luận văn thạc sĩ nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc la mã (matricaria chamomilla)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU TRÍCH LY THÀNH PHẦN DƯỢC LIỆU TỪ HOA CÚC LA MÃ (Matricaria chamomilla) Chủ nhiệm đề tài: TS Đặng Thu Thủy (chủ nhiệm) KS Nguyễn Văn Toàn Bà Rịa-Vũng Tàu, tháng 11 năm 2020 i THÔNG TIN CHUNG CỦA ĐỀ TÀI Tên đề tài: “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã Matricaria chamomilla” Chủ nhiệm đề tài: TS Đặng Thu Thủy Danh sách cán tham gia chính: KS Nguyễn Văn Tồn Nội dung chính: - Nghiên cứu phương pháp chiết tách thành phần dược liệu hoa cúc La Mã; - Xác định định tính định lượng nhóm hợp chất hoạt động sinh học hoa cúc La Mã; - Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất trích ly Đã xác định thơng số tối ưu cho q trình trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã; Đã xác định định tính thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã định lượng thành phần dược liệu hoa cúc La mã; - Đã khảo sát hoạt tính sinh học thành phần dược liệu trích ly - Đã hướng dẫn luận văn tốt nghiệp 03 sinh viên Thời gian nghiên cứu: 10 tháng từ tháng 01/2020-10/2020 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS Đặng Thu Thủy i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hoa cúc La Mã 1.2 Thành phần dược liệu hoa cúc La Mã 1.3 Tác dụng hoa cúc La Mã 1.4 Phương pháp chiết tách thành phần hoạt tính sinh học từ hoa cúc La Mã……… CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.2 Bố trí thí nghiệm 11 2.3 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa hiệu suất chiết cao cồn phương pháp chưng ninh 11 2.3.2 Chiết tách thành phần dược liệu phương pháp chưng ninh .13 2.3.3 Chiết cao cồn phương pháp ngấm kiệt 14 2.3.4 Chiết cao cồn phương pháp Soxhlet 14 2.3.5 Chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn: Soxhlet chưng ninh 15 2.3.6 Phương pháp chiết tách cao etyl acetat cao ete dầu hỏa từ cao cồn 16 2.3.7 Phương pháp định tính thành phần dược liệu 17 2.3.8 Định lượng thành phần dược liêu (flavonoid) tổng cao etyl acetat .18 2.3.9 Xác định thành phần dược liệu (flavonoid) sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ 18 2.3.10 Thử hoạt tính sinh học thành phần dược liệu (flavonoid) từ hoa cúc La Mã……………………………………………………………………………….19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Nghiên cứu chiết tách cao cồn 21 3.1.1 Nghiên cứu tối ứu hoa hiệu suất tách chiết cao cồn phương pháp chưng ninh 21 3.1.2 So sánh hiệu suất chiết cao etanol phương pháp chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet…………………………………………………………………… 24 3.1.3 So sánh hiệu suất chiết tách cao etanol phương pháp chưng ninh ii Soxhlet-chưng ninh…………………………………………………………… 25 3.2 So sánh hiệu suất chiết tách cao etyl acetat cao ete dầu hỏa…………………25 3.3 Định tính thành phần dược liệu cao chiết thu từ hoa cúc La Mã……26 3.3.1 Định tính thành phần dược liệu cao ete dầu hỏa……………………26 3.3.2 Định tính thành phần cao etyl acetate…………………………… 27 3.4 Kết xác định hàm lượng, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học thành phần dược liệu (flavonoid) từ hoa cúc La Mã……………………………………… 27 3.4.1 Định lượng thành phần flavonoid cao etyl acetat………………… 27 3.4.2 Thành phần hợp chất flavonoid………………………………………28 3.4.3 Hoạt tính sinh học flavonoid…………………………………………29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây hoa Cúc La Mã Hình 2.1 Sơ đồ bố trí nội dung thí nghiệm Hình 2.2 Quy trình chiết tách dược liệu phương pháp chưng ninh Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn phương pháp chưng ninh Hình 2.4 Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn phương pháp ngấm kiệt Hình 2.5 Sơ đồ khảo sát tách chiết hợp chất hoa cúc La Mã phương pháp Soxhlet Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn Soxhlet chưng ninh Hình 2.7 Sơ đồ chiết cao etyl acetat ete dầu hỏa Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ dung môi lên mật độ quang Hình 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên mật độ quang Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dược liệu/dung mơi lên mật độ quang Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian lên mật độ quang Hình 3.5 Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Catechin iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao tinh dầu hoa cúc La Mã Bảng 1.2 Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao flavonoid Bảng 1.3 Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao coumarine Bảng 3.1 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ dung môi Bảng 3.2 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nhiệt độ Bảng 3.3 Sự phụ thuộc mật độ quang vào tỷ lệ dược liệu/dung môi Bảng 3.4 Sự phụ thuộc mật độ quang vào thời gian Bảng 3.5 Hiệu suất chiết cao cồn theo phương pháp chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet Bảng 3.6 Hiệu suất chiết cao cồn phương pháp chưng ninh Soxhlet-chưng ninh Bảng 3.7 Hiệu suất chiết cao etyl acetat cao ete dầu hỏa Bảng 3.8 Kết định tính thành phần dược liệu cao ete Bảng 3.9 Kết định tính thành phần dược liệu cao etyl acetate Bảng 3.10 Kết xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu catechin Bảng 3.11 Hiệu suất flanovoid toàn phần Bảng 3.12 Công thức cấu tạo định danh số chất Bảng 3.13 Khả kháng khuẩn flanonoid với vi khuẩn v vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chamomile (Cúc La Mã) hay nước ta gọi Cúc Hoạ Mi loài thực vật thuộc họ Hoa Cúc có nguồn gốc từ Nam Đơng Âu Loại thảo dược trồng Đức, Hungary, Pháp, Nga, Croatia, Brazil Chamomile biết đến Ấn Độ thời kỳ Mughal, trồng Punjab, Uttar Pradesh, Maharashtra, Jammu Kashmir Các lồi thực vật tìm thấy Bắc Phi, châu Á, Bắc Nam Mỹ, Australia, New Zealand Hungary nơi trồng loại thực vật Tại Hungary, Chamomile mọc nhiều vùng đất nghèo nguồn thu nhập cho người dân nghèo khu vực Hoa xuất sang Đức với số lượng lớn để chưng cất tinh dầu Tại Ấn Độ, trồng Lucknow khoảng 200 năm trước, đưa đến Punjab khoảng 300 năm trước thời kỳ Mughal [6] Các tác dụng chữa bệnh Chamomile loài người phát cách hàng ngàn năm từ thời La Mã cổ đại, ghi nhận y văn Hippocrate Người Hy lạp La Mã cổ đại biết dùng Chamomile để chữa bệnh cách: giã nhỏ đắp chườm lên vết thương, vết lt ngồi da giúp phịng nhiễm khuẩn, giảm đau, nhanh liền sẹo; hãm hay sắc lấy nước uống chữa viêm loét miệng, sưng lợi , đau răng, đau bụng (do tiêu hoá, kinh nguyệt, …), đau đầu, ngủ, căng thẳng, … Hoa cúc La Mã từ lâu người Ai Cập cổ xem phương thuốc trị bách bệnh Trà loại dược thảo quý sử dụng hàng trăm năm qua với nhiều lợi ích tuyệt vời sức khỏe Nó có tác dụng nhiệt, giải độc, tán phong thấp, giáng hỏa,được dùng làm thuốc chữa nhức đầu, chóng mặt, đau mắt, tăng huyết áp (có thể dùng xoa bóp lên thái dương, vùng trán, gáy, hay cho thêm vào nước uống hàng ngày) [18] Trong y học khoa học đại, hoa cúc hãm đun sôi lấy nước, tinh dầu Hoa cúc La Mã sử dụng thuốc điều điều trị nội ngoại khoa Nước hãm từ hoa cúc có tác dụng chống viêm, cầm máu, sát trùng, làm se, giảm đau, an thần, chống co thắt, mồ hôi, điều tiết tác động mật Số lượng hợp chất phenolic tìm thấy hoa cúc chứng minh hiệu lâm sàng điều trị sưng phổi, có tác dụng bảo vệ màng tế bào mạch máu Các chế phẩm hoa cúc sử dụng điều trị nội khoa đổ mồ hôi, rối loạn co thắt kinh nguyệt, đau bụng, đầy hơi, tiêu chảy, viêm dày, viêm đại tràng; điều trị ngoại khoa - nước súc miệng, họng cổ họng Thuốc sắc từ hoa cúc sử dụng để rửa vết thương mưng mủ mắt Chamazulene hoa cúc sử dụng để điều trị bệnh hen suyễn, thấp khớp, viêm dày dị ứng viêm đại tràng, eczema, bỏng X-quang Chamazulene thúc đẩy trình tái tạo da, làm giảm phản ứng dị ứng [18] Tinh dầu hoa cúc sử dụng hương trị liệu cho chứng ngủ, đau nửa đầu, viêm da, bỏng eczema Tinh dầu hoa cúc khuyến khích sử dụng để điều trị cho bệnh hen suyễn, viêm phế quản, ho, cảm cúm, viêm bàng quang Mùi tinh dầu hoa cúc có đặc điểm sau: đắng, ấm nặng mùi Mùi tinh dầu hoa cúc có tác dụng an thần Mùi tinh dầu cịn có tác dụng làm giảm đau đầu, bắp, cải thiện hoạt động não với tinh thần mệt mỏi, làm giảm kích ứng làm dịu bộc phát Trong lĩnh vực hương trị liệu, tinh dầu hoa cúc khuyên dùng pha loãng nước dùng cho bệnh đau ruột; pha trà khác bị co giật; pha nước với mật ong bị kích thích thần kinh Khi trầm cảm nhà hương trị liệu chuyên nghiệp Joan Redford khuyến cáo rằng, nên sử dụng dầu hoa cúc xông nhỏ vào bồn tắm Hoa cúc sấy khô bỏ gối thảo dược thơm, thúc đẩy thư giãn bắp Tinh dầu hoa cúc giúp ngăn ngừa phản ứng dị ứng sau bị côn trùng cắn, hay làm giảm vết bầm tím Dưỡng thể với tinh dầu hoa cúc sử dụng vết bỏng, bong gân, da bị cháy nắng Nếu bị kích ứng da trẻ sơ sinh áp dụng mát xa, tắm với tinh dầu hoa cúc [18] Chiết xuất hoa cúc da có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, làm dịu, giảm đau, giữ ẩm, tái tạo, làm dịu chữa lành Chính phần sản phẩm mỹ phẩm cho da nhạy cảm Cúc La Mã - dược liệu tiêu thụ nhiều y học Vào năm 1986, cúc La Mã nguyên liệu khuyên dùng làm thuốc 26 quốc gia Tổng sản lượng hoa cúc khơ tồn giới năm 2007 lên đến 65000 Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng Tuy nhiên nguồn tài nguyên thuốc khơng cịn ngun vẹn Hiện nay, theo thống kê Viện Dược liệu (2007), có 144 lồi thuốc thuộc diện quý có nguy bị tuyệt chủng cần bảo tồn Trong số có nhiều lồi thuốc q Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis), Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus), Tam thất hoang (P stipuleanatus), loài Hoàng liên (Berberis spp.), Bách hợp (Lilium brownii), Biến hóa núi cao (Asarum balansae), Thanh mộc hương (Aristolochia tuberosa), Ba kích (Morinda officinalis), Đảng sâm (Codonopsis javanica)… Chính vậy, việc tìm kiếm hoạt chất tự nhiên “mới” có hoạt tính sinh học cao, có khả nhân rộng quy mô công nghiệp để làm thuốc xu nhiều nhà khoa học quan tâm Hoa cúc La Mã du nhập vào Việt Nam thời gian gần chủ yếu qua đường tiểu ngạch bán rải rác hiệu thuốc, cửa hàng mỹ phẩm Sản phẩm hoa cúc số nhà phân phối cung cấp tinh dầu trà hoa cúc với giá cao Ngoài cúc La Mã mọc nhiều nơi Việt Nam, đặc biệt vùng khí hậu mát mẻ Tây Nguyên Đà Lạt Tuy nhiên việc dụng loại dược liệu nhiều e ngại tâm lý người tiêu dùng chưa có nghiên cứu thức cách khoa học có hệ thống cơng bố nước thành phần hóa học hoạt tính sinh học loại hoa Chính việc “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã Matricaria chamomile” để phổ biến rộng rãi loại dược liệu nước cấp thiết Để đạt mục tiêu trên, nghiên cứu cần thực nội dung sau: Thu thập, nghiên cứu tài liệu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hoa cúc La Mã, tình hình sử dụng loại dược liệu giới nước; - Nghiên cứu phương pháp chiết tách thành phần dược liệu hoa cúc La Mã; Xác định định tính định lượng nhóm hợp chất hoạt động sinh học hoa cúc La Mã; - Khảo sát hoạt tính sinh học hợp chất trích ly Ngồi cịn có số hợp chất chưa định danh 3.4.3 Hoạt tính sinh học flavonoid Để xác định khả kháng khuẩn nhóm hợp chất flavonoid, chiết dung mơi etyl acetate với chủng vi sinh vật Samonella typhi ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, mẫu chiết bổ sung vào đĩa thạch (chứa môi trường Mueller Hinton) Nồng độ ban đầu chủng vi sinh vật nêu 10 CFU/ml Hàm lượng flavonoid pha loãng C0, C1, C2, C3, C4 (nồng độ 0,01 %; 0,02 %; 0,03 %; 0,04 %; 0,05 %) Sau 24 nuôi cấy, tiến hành đo đường kính vịng ức chế thu kết ghi 28 bảng 3.13 Bảng 3.13 Khả kháng khuẩn flanonoid với vi khuẩn Vi sinh vật thử nghiệm Samonella typhi ATCC 14028 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC 25922 Nồng độ (C) Qua kết bảng 3.13 cho thấy, tương ứng với nồng độ C o C1, đường kính vịng kháng khuẩn chủng vi sinh vật nêu 7.0 cm (Escherichia coli), 8.0 cm (Staphylococcus aureus), 9.0 cm (Samonella typhi), có nghĩa thể khả kháng khuẩn mạnh hợp chất nhóm flavonoid với chủng vi sinh vật kể Đối với nồng độ C2, C3, C4, khả kháng khuẩn flavonoid thể chủng vi sinh vật Samonella typhi với đường kính kháng khuẩn 8.0 cm nồng độ C2 Như khả kháng khuẩn flavonoid giảm theo pha loãng nồng độ 29 KẾT LUẬN Sau tiến hành nội dung thí nghiệm đề tài “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã Matricaria chamomile”, khuôn khổ đề tài thu kết sau: Điều kiện tối ưu để tách chiết thành phần dược liệu hoa cúc La Mã phương pháp chưng ninh cho thấy nồng độ dung môi sử dụng cồn 70 o, nhiệt độ 60 oC thời gian tách chiết với tỷ lệ “nguyên liệu/dung mơi” 1/40 điều kiện thích hợp để tách chiết Cao ete dầu hỏa cao etyl acetat chiết từ cao cồn bốn phương pháp: chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet, Soxhlet-chưng ninh phương pháp ngấm kiệt hiệu suất chiết cao (7,53 %) cao ete dầu hỏa; cao etyl acetat phương pháp Soxhlet-chưng ninh cao (21,51 %) Định tính thành phần dược liệu cao ete cao etyl chiết từ hoa cúc La Mã, cho thấy 02 loại cao thu từ hoa cúc La mã dương tính terpenoid, flavonoid coumarin Kết định lượng flavonoid toàn phần từ cao etyl acetat với chất chuẩn catechin, hiệu suất flavonoid cao thu từ cao etyl acetat chiết từ cao etanol theo phương pháp Soxhlet kết hợp chưng ninh 1,98% Phân tích sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ mẫu cao etyl acetat xác định hợp chất thuộc nhóm flanovoid - Hoạt tính sinh học flavonoid cao etyl acetat thử chủng vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Samonella typhi ATCC 14028, cho đường kính vịng kháng khuẩn 7cm, 8cm, 9cm Do điều kiện kỹ thuật, thời gian kinh phí cịn hạn chế nên số vấn đề chưa giải nên đề xuất cho hướng nghiên cứu sau: Chiết suất phân đoạn thành phần dược liệu hoa cúc La Mã phương pháp khác như: chưng lôi nước trực tiếp gián tiếp, chiết CO lỏng siêu tới hạn, phương pháp có hỗ trợ vi sóng, để so sánh đưa phương pháp cho hiệu suất thu thành phần dược liệu tối ưu Tiến hành phân tích thành phần hố học tất mẫu hợp chất hoạt động sinh học thu từ trình thực nghiệm để so sánh đưa phương pháp cho chất lượng terpenoid – steroid có chất lương tốt tỷ lệ cao 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM [2] Nguyễn Thu Hằng Bài giảng dược liệu chứa flavonoid [3] Trần Việt Hưng, Phan Đức Bình (2014) Cây hoa qn bình, Khoa học phổ thơng số 199, 2014;16:22 [4] Phan Quốc Kinh Giáo trình hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học: phần 2, 181-121 [5] Trần Anh Vũ (2013) Dương cam cúc, Tạp chí dược học Tài liệu tiếng Anh [6] European Medicines Agency (2014) Assessment report on Matricaria recutita L., flos and Matricaria racutita L., aetheroleum.Based on Article 16d(1), Article 16f and Article 16h of Directive 2001/83/EC as amended (traditional use) [7] Janmejai K Srivastava, Eswar Shankar, Sanjay Gupta (2010) Chamomile: A herbal medicine of the past with bright tuture, molecular medicine report 1;3 (6): 895-901 [8] Janmejai K Srivastava, Eswar Shankarand Sanjay Gupta (2011) Chamomile: A herbal medicine of the past with bright future Mol Med Report, Author manuscript; available in PMC 2011 Feb [9] Janmejai K Srivastava, Sanjay Gupta (2009) Extraction, Characterization, Stability and Biological Activity of Flavonoids Isolated from Chamomile Flowers Mol Cell Pharmacol Author manuscript, 2009 Jan 1; 1(3): 138 [10] Journal of Applied Pharmaceutical Science (2011) German an Roman Chamolie.J ISSN: 2231-3354, Received on: 12-12-2011, Revised on: 15:12:2011, Accepted on: 18-12-2011 [11] Marilena marini, Carla bersani, giuseppe comi (2011) Impedance measurements to study the antimicrobial activity of essential oils from Lamiaceae and Compositae Science Direct, Volume 67, Issue 3,5 August 2011, Pages 187-195 [12] Marziyeh Tolouee, Soheil Alinezhad, Reza Saberi, Ali Eslamifar, Seyed Javad Zad, Kamkar Jaimand,Jaleh Taeb, Mohammad-Bagher Rezaee, Masanobu Kawachi, Masoomeh Shams-Ghahfarokhi, Mehdi Razzaghi-Abyaneh (2010) Efect of Matricaria chamomilla L flower esential oil on the growth and ultrastructure of Aspergillus niger van Tieghem Int J Food Microbiol ;139(3):127-33 31 [13] Massimiliano Bonifacio, Antonella Rigo, Emanuele Guardalben, Christian Bergamini, Elisabetta Cavalieri, Romana Fato, Giovanni Pizzolo, Hisanori Suzuki, Fabrizio Vinante (2012) α-bisabolol is an effective proapoptotic agent against BCRABL(+) cells in synergism with Imatinib and Nilotinib PLoS ONE 2012-01-01 [14] Nawal Hasan Al Bahtiti (2012) Chemical analysis and biological activity of Jordanian chamomile extracts Journal of Food Science and Technology 4(1): 2225 [15].Ompal Singh, Zakia Khanam, Neelam Misra, Manoj Kumar Srivastava (2011) Chamomile (Matricaria chamomilla L.): An overview, Pharmacogn Rev, 5(9): 82-95) [16] Orav A , Raal A, E Arak (2010) Content and composition of the essential oil of Chamomilla recutita (L.) Rauschert from some European countries Nat Prod Res.2010;24(1):48-55 [17] Petrulova Poracka V, Repcak M, Vilkova M, Imrich J (2013) Coumarin of matricaria chamomilla L aglycones and glycosides Food Chem nov 1; 141(1): 5459 Tài liệu tiếng Nga [18] Предисловие // Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность / Отв ред А Л Буданцев — СПб.—М : Товарищество научных изданий КМК, 2013 — Т Семейство Asteraceae (Compositae), кн Роды Echinops — Youngia — С 3—5 — 312 с 32 PHỤ LỤC 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 ... trình trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã; Đã xác định định tính thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã định lượng thành phần dược liệu hoa cúc La mã; - Đã khảo sát hoạt tính sinh học thành. .. hình thái hoa cúc La Mã thể hình 1.1 Hình 1.1 Cây hoa Cúc La Mã 1.2 Thành phần dược liệu hoa cúc La Mã Theo kết nghiên cứu trước đây( [6], [7], [8], [15]) thành phần hợp chất có hoa cúc La Mã đa... QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hoa cúc La Mã 1.2 Thành phần dược liệu hoa cúc La Mã 1.3 Tác dụng hoa cúc La Mã 1.4 Phương pháp chiết tách thành phần hoạt