đầu tư kh ng lớn Trong phân hủy sinh h ng ngh sử dụng m ng sinh h (biofilm) vi sinh v t t o r hi n đ ng l phương pháp mẻ v ho hi u o Biofilm l t p hợp vi sinh v t gắn tr n bề mặt ủ v t thể rắn hoặ bề mặt hất lỏng t o th nh lớp m ng b o phủ bề mặt Cá vi sinh v t biofilm li n kết với nh u h hặt hẽ t o th nh ấu trú bền vững Do m t độ hủng vi sinh v t biofilm o hỗ trợ v li n kết với nh u h hặt hẽ n n khả đồng hoá tr o đổi hất phân hủy hydro rbon xảy r nh nh hơn[4, 5] ặ bi t biofilm đượ hình th nh nồng độ xi giảm đáng kể l điều ki n lý tưởng ho vi khuẩn t qu ng hợp (V TQH) ó thể sinh trưởng v phát triển dễ d ng [6, 7] Hi n n y tr n giới ó nhiều ng b nhóm VKQHT ó khả phân huỷ hydro rbon ó toluene v húng thuộ hi như: Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Blastochloris [8, 9] Tuy nhiên ng b hủng V QHT vừ ó khả t o biofilm t t vừ ó khả phân hủy hợp hất vòng thơm òn nhiều h n hế Trong nghi n ứu n y húng t i t p trung v o nghi n ứu hi u suất phân hủy toluene biofilm ủ hủng V QHT t o th nh để ó thể ứng dụng nhóm vi khuẩn n y để xử lý nguồn nhiễm ng nghệ, T p 33, S 2S (2017) 71-76 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đ i tượng Các mẫu nhiễm dầu thu th p t i Cảng Cầu á, Nha Trang, Khánh Hoà 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân l p Vi khuẩn t qu ng hợp đượ phân l p v l m s h theo phương pháp Winogradsky m i trường DSMZ-27 ải tiến (l m i trường DSMZ ó bổ sung toluene th y ho nguồn carbon acetate) [10] 2.2.2 Đánh giá khả tạo màng chủng V T H Tiến h nh theo phương pháp ủ O’Toole v olter; Morik w v ộng s [5,11] 2.2.3 Đánh giá khả sinh trưởng nghiên cứu đặc điểm V T H Sinh trưởng ủ hủng V TQH đượ đánh giá h qu n sát độ lớn khuẩn l m tr n đĩ th h v xá đinh độ hấp thụ ủ dị h huyền phù tế b o đượ nu i tr n m i trường DSMZ-27 ải tiến ó bổ sung 50 ppm toluene t i bướ sóng 800 nm (OD800) ặ điểm hình thái khuẩn l ủ hủng V TQH đượ qu n sát tr n m i trường DSMZ27 ải tiến th h 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng s điều kiện đến sinh trưởng chủng V T H lựa ch n Cá giá trị nhi t độ 15; 30 v 45oC; pH từ - v nồng độ mu i từ - 4% đượ sử dụng để đánh giá khả sinh trưởng ủ hủng V TQH đượ l h n Tất ả th nghi m đượ th hi n điều ki n kỵ kh sáng với ường độ ánh sáng 3000-5000 lux 2.2.5 Đánh giá khả phân hủy toluene chủng V T H đại diện Các chủng V TQH s u đượ t o biofilm đượ nu i m i trường DSMZ-27 N.T.M Nguyệt nnk / Tạp chí hoa h c ĐH GHN: hoa h c Tự nhiên ải tiến với nồng độ: mg/l, 50 mg/l, 100 mg/l, 150 mg/l, 200 mg/l t i điều ki n m húng sinh trưởng t t (đã nghi n ứu trên) D tr n s thay đổi m u sắ ủ dị h nu i v giá trị OD800 để xá định nồng độ hất m vi khuẩn sinh trưởng t t phân hủy hất t i nồng độ đượ phân t h t i Vi n C ng ngh – Vi n ho h v C ng ngh quân s Kết thảo luận 3.1 Phân l p, tuyển ch n đánh giá khả tạo biofilm chủng VKTQH Bằng phương pháp l m gi u v phân l p, húng t i phân l p đượ 11 hủng VKTQH ng nghệ, T p 33, S 2S (2017) 71-76 73 từ mẫu nướ nhiễm dầu t i Cảng Cầu Khánh Hòa hi sử dụng 11 hủng V TQH nuôi tr n m i trường DSMZ-27 ải tiến với nguồn rbon l toluene sau ngày cho thấy tất ả hủng vi n y ó khả sinh trưởng (thể hi n s đổi m u ủ dị h nu i huyển s ng m u đỏ Hình 1) Với mụ ti u tuyển h n đượ hủng V TQH vừ ó khả sinh trưởng tr n m i trường hất toluene vừ ó khả t o biofilm t t Do v y ả 11 hủng V TQH đượ húng t i đánh giá khả t o biofilm D v o giá trị OD800 ho thấy 11 hủng V TQH phân l p đượ hủng CC Py2 v CC Py9 ó khả t o biofilm t t hủng òn l i đượ l h n ho nghi n ứu (Hình 2) Hình sinh trưởng ủ hủng V TQH m i trường DSMZ – 27 ải tiến ó bổ sung 50 mg/l toluene s u ng y nu i Hình t o biofilm ủ 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng lựa ch n Khi nuôi môi trường DSMZ-27 th h, khuẩn l ủ hủng CC Py2 trịn lồi ó hủng V TQH phân l p đượ s u ngày nhân bề mặt bóng m u nâu v ng d: 8-1,2 mm; khuẩn l ủ hủng CC Py9 trịn dẹt ó rì trắng m u hồng nh t, có nhân, d: 1-2 mm (Hình 3) 74 N.T.M Nguyệt nnk / Tạp chí hoa h c ĐH GHN: hoa h c Tự nhiên (A) (B) Hình Hình thái khuẩn l ủ hủng CC Py2 (A) v CC Py9 (B) 3.3 Ảnh hưởng s điều kiện đến phát triển chủng ĐPy2, ĐPy9 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Nhi t độ ó ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng ủ vi khuẩn Theo s nghi n ứu nhi t độ th h hợp ho vi khuẩn phát triển nằm khoảng 30 – 37oC Vì v y húng t i tiến h nh khảo sát ảnh hưởng ủ nhi t độ đến Hình Ảnh hưởng ủ nhi t độ đến s sinh trưởng ủ hủng CC Py2 v CC Py9 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ mu i Na l Chủng CC Py2 v CC Py9 đượ phân l p từ ảng Cầu hánh Ho điều ki n nướ mặn v y nồng độ NaCl ũng l yếu t ảnh hưởng đến khả sinh trưởng ủ húng Trong nghi n ứu n y húng t i l h n nồng độ N Cl 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4% để nghi n ứu khả sinh trưởng ủ hủng vi khuẩn n y (Hình 6) ng nghệ, T p 33, S 2S (2017) 71-76 khả sinh trưởng ủ hủng CC Py2, CC Py9 15 30 37 45oC (Hình 4) ết ho thấy ả hủng CC Py2 CC Py9 ó khả sinh trưởng nhi t độ thử nghi m Tuy nhi n dải nhi t độ từ 3037oC hủng n y ó khả sinh trưởng t t hẳn v s u 45oC khả sinh trưởng giảm dần 3.3.2 Ảnh hưởng pH B n nh nhi t độ khả sinh trưởng ủ hủng vi khuẩn ũng hịu tá động lớn s th y đổi pH Cá nghi n ứu ũng hỉ r pH th h hợp ủ vi khuẩn thường l pH trung tính [2, 3] Do húng t i tiến h nh khảo sát ảnh hưởng ủ pH đến sinh trưởng ủ chủng CC Py2, CC Py9 với dải pH th y đổi từ 4-9 (Hình 5) ết ho thấy ả hủng CC Py2, CC Py9 sinh trưởng t t dải pH từ 5-9 v sinh trưởng t t t i pH Hình Ảnh hưởng ủ pH đến s sinh trưởng ủ CC Py2 v CC Py9 hủng Hình Ảnh hưởng ủ nồng độ N Cl đến s sinh trưởng ủ hủng CC Py2 v CC Py9 Từ hình ho thấy ả hủng CC Py2 CC Py9 ó khả sinh trưởng t t nồng độ mu i N Cl 1-2% v t t l 1,5% N.T.M Nguyệt nnk / Tạp chí hoa h c ĐH GHN: hoa h c Tự nhiên Như v y húng t i tìm đượ điều ki n sinh trưởng ho khả ủ hủng CC Py2 v CC Py9 l nhi t độ 30-37oC pH v nồng độ mu i N Cl 5% ết n y ũng ho n to n phù hợp với nghi n ứu ủ ỗ Thị Li n v cs., 2008 nghi n ứu hủng VKTQH thuộ hi Rhodobacter ó khả lo i bỏ toluene phân l p từ vùng ven biển Quảng Ninh [10] 3.4 Đánh giá khả phân huỷ toluene chủng VKTQH H i hủng CC Py2 CC Py9 t o đượ biofilm Sau ng y biofilm hủng vi khuẩn n y t o th nh đượ nu i m i trường DSMZ-27 dị h ải tiến điều ki n m hủng vi khuẩn n y sinh trưởng t t với nguồn hất l toluene nồng độ: 50 mg/l, 100 mg/l, 150 mg/l, 200 mg/l Sau ngày, so với mẫu đ i hứng kh ng ó vi sinh v t bình nu i nồng độ nh u ảm qu n húng t i nh n thấy bình nu i nồng độ 150 mg/l huyển m u đ m v lượng sinh kh i t o r ũng nhiều giá trị OD800 đ t đượ o Do v y nồng độ 150 mg/l đượ sử dụng để phân t h hi u suất phân huỷ toluene ủ hủng CC Py2 CC Py9 S u phân t h t i Vi n ho h thuộ Vi n ho h v C ng ngh quân s húng t i t nh toán đượ hi u suất phân hủy toluene biofilm ủ hủng vi khuẩn t o th nh (Bảng 1) Bảng Hi u suất phân huỷ toluene ủ CC Py2 CC Py9 Chủng vi khuẩn CC Py2 CC Py9 Nồng độ b n đầu (mg/l) 150 150 Nồng độ òn l i (mg/l) 5,85 4,18 hủng Hi u suất phân huỷ (%) 96,1 97,2 S li u Bảng ho thấy hủng CC Py2 CC Py9 ó khả phân huỷ toluene o tr n 96% Hi n n y tr n giới có nhiều tá giả nghi n ứu khả phân huỷ toluene, nhi n hư ó nhiều ng b hủng V QHT vừ ó khả t o biofilm vừ ó khả phân huỷ toluene [12], [13] Năm 2011 Men Cheng ng b ng nghệ, T p 33, S 2S (2017) 71-76 75 hủng vi khuẩn thuộ hi Pseudomonas ó khả phân hủy 92 5% toluene s u 24 nu i với h m lượng b n đầu l 17 mg/l So sánh với kết tr n kết húng t i thu đượ l o ết n y góp phần l m đ d ng th m v i trị ủ nhóm V QHT xử lý sulfide ũng hydro rbon thơm v mở r hướng ứng dụng ứng dụng nhóm vi khuẩn n y xử lý nhiễm hợp hất n y t i vị tr nhiễm tương t Kết luận Trong 11 hủng V TQH phân l p đượ t i nướ nhiễm dầu Cảng Cầu Nh Tr ng Khánh Hị ó hủng CC Py2 v CC Py9 vừ ó khả t o biofilm vừ ó khả sinh trưởng tr n nguồn hất toluene huẩn l ủ hủng CC Py2 màu nâu vàng, hình trịn, ó nhân lồi bề mặt bóng d: – 1,2mm; khuẩn l ủ hủng CC Py9 hình trịn m u hồng nh t ó nhân rì d: - mm Hai hủng n y phát triển t t 30-37oC pH nồng độ mu i 5% Cả hủng vi khuẩn ó khả sinh trưởng tr n nguồn hất toluene tới 200 mg/l v ó khả phân huỷ 96 1% 97,2% toluene với nồng độ b n đầu l 150 mg/l Lời cảm ơn C ng trình đượ th hi n với s hỗ trợ kinh ph từ đề t i Quỹ Phát triển kho h v ng ngh qu gi (NAFOSTED) ấp mã s 106-NN.04-2015.45 v sử dụng tr ng thiết bị t i Phịng CNSH m i trường Phịng Thí nghi m tr ng điểm C ng ngh gen Vi n C ng ngh sinh h Tài liệu tham khảo inh Thị Ng Giáo trình Hó h dầu mỏ v kh NXB H v T H Nội 2008 [2] Nguyễn Xuân Th nh v ộng s Giáo trình vi sinh v t h ng nghi p Nh xuất giáo dụ H Nội 2006 [3] Spormann AM, Widdel F, Metabolism of alkylbenzenes, alkanes, and other hydrocarbons in anaerobic bacteria, Biodegradation 11(2000) 85 [1] 76 N.T.M Nguyệt nnk / Tạp chí hoa h c ĐH GHN: hoa h c Tự nhiên [4] Morikawa M, Kagihiro S, Haruki M, Takano K, Branda S, Kolter R, Kanaya S, Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces gammapolyglutamate, Microbiology 152 (2006) 2801 [5] O’Toole GA Heidi B olter R Biofilm formation as microbial development, Annual Review of Microbiology 54 (2000) 49 [6] Wright, GE, Madigan, MT, Photocatabolism of aromatic compounds by the phototrophic purple bacterium Rhodomicrobium vanniella Applied and Environmental Microbiology 57 (1991) 2069 [7] Harwood JG, Advances in Photosynthesis and Respiration, Kluwer Academic Publishers, Springer, The Netherland, 2009 [8] Proctomr H, Schier S, Decomposition of benzoate by a photosynthetic bacterium, Journal of Biochemistry 76 (1960) 33 [9] Zengler K, Heider J, Roselló-Mora R, Widdel F, Phototrophic utilization of toluene under anoxic conditions by a new strain of Blastochloris [10] [11] [12] [13] ng nghệ, T p 33, S 2S (2017) 71-76 sulfoviridis Archive of Microbiology 172 (1999) 204 ỗ Thị Li n ỗ Thị T Uy n Trần Văn Nhị ặ điểm sinh h ủ s hủng vi khuẩn qu ng hợp t thuộ hi Rhodobacter ó khả lo i bỏ sulfide phân l p từ vùng ven biển Quảng Ninh T p h C ng ngh Sinh h (2008) 471 O’Toole GA olter R The initi tion of biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis Molecular Microbiology 28 (1998) 449 Aburto A, Peimbert M, Degradation of a benzene–toluene mixtureby hydrocarbonadapted bacterial communities, Annals of Microbiology 61 (2010) 553 Men J, Cheng F, Biodegradation and growth characteristics of a toluene degrading strain, African Journal of Biotechnology 10(61) (2011) 13299 Toluene Degradation of Biofilm Formed by Photosynthetic Purple Bacteria Isolated from Oil Polluted Water Samples Taken at Cau Da Port, Khanh Hoa Nguyen Thi Minh Nguyet1,2, Do Thi Lien3, Cung Thi Ngoc Mai3, Hoang Phuong Ha2,3, Le Thi Nhi Cong2,3 Hanoi Pedagogical University Number 2, Xuan Hoa, Phuc Yen, Vinh Phuc, Vietnam Graduate university of Science and Technology, VAST, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam Institute of Biotechnology, VAST, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam Abstract: Toluene is one of the mosttoxic and difficultly degradable aromatic hydrocarbon compounds in nature Hence, study on approaches to remove toluene is necessary and in hurry Among methods to degrade toluene, biodegradationby biofilm-forming photosynthetic bacteria is widely carried out Two photosynthetic bacterial strains, CC Py2 and CC Py9, which could well degrade toluene and highly form biofilm were isolated from oil polluted water samples at Cau Da Port, Khanh Hoa province The olonies of str in CC Py2 h ve round, glossy surface, nucleus, convex, yellowish brown, diameterfrom 0.8 to 1.2 mm; and CC Py9 colonies have round, pinkish in color, with sharp edges, diameter from to mm when they were cultured on DSMZ-27 solid medium The two strains grow well at 30-37oC, pH and NaCl concentrationof 1.5% The strain of CC Py2 and CC Py9 degraded 96.1% and 97.2% toluene with initial concentration of 150 mg/l after dayincubation, respectively These strains could be contributed to a collection of biofilm-forming photosynthetic bacteria which have capacity of not only toluene degradation but alsoother recalcitrant hydrocarbon removal Keywords: Biofilm, biodegradation, toluene degradation, photosynthetic purple bacteria  ... Journal of Biotechnology 10(61) (2011) 13299 Toluene Degradation of Biofilm Formed by Photosynthetic Purple Bacteria Isolated from Oil Polluted Water Samples Taken at Cau Da Port, Khanh Hoa Nguyen... CC Py9, which could well degrade toluene and highly form biofilm were isolated from oil polluted water samples at Cau Da Port, Khanh Hoa province The olonies of str in CC Py2 h ve round, glossy... of biofilm- forming photosynthetic bacteria which have capacity of not only toluene degradation but alsoother recalcitrant hydrocarbon removal Keywords: Biofilm, biodegradation, toluene degradation,