Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 32, Số (2016) 71-77 Hiệu ức chế đặc tính ung thư PLX4720 dịng tế bào melanoma A375M Nguyễn Đình Thắng* Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày tháng năm 2014 Chỉnh sửa ngày 28 tháng năm 2014; Chấp nhận đăng ngày 28 tháng năm 2016 Tóm tắt: Đột biến BRAFV600E gốc aspatic acid bị thay gốc valine xuất thường xuyên (trên 60%) trường hợp ung thư tế bào hắc sắc tố - melanoma Vì BRAF xem phân tử đích phục vụ cho nghiên cứu chế phát sinh melanoma phát triển thuốc Gần đây, nhiều loại thuốc sản xuất thử nghiệm với mục đích điều hòa biểu bất thường phân tử BRAF Trong số PLX4720 số loại thuốc thử nghiệm đem lại số tín hiệu lạc quan việc điều trị Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu tác dụng chúng dịng tế bào melanoma khác Vì nghiên cứu tập trung khảo sát khả ức chế đặc tính ung thư PLX4720 dòng tế bào melanoma A375M Kết nghiên cứu cho thấy PLX4720 có khả ức chế mạnh tăng sinh, khả hình thành khối u khả di dòng tế bào Keywords: Ung thư tế bào hắc tố, A375M, BRAF, PLX4720 Giới thiệu∗ Với thực tế khó khăn việc nghiên cứu chế di tế bào mà chưa có loại thuốc thực có hiệu cho việc điều trị [3 -5] Các kết nghiên cứu mức độ phân tử giới năm gần phát biểu bất thường số phân tử đóng vai trị định việc phát sinh phát triển ung thư da Đột biến BRAFV600E gốc aspatic acid bị thay gốc valine xuất thường xuyên (trên 60%) trường hợp ung thư melanoma [6, 7] Vì BRAF xem phân tử đích phục vụ cho nghiên cứu chế phát sinh melanoma phát triển thuốc [6, 7] Từ kết thực nghiệm này, số thuốc điều trị sản xuất thử Ung thư hắc sắc tố (melanoma) chiếm tỉ lệ khoảng 10% nguyên nhân gây tới 80% trường hợp bệnh nhân tử vong ung thư da [1, 2] Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê Viện da liễu Quốc gia cách 10 năm khơng có nhiều trường hợp bệnh nhân mắc phải bệnh này, nhiên, từ năm 2007 đến số lượng bệnh nhân tăng lên nhanh Ở Mỹ, số liệu thống kê năm 2010 cho thấy có năm có khoảng 69.000 trường hợp bệnh nhân ung thư hắc sắc tố giai đoạn di căn, gần 50.000 trường hợp giai đoạn sớm phát [3, 4] _ ∗ ĐT.: 84-1228214176 Email: ndthang@hus.edu.vn 71 72 N.Đ Thắng / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 32, Số (2016) 71-77 nghiệm với mục đích điều hịa biểu phân tử có biểu bất thường Trong số PLX4302 loại thuốc thử nghiệm PLX4302 có khả ức chế đột biến phân tử B-Raf, đem lại số tín hiệu lạc quan việc điều trị ung thư tế bào hắc sắc tố - melanoma Các kết thí nghiệm điều trị melanoma mức độ invitro invivo cho kết khả quan [8, 9] Gần đây, sau nhiều năm nghiên cứu thử nghiệm, PLX4302 FDA (Mỹ, 2011) Health (Canada, 2012) chứng nhận sử dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh nhân melanoma có mang đột biến B-RAFV600E giai đoạn cuối [10, 11] Gần đây, dạng đồng phân khác PLX4302 PLX4720, (có tên theo IUPAC là: N-(3-(5chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carbonyl)2,4-difluorophenyl)propane-1-sulfonamide), thử nghiệm Các kết ban đầu cho thấy PLX4720 có tác dụng tương tự PLX4302 [12, 13] Tuy nhiên để có sử dụng rộng rãi hay sử dụng kết hợp với PLX4302 cần có nhiều thí nghiệm invitro nhiều dòng tế bào khác nhằm đánh giá xác khả dạng đồng phân Vì thực tế cho thấy hiệu điều trị loại thuốc phụ thuộc nhiều khơng vào dạng ung thư mà vào loại tế bào ung thư đích Trong trường hợp ung thư melanoma khơng có ngoại lệ Vì nghiên cứu tác dụng thuốc lên loại tế bào cụ thể góp phần quan trọng việc đánh giá mức hiệu loại thuốc xa tìm phân tử đích khác nhằm tăng cao khả điều trị bệnh Đã có nghiên cứu hiệu tác dụng PLX4720 lên dòng tế bào melanoma WM35, WM146, WM1205Lu [12 - 14] , nhiên chưa có nghiên cứu tác dụng lên dịng tế bào A375M Vì nghiên cứu tập trung khảo sát tác dụng ức chế số đặc tính ung thư PLX4720 dịng tế bào melanoma A375M Phương pháp nghiên cứu 2.1 Nuôi cấy tế bào: Phương pháp nuôi cấp dựa theo theo phương pháp nuôi cấy mô tả báo Thang ND cộng [15] Tế bào ung thư hắc sắc tố A375M nhận từ phịng thí nghiệm y sinh, khoa Khoa học sống, trường Đại học Chubu, Nhật Tế bào nuôi môi trường DMEM (Dulbecco’s ModiWed Eagle’s Medium) chứa 10% FBS (Fetal Bovine Serum), % penicillin/Streptomycin, ủ nhiệt độ 37 °C tủ ổn nhiệt có cung cấp % CO2 2.2 Thí nghiệm khảo sát tăng sinh tế bào: Phương pháp thí nghiệm dựa theo phương pháp mô tả báo Yajima cộng [16] Tế bào nuôi cấy đĩa6-giếng 24 Sau dung dịch thuốc (5µM) thêm vào môi trường nuôi cấy tế bào tiếp tục nuôi cấy 72 Tiếp theo tế bào xử lí với dung dịch formalin 10% nhuộm màu dung dịch tím tinh thể (CV) 0.1 % Sau tế bào nhuộm tím tinh thể hịa tan dung dịch sodium dodecyl sulphate (SDS) 0.1% tiến hành đo độ hấp thu ánh sáng bước sóng 595nm máy so màu UV-VIS 3.3 Thí nghiệm kiểm tra lực hình thành cụm tế bào tế bào (cụm tế bào formation assay): Sau tế bào nuôi cấy 72 môi trường có chứa khơng chứa thuốc, lấy 2.5 × 104 tế bào cho vào 2ml môi trường DMEM chứa 0.36 % agarose (dung dịch agarose mềm) Đổ nhẹ nhàng hỗn hợp agarose lên bề mặt agar cứng (Agar cứng tạo cách hòa tan agar vào mơi trường DMEM để có nồng độ agar 0.72%, dung dịch động cứng lại nhiệt độ 37oC) Tiếp theo tế bào nuôi tuần Sau cụm tế bào hình thành bề mặt phân cách agar–agarose agarose đếm kính hiển vi 2.3 Thí nghiệm khảo sát tốc độ di chuyển xâm lấn tế bào: Phương pháp thí nghiệm dựa theo phương pháp mơ tả báo Jiang cộng [18] Tế bào nuôi cấy môi trường DMEM 10% FBS N.Đ Thắng / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 32, Số (2016) 71-77 với có khơng có mặt thuốc (5µM) đĩa-6-giếng số lượng tế bào sản sinh bao phủ toàn bề mặt đĩa Dùng đầu tip pipet vạch lên bề mặt đĩa đường ngăn cách, tiếp tục nuôi tế bào 22 Tiến hành đo khoảng cách mà tế bào di chuyển xâm lấn 2.4 Thí nghiệm khảo sát khả di xâm lấn tế bào: Phương pháp thí nghiệm dựa theo phương pháp mô tả báo Thang ND cộng [17] Sau 10 nuôi cấy môi trường DMEM thiếu dưỡng chất (chỉ chứa 0.5% FBS), tế bào chuyển sang nuôi môi trường DMEM chứa 10% FBS với có khơng có mặt thuốc (5µM) tiếp tục ni 72 Lấy 2x105 tế bào có 300 µL mơi trường DMEM chứa 0.5% FBS cho vào giếng Boyden (khoang trên) với kích thước lỗ đáy giếng µm (đáy giếng phủ lớp lớp mỏng matrigel) Sau giếng Boyden đặt vào đĩa-24-giếng (khoang dưới), ĐC PLX4720-2.5 73 giếng chứa 600 µl mơi trường DMEM 0.5% FBS có thêm yếu tố phát triển Hệ Boyden ủ tủ ổn nhiệt 37oC vịng 12 Sau tế bào di chuyển qua lỗ giếng Boyden xuấn mặt phía giếng nhuộm màu hematoxylineosin tinh thể tím đếm số lượng kính hiển vi 3.5 Thí nghiệm khảo sát khả hình thành khối u tế bào: Phương pháp nhằm đánh giá khả phát triển khối u tế bào invitro, mô tả chi tiết báo Thang ND cộng [17] Sau tế bào nuôi môi trường RPMI 24 có khơng có mặt thuốc (5àM), ly 2.5ì104 t bo v trn vi ml dung dịch agar mềm 0.36% môi trường RPMI Đổ nhẹ lên bề mặt agar cứng (chứa 0.72% agar môi trường RPMI) tiếp tục nuôi cấy vịng tuần Các khối tế bào hình thành có đường kính lớn 50 µm đếm kính hiển vi soi ngược PLX4720-1.0 (µM) PLX4720-5.0 PLX4720-10 (µM) Hình Ảnh hưởng độc tính PLX4720 lên tế bào ung thư A375M * **, khác biệt có ý nghĩa (p