VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No (2019) 15-21 Original Article Microarray Data Analysis of as-induced Rice Roots by using Easygo and Mapman Softwares Nguyen Thi Thuy Quynh1, , Pham Le Ngoc Han2, Vo Khanh Tam2, Phung Thi Kim Hue2, Tsai-Lien Huang VNU University of Education, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Hung Vuong gifted high school, 48 Hung Vuong, Pleiku, Gia Lai, Vietnam Departement Life Sciences, National Cheng kung University, Taiwan, ROC Received 22 January 2019 Revised 17 March 2019; Accepted 26 July 2019 Abstract: Rice is one of the most important crops in Asian countries such as China, Vietnam Many recent reports indicate that the arsenic content in rice exceeds the threshold and affects human health Studying of molecular mechanisms and finding the arsenic resistance genes in rice which is extremely important and urgent In this study, we analyzed the transcriptional changes of arsenictreated rice root cells during 24 hours by microarray technique Results showed that a large number of the differentially expressed genes (720 genes) EasyGO and Mapman softwares are powerful tools in analyzing microarray data and classifying functional groups as well as the important metabolic pathways in the cell Results of microarray analysis using EasyGO showed that 74 down-regulated genes related to cellular component, 200 up-regulated genes involved in catalytic activity, 93 upregulated genes involved in biological processes as responding to environmental stress, and 64 detoxification-realted genes are increased expression such as cytochrome P450, Glutathione-Stransferase and UDP-Glycosyltransferase Mapman's microarray analysis reaults also indicate that numerous of arsenic-tolerance genes of rice roots These results support for searching indicated genes in the selection of As-tolerance rice varieties Keywords: Asen, EasyGO, Mapman, microarray, Oryza sativa L Corresponding author Email address: quynhntt-bio@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4860 15 VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No (2019) 15-21 Phân tích số liệu Microarray rễ lúa bị nhiễm Asen phần mềm chuyên dụng Easygo Mapman Nguyễn Thị Thúy Quỳnh1, , Phạm Lê Ngọc Hân2, Võ Khánh Tâm2, Phùng Thị Kim Huệ2, Tsai-Lien Huang3 1Trường Đại học Giáo dục, ĐHQGHN, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà nội, Việt nam Trường THPT chuyên Hùng Vương, 48 Hùng Vương, Thành phố Pleiku, Gia Lai Trường Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đường University, Tainan, Taiwan Nhận ngày 22 tháng 01 năm 2019 Chỉnh sửa ngày 17 tháng năm 2019; Chấp nhận đăng ngày 26 tháng năm 2019 Tóm tắt: Cây lúa loại lương thực quan trọng nước khu vực Châu Á Trung Quốc, Việt nam… Nhiều nghiên cứu gần cho thấy hàm lượng Asen (As) có gạo vượt ngưỡng quy định điều gây ảnh hưởng tới sức khỏe người Việc nghiên cứu chế phân tử tìm gen chống chịu As lúa điều vô quan trọng cấp thiết Trong nghiên cứu này, tiến hành phân tích thay đổi hệ phiên mã tế bào rễ lúa sau 24 xử lý với As kỹ thuật microarray Kết cho thấy số lượng lớn gen thay đổi mức độ biểu (720 gen) Phần mềm EasyGO Mapman công cụ đắc lực trong việc phân tích số liệu microarray phân loại nhóm gen chức đường trao đổi chất quan trọng tế bào Kết phân tích phần mềm EasyGO cho thấy 74 gen điều hòa giảm liên quan đến thành phần tế bào; số lượng gen điều hịa tăng gồm có: 200 gen liên quan đến hoạt tính xúc tác, 93 gen liên quan đến q trình sinh học đáp ứng với stress môi trường, 64 gen liên quan đến khả khử độc As Cytochrome P450, Glutathione-Stransferase UDP-Glycosyltransferase Kết phân tích microarray phần mềm Mapman cho kết sâu đường trao đổi chất liên quan đến tính chống chịu rễ lúa với As Các kết nhằm tìm gen thị nhằm hỗ trợ chọn tạo giống lúa có khả chống chịu As Từ khóa: Asen, EasyGO, Mapman, microarray, Oryza sativa L Tác giả liên hệ Địa email: quynhntt-bio@vnu.edu.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4860 16 N.T.T Quynh et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No (2019) 15-21 Mở đầu Asen (As, hay cịn gọi thạch tín) chất cực độc gây ô nhiễm môi trường ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người Nhiều nghiên cứu cho thấy ô nhiễm As nguồn nước tiềm ẩn nhiều mối nguy hại việc tiêu thụ sản phẩm nông nghiệp trồng khu vực nhiễm As As3+ dạng vô As chất cực độc tế bào thực vật gây ức chế chức nội bào, phá hủy trình trao đổi chất gây chết tế bào [1] Nguy hiểm As nước ngầm sử dụng cho tưới tiêu vào chuỗi thức ăn thông qua hấp thu động vật thực vật Lúa lương thực quan trọng nhiều nước Châu Á Trung Quốc, Đài loan, Việt Nam… Tuy vậy, nhiều báo cáo hàm lượng As tích lũy rơm rạ làm thức ăn cho gia súc, sau vào thể người thơng qua chuỗi thức ăn [2] Do đó, việc nghiên cứu chế phân tử tìm gen chống chịu As lúa điều vô quan trọng cấp thiết Nhiều báo cáo nghiên cứu xác định vai trò khử độc kim loại số gen không bào thực vật liên quan đến Cytochrome P450, Glutathione-Stransferase UDP-Glycosyltransferase [3, 4] Trong thập kỷ gần đây, kỹ thuật microarray cơng cụ hữu ích cho phép nghiên cứu đồng thời mức độ biểu hàng nghìn gen mẫu đáp ứng với biến đổi môi trường Nhiều báo tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng As lên hệ gen biểu thực vật nồng độ cao [5] Tuy nhiên tài liệu công bố đáp ứng sớm hệ gen biểu thực vật ảnh hưởng As nồng độ thấp Vì vậy, nhằm tìm hiểu chế phân tử lúa tác động sớm As3+(trong 24 xử lý) với nồng độ thấp (5 μM), chúng tơi tiến hành phân tích hệ gen biểu lúa kỹ thuật cDNA microarray với kích thước lên tới 44k gen Đồng thời, nhằm phân tích nhóm gen chức có vai trị quan trọng q trình khử độc As rễ lúa, tiến hành sử dụng phần mềm EasyGO Mapman Hai phần mềm sử dụng phổ 17 biến giúp nhà nghiên cứu dễ dàng phát kiến thức sinh học quan trọng giải vấn đề nghiên cứu đặt [6] EasyGO xem phương tiện ưu việt việc xác định nhóm gen chức có vai trị quan trọng q trình trao đổi chất thực vật Hệ thống ghi Ontology Gene (GO) cung cấp cách hệ thống thuật ngữ chuyên môn mô tả đối tượng sinh học tập trung vào ba nhóm là: q trình sinh học (biological process), thành phần tế bào (cellular component), chức phân tử (molecular function) Phần mềm Mapman công cụ đắc lực sử dụng nhiều nghiên cứu hệ gen biểu hiện, cho phép người sử dụng phân loại quan sát mức độ biểu nhóm gen tham gia vào trình sinh học khác tế bào thực vật Nghiên cứu cung cấp chứng mức độ phân tử hệ rễ lúa chịu ảnh hưởng As3+ sở cho nghiên cứu sâu nhằm tìm kiếm gen liên quan đến trình chống chịu As lúa nói riêng thực vật nói chung Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu Giống lúa Oryza sativa L.cv TN-67 cung cấp Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật, Trường đại học Quốc gia Thành Công, Đài Loan 2.2 Phương pháp Xử lý hạt lúa As Hạt lúa Oryza sativa L.cv TN-67 khử trùng 15 phút Sodium hypochlorite 2.5% (v/v), rửa lại lần nước cất, đặt tối 37oC Sau ngày hạt lúa nảy mầm chuyển 15 hạt sang đĩa petri với 20 ml nước cất, đặt tối 26oC ngày Khi rễ lúa ngày tuổi đạt chiều dài 3-4 cm chuyển sang đĩa petri với 20 ml As3+ 5μM (NaAsO2; Sigma, USA), mẫu đối chứng chuyển sang đĩa petri với 20 ml 18 N.T.T Quynh et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No (2019) 15-21 nước cất Sau 24h xử lý, đầu rễ lúa (khoảng cm) cắt thu lại cho thí nghiệm Thí nghiệm tiến hành độc lập lặp lại lần Tách chiết RNA tổng số cDNA 100 mg mẫu rễ lúa (mẫu đối chứng mẫu gây nhiễm với μM As3+ 24h) thu hoạch RNA tổng số tách chiết kít RNAeasy Plant Mini (QIAGEN, Đức) theo hướng dẫn nhà cung cấp Nồng độ ARN tổng số định lượng máy NanodropND 2000 (Nanodrop Technologies, USA) với độ tinh cao (OD260/280 and OD260/230 >2) cDNA thực từ µg ARN tổng số ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, WI, USA) với mồi oligo (dT)15 Hỗn hợp phản ứng ủ 42oC 60 phút sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen nghiên cứu Kỹ thuật microarray phân tích số liệu microarray Rễ lúa ngày tuổi xử lý với μM As 24h thu hoạch tách chiết RNA tổng số Kỹ thuật microarray thực phịng thí nghiệm ADN micrroaray, Viện Sinh học - Taiwan với chíp ADN Agilent Rice Oligo microarray (44K Agilent Technologies, USA) Lai mẫu dò microarray tiến hành lặp lại lần theo hướng dẫn nhà cung cấp 0,8 μg cDNA tổng số khuếch đại kít Fluorescent Linear Amplification (Agilent Technologies, USA), mẫu đối chứng đánh dấu với Cy3-CTP, mẫu thí nghiệm đánh dấu với Cy5-CTP (CyDye, PerkinElmer, USA) 30 phút 60oC Các mẫu lai với chip microarray Rice Oligo DNA Microarray 44K RAP-DB (G2519F#15241; Agilent Technologies, USA) 17 với nhiệt độ 60oC Sau đó, chip microarray làm khô quét máy quét (Agilent Technologies, USA) bước sóng 535 nm Cy3 bước sóng 625 nm Cy5 Hình ảnh qt phân tích phần mềm xử lý ảnh khai thác tính 9.5.3 3+ (Feature Extraction 9.5.3, Agilent Technologies, USA) Số liệu phân tích thống kê phần mềm GeneSpringGX11 (Agilent Technologies) Rank Products Các mô tả gen lúa tác động As thích theo RAPDB (Rice Annotation Project Data Base: http://rapdb.lab.nig.ac.jp) theo TIGR Rice Genome Annotation Resource: http://www.tigr org/tdb/e2k1/osa1/index.shtml Các nhóm gen đáp ứng với As3+ phân loại nhóm chức đường trao đổi chất phần mềm EasyGO Mapman Phân tích số liệu Các số liệu ghi nhận xử lý phần mềm thống kê sinh học Minitab với sai khác có ý nghĩa (p-value ≤ 0.05) Kết thảo luận Trong nghiên cứu trước chúng tơi, độc tính As3+ lên sinh trưởng lúa ngày tuổi xác định với nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 50 µM Kết cho thấy nồng độ µM As3+ chiều dài rễ lúa giảm gần 40% so với đối chứng, lúa không phát triển nồng độ từ 15 - 50 µM Do đó, chúng tơi lựa chọn nồng độ As3+ µM cho nghiên cứu sâu Trong nghiên cứu nhằm xác định độc tính As3+ với lúa, tiến hành đánh giá phát triển thân rễ lúa bị xử lý với As3+ nồng độ μM 24 Kết cho thấy chiều dài thân rễ lúa bị xử lý với As3+ bị giảm đáng kể (2,87 cm 4,21 cm) so với đối chứng (3,64 cm 4,88 cm) (Hình 1) Hình thái thân rễ lúa cho thấy bị gây nhiễm với As3+ bị còi cọc phát triển thơn so với lúa đối chứng Kết chứng tỏ khả gây độc As lúa Nhiều kết nghiên cứu cho thấy phát triển thực vật bị suy giảm bị chết tác động As [7, 8] N.T.T Quynh et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No (2019) 15-21 Hình Số lượng gen điều hòa tăng giảm rễ lúa bị ảnh hưởng As3+ Hình Chiều dài thân rễ lúa tác dụng As3+ sau 24 Kết phân tích số liệu microarray phần mềm EasyGO cho thấy nhóm gen có biểu giảm thuộc nhóm chức phân tử hoạt tính sulfotransferase hoạt tính transferase; nhóm gen liên quan đến thành phần tế bào (endomembrane system) chiếm ưu (74 gen) Trong đó, gen có biểu tăng thuộc nhóm gen liên quan đến trình sinh học gen đáp ứng với stress phi sinh học (93 gen), nhóm chức phân tử gồm nhiều gen liên quan đến hoạt tính khử độc As như: glutathione transferase (22 gen), UDP-glycosyltransferase (23 gen), Cytochrome P450 (19); hoạt tính xúc tác (200 gen) (Hình 3) Với mong muốn hiểu rõ chế phân tử trình trao đổi chất lúa đáp ứng với As3+ 24 giờ, tiến hành sử dụng kỹ thuật cDNA microarray 44k phân tích hệ gen biểu biểu lúa tác động As3+ Kết cho thấy số lượng lớn gen thay đổi mức độ biểu (434 gen biểu tăng 286 gen biểu giảm) (Hình 2) Kết nghiên cứu Huang cs cho thấy hệ gen biểu lúa tác động As thay đổi nhiều [5] 74 endomembrane system transferase activity, transferring… 8 sulfotransferase activity catalytic activity 200 UDP-glycosyltransferase activity 23 oxygen binding 19 chitin binding glutathione transferase activity 22 defense response, incompatible… Điều hòa giảm Điều hòa tăng 13 secondary metabolic process 34 jasmonic acid and ethylene-… cellular catabolic process 28 response to heat 10 response to temperature stimulus 18 response to stress 52 19 50 100 150 200 250 Số lượng gen Hình Mức độ biểu điều hịa tăng giảm gen liên quan đến trình sinh học 20 N.T.T Quynh et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No (2019) 15-21 Kết phân tích chức gen rễ lúa tác dụng As phần mềm Mapman cho thấy gen có biểu giảm gen liên quan đến trình trao đổi thứ cấp Các gen có vai trị quan trọng trình sinh trưởng phát triển thực vật, trực tiếp liên quan đến trình sinh tổng hợp flavonoid phenylpropanoid lignin [9, 10] Kết lý giải suy giảm tốc độ phát triển chiều dài thân rễ lúa tác động As3+ (như kết trình bày Hình 1) Trong đó, phần lớn gen Cytochrome P450, Glutathione-S-transferase, UDP Glycosyltransferase có mức độ biểu tăng (Hình 4) Rất nhiều báo cáo rằng, Glutathione-S-transferase (GST) có vai trị quan trọng phản ứng oxy hóa khử khử độc kim loại nặng [7, 8] Điều lý giải As hấp thu vào thực vật hàm lượng GST sản sinh thông qua tạo thành phytochelatin (PCs) dẫn đến thay đổi nồng độ gốc oxy hóa enzyme chống oxy hóa tế bào thực vật Bên cạnh đó, q trình khử độc tế bào thực vật cịn có tham gia Cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) and UDP-glycosyltransferases (UTGs) Marrs cs chứng minh GST enzyme có khả xúc tác cho phản ứng kết hợp độc tố với glutathione chuyển hợp chất tới không bào thực vật [3] Do đó, chúng tơi khẳng định vai trò khử độc từ sớm (24 giờ) CYPs, UGTs GST tế bào rễ lúa bị tác động As3+ Kết thống với nhiều kết nghiên cứu khác công bố giới [5, 11, 12] Kết sở cho nghiên cứu sâu việc tìm kiếm gen liên quan đến tính chống chịu As lúa Từ hỗ trợ cho nhà khoa học công tác chọn tạo giống lúa nói riêng thực vật nói chung có khả chống chịu môi trường ô nhiễm As, nhằm tạo nguồn lương thực an toàn nâng cao chất lượng sống Hình Mức độ điều hòa gen liên quan đến hệ enzyme rễ lúa bị tác động As3+ (màu đỏ màu xanh thể hiện tương ứng mức độ biểu hiện tăng và giảm của gen) Kết luận Kết cDNA microarray 44k số lượng lớn gen thay đổi mức độ biểu rễ lúa xử lý với μM As3+trong 24 (720 gen) Ứng dụng phần mềm EasyGO phân tích số liệu microarray cho thấy phần lớn gen điều hòa giảm liên quan chủ yếu đến thành phần tế bào (74 gen) Các gen điều hòa tăng liên quan đến q trình sinh học đáp ứng với stress mơi trường (93 gen), liên quan đến hoạt tính xúc tác (200 gen) gen liên quan đến khử độc As (64 gen) Glutathione tranferase, UDPglycosyltransferase Cytochrome P450 Kết phân tích số liệu microarray phần mềm Mapman khẳng định tính xác nghiên cứu sâu chức nhóm gen liên quan đến tính chống chịu As lúa Lời cảm ơn Chúng xin chân thành cảm ơn Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật thuộc Khoa Khoa học sống, trường Đại học Quốc gia N.T.T Quynh et al / VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 35, No (2019) 15-21 Cheng Kung, Taiwan; Phịng thí nghiệm Sinh học - Trường Đại học Giáo dục Hà nội tạo điều kiện sở vật chất, trang thiết bị để hoàn thành kết nghiên cứu Tài liệu tham khảo [1] [2] [3] [4] [5] [6] S.K Panda, R.K Upadhyay, S Nath, Arsenic stress in plants Journal of Agronomy and Crop Science 196 (2010) 161-174 https://doi.org/10 1111/j.1439-037X.2009 00407.x M.A Rahman, H Hasengawa, M.M Rahman, M.A Miah, A Tasmin Arsenic accumulation in rice (Oryza sativa L.): Human exposure through food chain Ecotoxicology and Environmental Safety 69 (2008): 317-324 https://doi.org/10 1016/j.ecoenv.2007.01.005 K.A Marrs, The function and regulation of Glutathione S-transferase in plants Plant Mol Biol 47 (1996) 127-58 https://doi.org/10.1146/ annurev.arplant.47.1.127 L.M DelRazo, B Quintanilla-Vega, E Brambila-Colombres, E.S Caldero ́n-Aranda, M Manno, A Albores, Stress proteins induced by Arsenic Toxicology and Applied Pharmacology 177 (2001)132-148 https://doi.org/10.1006/taap 2001.9291 T.L Huang, Q.T.T Nguyen, S.F Fu, C.Y Lin, Y.C Chen, H.J Huang, Transcriptomic changes and signalling pathways induced by arsenic stress in rice roots Plant Molecular Biology 80 (2012) 587-608 https://link.springer.com/article/10.10 07/s11103-012-9969-z O Thimm, O Bläsing, Y Gibon, A Nagel, S Meyer, P Krüger, J Selbig, L.A Müller, S.Y Rhee, M Stitt, Mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological 21 processes The Plant Journal 37 (2004) 914939 https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2004 02016.x [7] J Hartley-Whitker, G Ainsworth, A.A Meharg, Copper- and arsenate-induced oxidative stress in Holcus lanatus L clones with differential sensitivity Plant, Cell and Environment 24 (2001) 713-722 https://doi.org/10.1046/j.00168025.2001.00721.x [8] S Mishara, A.B Jha, R.S Dubey, Arsenite treatment induces oxidative stress, upregulates antioxidant system, and causes phytochelatin synthesis in rice seedlings Protoplasma 248 (2011) 565-577 https://doi.org/10.1007/s00709010-0210-0 [9] M Chabannes, A Barakate, C Lapierre, J.M Marita, Strong decrease in lignin content without significant alteration of plant development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in tobacco plants, The Plant 28 (2001): 257-270 https://doi.org/10 1046/j.1365-313X.2001.01140.x [10] T Goujon, V Ferret, I Mila, B Pollet, Downregulation of the AtCCR1 gene in Arabidopsis thaliana: effects on phenotype, lignins and cell wall degradability Planta 217 (2003) 218-228 https://doi.org/10.1007/s00425-003-0987-6 [11] C Li, S Feng, Y Shoa, L Jiang, X Lu, X Hou, Effects of arsenic on seed germination and physiological activities of wheat seedlings Journal of Environmental Sciences 19 (2007) 725-732 https://doi.org/10.1016/S1001-0742(07) 60121-1 [12] A.A Meharg, J Harley-Whitaker, Arsenic uptake and metabolism in arsenic resistant and nonresistant plant species New Phytologist 154 (2002) 29-43 https://doi.org/10.1046/j.14698137.2002.00363.x ... Natural Sciences and Technology, Vol 35, No (2019) 15-21 Phân tích số liệu Microarray rễ lúa bị nhiễm Asen phần mềm chuyên dụng Easygo Mapman Nguyễn Thị Thúy Quỳnh1, , Phạm Lê Ngọc Hân2, Võ Khánh... 35, No (2019) 15-21 Hình Số lượng gen điều hòa tăng giảm rễ lúa bị ảnh hưởng As3+ Hình Chiều dài thân rễ lúa tác dụng As3+ sau 24 Kết phân tích số liệu microarray phần mềm EasyGO cho thấy nhóm gen... Kết luận Kết cDNA microarray 44k số lượng lớn gen thay đổi mức độ biểu rễ lúa xử lý với μM As3+trong 24 (720 gen) Ứng dụng phần mềm EasyGO phân tích số liệu microarray cho thấy phần lớn gen điều