Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG c CHẾ TĂNG TRƯỞNG CỦA MỘT s ố DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ PHỔ BIẾN BỞI CÁC DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM Bùi Thi Thùv Dung \ Hà Hữu Cường Hoàng Thị Mỹ Nhung Trịnh Thị Loan \ Phạm Thị Lương Hằng * * Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội TÓM TẮT Vi khuẩn lam nguồn giàu hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm dược phẩm có ý nghĩa quan ữọng Trên giới, số hợp chất chất dẫn xuất tìr vi khuẩn lam cho kết khả quan thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư pha I II Dolastatin 10, Curacin A, Cryptophycin-52 Từ tiềm dược liệu vi khuẩn lam, tiến hành đánh giá khả ức chế dịch chiết từ 10 chủng vi khuẩn lam lên tăng trưởng ba dòng tế bào ung thư (MCF7, HepG2, HCT116) mơ hình thử nghiệm đơn lớp với thuốc nhuộm sulforhodamine B Sinh khối khô chủng vi khuẩn lam chiết với ethyl acetate methanol để thu dịch chiết ethyl acetate methanol tương ứng Kết cho thấy, 20 dịch chiết tìr 10 chùng vi khuẩn lam có dịch chiết tị ba chủng APA4, APD4 APA5 có tác dụng đối ức chế tăng trưởng dòng tế bào ung thư vú MCF7, đồng thời dịch chiết tìr hai chủng APA4, APD4 DL12 có tác dụng ức chế sống dòng tế bào ung thư đại trực tràng HCTl 16 Tất dịch chiết từ 10 chủng khơng có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư gan HepG2 Điều cho thấy dịch chiết từ chủng vi khuẩn lam có khả ức chế chọn lọc dòng tế bào ung thư khác Đây kết khả quan để tiến hành sắc ký để phân lập đơn chất có tác dụng kháng ung thư từ dịch chiết chủng vi khuẩn lam APA4, APD4, APA5 DL12 Từ khóa: Vi khuẩn lam, phương pháp sulíorhodamine B, mơ hình thử nghiệm đơn lớp, APA4, APD4, CDL12 EVALUATION OF CYTOTOXICITY OF SEVERAL CYANOBACTERIA EXTRACTS TO COMMON CANCER CELL LINES SUMMARY Cyanobacteria produces various types of bioactive compounds with anticancer, antiviral, antibacterial, and antiíiingal activities In the world, many compounds from cyanobacteria and their analogues are found to be effective for cancer treaứnent at phase 36 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược iần II Hà Nội - 2015 I&II of clinical trial such as Dolastatin 10, Curacin A, Cryptophycin-52 Basing on this pharmaceutical potential, we evaluated inhibitory activities of extracts from 10 cyanobacteria strains on cancer cell lines (breast cancer MCF7, liver cancer HepG2, colorectal cancer HCT116) by using the sulforhodamine B assay Dried biomass of each sừain was exữacted in ethyl acetate and methanol in order to gain ethyl acetates and methanol extracts, respectively The extracts from three cyanobacteria strains including APA4, APD4, and APA5 could inhibit proliferation of MCF7 cells; moreover, the extracts from two strains (APA4 and APD4) with CDL12 strain had cytotoxicity against HCT116 cells None o f extracts from 10 strains could affect viability o f HepG2 cells These results indicate that the cyanobacteria extracts have selective activities to different cancer cell lines Thereíore, the extracts from APA4, APD4, APA5 and CDL12 sfrains will be used for isolation of cytotoxic compounds by chromatographic methods Key vvords: Cyanobacteria, Sulforhodamine B assay, 2D culture method, APA4, APD4, DL12 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư bệnh nguy hiểm hàng đầu giới với tỷ lệ mắc phải ngày tăng Theo số liệu báo cáo Viện nghiên cứu quốc tế ung thư, năm 2012, tồn giới có 14 triệu người bị chết loại bệnh ung thư khác Các chuyên gia cảnh báo người khơng sớm tìm biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn tốc độ phát triển bệnh này, thi sau 20 năm nữa, năm ung thư cướp sống 22 triệu người Hóa trị xạ trị từ lâu xem phương pháp đặc trị ung thư, nhiên hai phương pháp kéo theo tác dụng phụ, ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người bệnh, người bệnh tử vong trước tiêu diệt tận gốc tế bào ung thư Bởi vậy, việc tìm loại thuốc đặc hiệu điều trị ung thư an toàn với người bệnh vấn đề vô cấp bách quan tâm hàng đầu Trong cơng tìm kiếm đó, hợp chất tìr thiên nhiên quan tâm nhiều chúng lành tính tìr xa xưa xuất thuốc trị bệnh dân gian Cùng với xu hướng giới, tận dụng mạnh nước ẩm nhiệt đới với hệ thống thực vật đa dạng phong phú, Việt Nam tìm kiếm phát nhiều loại thảo mộc có tiềm trở thành thuốc điều trị ung thư Và, việc tìm loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên an tồn cho người sử dụng, thân thiện với mơi trường hướng tích cực 37 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Vi khuẩn lam nguồn giàu hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm dược phẩm có ý nghĩa quan trọng Chúng cho thấy khả chống lại khối u, kháng vims, kháng khuẩn, kháng nấm[2,4,5,6,7] Các hợp chất phân lập tiiứi từ vi khuẩn lam cho kết quả, bước đầu thành công frong thử nghiệm khám điều trị bệnh Các hợp chất xem hợp chất tiên phong cho phát triển, tổng hợp hợp chất tương tự với hoạt tính sinh học tốt hom Từ tính chất tiềm vi khuẩn lam, tiến hành đánh giá khả ức chế sống dòng tế bào ung thư 10 chủng vi khuẩn lam lên ba dòng tế bào img thư: ung thư vú người MCF7, ung thư gan HepG2, ung thư đại trực ữàng HCT116 mơ hình thử nghiệm đơn lớp sử dụng thuốc nhuộm Sulforhodamine B (SRB) nhằm tìm chất có khả kháng lại xmg thư ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯOỈNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.ỉ Đổi tượng 2.1.1 Dòng tế bào - Dòng tể bào ung thư vú MCF7 - Dòng tế bào ung thư gan HepG2 - Dòng tế bào ung thư đại trực tràng HCT116 Cả ba dòng tế bào cung cấp trung tâm lưu trữ giống nuôi cấy Hoa Kỳ (ATCC) bảo quản Nhóm nghiên cứu Ung thư học Thực nghiệm, môn Sinh học xế bào, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 2.1.2 Vật liệu Bảng 2.1 Các chủng Vi khuẩn lam dùng thí nghiệm thử đánh giá độc tính STT C hất thử STT C hất thử APA4- Met 11 APA5- Met APA4- EtAc 12 APA5- EtAc APD4- EtAc 13 APD3- Met APD4- Met 14 APD3- EtAc DL12- Met 15 TVN9- Met DL12- EtAc 16 TVN9- EtAc AHK7- Met 17 T202- Met AHK7- EtAc 18 T202- EtAc CN4- Met 19 APD3*- EtAc 10 CN4- EtAc 38 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược ỉần II Hà Nội - 2015 Dịch chiết tổng số chủng vi khuẩn lam cung cấp Phịng thí nghiệm ni cấy mơ thực vật vi tảo, mơn Sinh lí Thực vật Hóa sinh, khoa Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội Mười chín dịch chiết tổng số thống kê bảng Các mẫu thử cung cấp dạng cao khô 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phtrơngpháp hoạt hóa tế bào - Rã đơng tế bào tìr -196°c bể ổn nhiệt 37°c - Ly tâm 1500 rpm phút bỏ dịch - Hịa tế bào mơi trường ni cấy mới, cho vào đĩa nuôi cấy đặt tủ ấm 37°c, 5% CO2 - Thay môi trường thưcmg xuyên từ 2-3 ngày/ lần - Cấy chuyển mật độ tế bào đạt 70-90% bề mặt nuôi cấy Trysin Ix phút 37°c, 5% CO2 Xác định số lượng tế bào buồng đếm Thomas 2.2.2 Đảnh giá khả ức chế tăng sình tế bào Trong nghiên cứu sử dụng kit The Sulforhodamine B (SRB) để đánh giá độc tính chất thử nghiệm lên tế bào ung thư nuôi cấy Quy trình thực hiện: - Tế bào sau nhân nuôi bổ sung giếng đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ 5000 tế bào/giếng nuôi cấy ổn định điều kiện 37°c, 5% C02, 95% khơng khí 24h - Bổ sung chất thử nghiệm giếng tế bào nói để đạt nồng độ mẫu thử nghiệm 200, 100, 50, 25, ụg/ml Mỗi nồng độ lặp lại lần - Sau 48h, đĩa tế bào thử nghiệm đo máy đo ELISA bước sóng kích thích 540nm Số liệu OD thu được xử lý, tính tốn chưomg trình Excel phần mềm GraphPad Prism 6.1 KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 3.1 Kết hoạt hóa tế bào Dịng tể bào ung thư vú MCF7 ni cấy mơi trường RPMI, sau 24h hoạt hóa, tế bào có dạng sao, chiếm 70-80% bám bề mặt đĩa nuôi cấy Dịng tế bào HCT116 HepG2 ni cấy mơi trưèmg DMEM low, tể bào HCTl 16 có dạng dài, chiếm 7080% bề mặt đĩa nuôi cấy; tế bào HepG2 có xu hướng co cụm, tế bào liên kết chặt với 39 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Cả ba dịng có tế bào khỏe mạnh, sinh trưởng tốt, bám chặt vào bề mặt đĩa nuôi cấy, môi ttuờng nuôi cấy sạch, không vẩn đục, bề mặt đĩa khơng nhiễm nấm móc Hình 3.1 Các dòng tế bào ung thư phục vụ cho thí nghiệm thử hoạt tính: MCF7, HCT116, HepG2 (từ trái qua phải) 3.2 Kết đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào chủng Vi khuẩn lam Dưới ảnh hường chất thử có hoạt tính, tể bào bị ức chế khả sinh trường, phân chia chết, biểu tế bào khơng cịn dạng dài sao, bám bề mặt đĩa mà co tròn khả bám dính Điều quan sát thấy hai dịng tế bào MCF7 HCTl 16 Trong đó, MCF7 bị ức chế sống tác dụng ba chủng vi khuẩn lam: APA4, APD4, APA5 Tương tự, chủng có tác dụng ức chế sống dịng tế bào ung thư đại trực tràng HCTl 16 là: APA4, APD4 DL12 Hình 3,2 Tế bào ung thư vú MCF7 tác dụng mẫu thử APD4- EtAc nồng độ 400, 100 25Fig/ml (từ trái qua phải) Bar= 20fini Hình 3.3 Tế bào ung thư đại trực tràng HCT116 tác dụng mẫu thử APD4- EtAc nồng độ 400,100 25^g/ml (từ trái qua phải) Bar= 20^ni 40 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Sau 48h thử nghiệm, tất chủng vi khuẩn lam khả ức chế tăng sinh với tế bào ung thư gan HepG2 Các tế bào giữ nguyên hình dạng, phân chia phát triển tốt Hình 3.4 xế bào ung thư gan HepG2 tác dụng APD4- EtAc nồng độ 400,100 25^g/ml (từ trái qua phải) Bar= 20fỉin Kết thúc 48h thí nghiệm, chúng tơi tiến hành ủ tế bào với SRB để kiểm tra độc tính đo mật độ quang học (OD) bước sóng 540nm máy Microplate Reader Model 680, sau đó, chúng tơi sử dụng phần mềm Excel để tính tốn số tăng sinh A% tương ứng với nồng độ thuốc thử mẫu thử có giá trị A% nhỏ 50%, tiến hành dựng đường cong đáp ứng liều sử dụng phần mềm Graphad Pristn 6.1 để tính tốn giá trị ICsoGiá trị nồng độ thuốc thử có khả ức chế 50% sống tế bào HCT116 1.0 APA4 ETAc APD4- ETAc A P D 4- M fl APA4- Mft D L lĩ Met 0.0 —I -1— 1.5 Z0 I.o g c —I— 2.5 —I 3.0 (|ig /inl) Hình 3.5 Đường cong đáp ứng liều mẫu thử có giá trị A% 0.80, chứng tỏ kết thu có độ tin cậy cao 41 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội-2015 Bảng 3.2 Giá trị ICso thu mẫu thử có hoạt tính MCF7 ICso (Ịtig/ml) 91.4 Chất thử APA4- EtAc HCT116 IC5o(fig/ml) 109.2 R2 0.927 APA4- Met APD4- EtAc APD4- Met APA5- EtAc DL12- Met R2 0.862 168.9 0.879 54.5 0.962 47.8 131.8 112.1 0.805 232.2 0.949 0.843 23.13 0.894 0.9759 Ngoài ra, để chứng minh kết thu hồn tồn đáng tin cậy, thí nghiệm này, chúng tơi có sử dụng đối chứng đương Taxol, chất chứng minh có tác dụng tiêu diệt tế bào ung thư sử dụng thương mại Bảng 3.3 Giá trị ICsocủa Taxol ba dòng tế bào MCF7, HCT116 HepG2 MCF7 HCT116 HepG2 ICso (^g/ml) R2 IC50(ng/ml) R2 IC5o(^g/ml) R2 6.60 0.756 10.19 0.990 6.77 0.875 Taxol KẾT LUẬN Trong 10 chủng Vi khuẩn lam đánh giá khả ức chế tăng sinh, có: - Ba chủng có tác dụng ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư vú MCF7, là: APA4, APD4, APA5 với giá trị ICso thu là: 91.4^g/ml (APA4-EtAc), 54.5ng/ml (APD4-EtAc), 131.8^g/Inl (APD4-Met), 112.1ng/ml (APA5-EtAc) - Ba chủng có tác dụng ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư đại trực tràng HCTl 16: APA4, APD4 DL12 với giá trị ICsolần lượt là: 109.2fig/mi (APA4-EtAc), 168.9^g/ml (APA4-Met), 47.8ng/ml (APD4-EtAc), 232.2ng/ml (APD4-Met), 23.13ng/ml (DL12Met) - Tất 10 chủng đề khơng có tác dụng ức chế dịng tế bào ung thư gan HepG2 BÀN LUẬN Từ 10 chủng Vi khuẩn lam đánh giá hoạt tính, có ba chủng có tác dụng ức chế khả tăng sinh tế bào ung thư vú MCF7, ba chủng có tác dụng ức chế khả tăng sinh 42 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lăn II Hà Nội - 2015 Le, T.T.A (2010), “Chemical and Biological Investigations of Vietnamese Cyanobacteria”, Emst Moritz Amdt- Universitat Greifswald Pham, H.T.L (2007), “Bioassay- guided isolation o f cytotoxic and antiíungal compounds from cyanobacteria”, Emst Moritz Amdt- Universitat Greifswald Satoshi Nakayama, Y.T., Takeshi Takahashi, Tomokazu Yoshida, Tamotsu Sudo, Tomoko Matsushima, Yuko Kawasaki, Aya Katayama, Keigo Gohda, Gabriel N Hortobagyi, Shũizaburo Noguchi, Toshiyuki Sakai, Hideki Ishihara and Naoto T (2009)," Prediction of paclitaxel sensitivity by CDKl and CDK2 activity in human breast cancer cells", Breast Cancer Res Sulforhodamine B,VitroVivo Biotechnology 10 Vanicha Vichai, Kanyavvim Kirtikara, (2006), “Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening”, Nature Protocoỉs, pp 1112-1116 11.Wenlong Fang, Songtao Liu, Yinglam Nie, (2011), “Anticancer Activity of Chamaejasmine - Effect on tubulin protein”, Molecules, 16, pp 6243- 6254 Wiegand, c , and Pílugmacher, s (2005) Ecotoxicological effects of selected 12 cyanobacterial secondary metabolites a short review Toxicol Appl Pharmacol 203, 201218 44 ... chất tiềm vi khuẩn lam, chúng tơi tiến hành đánh giá khả ức chế sống dòng tế bào ung thư 10 chủng vi khuẩn lam lên ba dòng tế bào img thư: ung thư vú người MCF7, ung thư gan HepG2, ung thư đại... dụng ức chế dòng tế bào ung thư gan HepG2 BÀN LUẬN Từ 10 chủng Vi khuẩn lam đánh giá hoạt tính, có ba chủng có tác dụng ức chế khả tăng sinh tế bào ung thư vú MCF7, ba chủng có tác dụng ức chế khả. .. tìm chất có khả kháng lại xmg thư ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯOỈNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.ỉ Đổi tượng 2.1.1 Dòng tế bào - Dòng tể bào ung thư vú MCF7 - Dòng tế bào ung thư gan HepG2 - Dòng tế bào ung thư đại trực