Nghiên cứu một số gen liên quan đến khả năng kháng carbapenem của các chủng acinetobacter baumannii phân lập tại bệnh viện phổi trung ương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LƯU THỊ NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LƯU THỊ NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM BẢO YÊN Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phạm Bảo Yên, người trực tiếp giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình thực luận văn cao học Xin chân thành cám ơn ln tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Trường đại học khoa học tự nhiên, cán Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Khoa Vi sinh Bệnh viện Phổi Trung Ương thành viên nhóm nghiên cứu đề tài Q6.17.60 tạo điều kiện môi trường cho thực nghiên cứu Xin cảm ơn bạn sinh viên Phịng Thí nghiệm Enzyme học Phân tích hoạt tính sinh học giúp đỡ nhiều thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt kiến thức quý báu hỗ trợ cho tơi hồn thành chương trình đào tạo thạc sĩ Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội tạo điều kiện, cổ vũ động viên trình học tập thực luận văn Mặc dù cố gắng nỗ lực, luận văn không tránh khỏi thiếu sót hạn chế Rất mong nhận đóng góp từ thầy cơ, nhà khoa học để tơi tiếp tục hồn thiện cơng trình nghiên cứu Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 09 tháng 12 năm 2019 Học viên Lưu Thị Ngọc Hân DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Chữ viết tắt, ký hiệu A baumannii Acinetobacter baumannii AMEs Aminoglycoside-modifying enzymes CDC Centers for Disease Control and Prevention CTX-M Cefotaxime hydrolyzing capabilities DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate ECDC European Centre for Disease Prevention and Control Fw Forward GES Guiana extended spectrum ICU Intensive care unit IMP Imipenemase KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase LAMP Loop-mediated isothermal amplification LPS Lipopolysaccharide MATE Multidrug and toxic compound extrusion MDR Multidrug-resistant MFS Major facilitator superfamily MIC Minimum Inhibitory Concentration OXA Oxacillinase PBP Penicillin-Binding Protein PCR Polymerase Chain Reaction PDR Pandrug-resistant RNA Ribonucleic acid RND Resistance-nodulation-division Rv Reverse SHV Sulfhydryl Variable SIM Seoul Imipenemase SMR Small multidrug resistance TEM Temoneira VAP Ventilator Associated Pneumonia VEB Vietnam extended-spectrum β-lactamase VIM Verona Imipenemase WHO World Health Organization XDR Extensively drug-resistant DANH MỤC HÌNH Hình 1: Các vị trí tác dụng kháng sinh …………………………………………4 Hình 2: Cấu trúc hóa học carbapenem………………………………………….9 Hình 3: Hình ảnh tế bào vi khuẩn A baumannii ………………………………… 12 Hình 4: Hình thái khuẩn lạc mơi trường thạch……………………………13 Hình 5: Các chế kháng kháng sinh A baumannii………………………… 19 Hình 6: Nguyên tắc kỹ thuật multiplex PCR………………………………… 25 Hình 7: Chu trình nhiệt tối ưu phản ứng multiplex PCR…………… 31 Hình 8: Kết phản ứng multiplex PCR…………………………………… 33 Hình 9: Biểu đồ tỷ lệ % gen nghiên cứu………………………………… 34 Hình 10: Tỷ lệ % kháng carbapenem mẫu A baumannii nghiên cứu…….40 Hình 11: Mức độ kháng A baumannii với kháng sinh nhóm beta-lactam 42 Hình 12: Mức độ kháng A baumannii với số kháng sinh khác………… 43 Hình 13: Kết giải trình tự gen OXA-51 với mồi xi so sánh kết giải trình tự với ngân hàng gen………………………………………………… …….47 Hình 14: Mức độ tương đồng nucleotide……………………………………….49 Hình 15: Mức độ tương đồng acid amin……………………………………… 50 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học……………………………… Bảng 2: Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh A baumannii…………19 Bảng 3: Bảng danh mục kháng sinh sử dụng làm kháng sinh đồ để đánh giá mức độ nhạy cảm Acinetobacter spp………………………………………… 29 Bảng 4: Trình tự cặp mồi cho gen OXA-23, OXA-51, VIM IMP……… 30 Bảng 5: Các thành phần tham gia phản ứng multiplex PCR……………………… 31 Bảng 6: Thống kê tần suất xuất gen OXA-51 giới Việt Nam.…… 34 Bảng 7: Thống kê tần suất xuất gen OXA-23 giới Việt Nam ……….36 Bảng 8: Tổng hợp tổ hợp gen đích…………………………………………… 39 Bảng 9: Kết PCR kháng sinh đồ mẫu A baumannii…….…………44 Bảng 10: Kết PCR kháng sinh đồ số chủng giải trình tự………….48 Bảng 11: Sự thay đổi nucleotide acid amin so với trình tự tham chiếu………….48 MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………… ………………….1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Kháng sinh ………………………………… …………………………… 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh phân loại theo cấu trúc hóa học………………… 1.1.2 Cơ chế vị trí tác dụng kháng sinh…………………………………… 1.1.2.1 Ức chế trình sinh tổng hợp protein…….……….…….…………………5 1.1.2.2 Ức chế trình sinh tổng hợp acid nucleic……………… ……………… 1.1.2.3 Kìm hãm trình trao đổi chất…………………………………… … 1.1.2.4 Tác động lên thành tế bào vi khuẩn…………………………………… ……6 1.1.2.5 Tác động lên màng tế bào vi khuẩn……………………………………….…7 1.1.3 Kháng sinh nhóm beta-lactam……………………………………………… 1.1.3.1 Penicilin ………………………………………………………….……… 1.1.3.2 Cephalosporin ………………………………………………………… …8 1.1.3.3 Monobactam…………………………………………………… ……… 1.1.3.4 Carbapenem ………………………………………………………… ……9 1.1.3.5 Nhóm ức chế beta-lactamase…………………………………………… 10 1.1.4 Phối hợp kháng sinh điều trị …………………………………………10 1.2 Vi khuẩn Acinetobacter baumannii………………………… …………….11 1.2.1 Giới thiệu chung vị trí phân loại…………………………………………11 1.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý - sinh hóa………………………………………12 1.2.3 Dịch tễ học…………………………………………………………… ……13 1.2.4 Thực trạng kháng kháng sinh A baumannii……………………… … 15 1.2.4.1 Trên giới……………………………………………………………… 15 1.2.4.2 Tại Việt Nam……………………………………………………………… 16 1.2.4.3 Các chế kháng kháng sinh A baumannii……………………………17 1.2.4.4 Tần suất xuất gen carbapenemase…………………………………19 1.2.4.5 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh A baumannii…………21 1.3 Các phương pháp nghiên cứu A baumannii ………………………….…… 22 1.3.1 Phương pháp nuôi cấy………………………………………………………22 1.3.2 Phương pháp sinh học phân tử………………………………………………24 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………… 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………….27 2.2.1 Nuôi cấy định danh A baumannii từ mẫu bệnh phẩm ………… ………27 2.2.1.1 Nguyên tắc…………………………………………………………… … 27 2.2.1.2 Hóa chất sinh phẩm……………………………………………………… 27 2.2.1.3 Các bước tiến hành…………………………………………….………… 27 2.2.2 Tách DNA ………………………………………………………… ………28 2.2.3 Kháng sinh đồ ………………………………………………………………28 2.2.4 Multiplex PCR …………………………………………………………… 30 2.2.4.1 Hóa chất, thiết bị ………………………………………………………… 30 2.2.4.2 Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR……………………………………….30 2.2.4.3 Các cặp mồi sử dụng ……………………………………………………….29 2.2.4.4 Thành phần phản ứng………………………………………………………31 2.2.4.5 Chu trình nhiệt …………………………………………………………… 31 2.2.4.6 Điện di …………………………………………………………………… 31 2.2.5 Phân tích kết quả… ………………………………………………….…….32 2.2.5.1 Phân tích trình tự DNA ……………………………… ………………… 32 2.2.5.2 Xử lý số liệu…….…………………………………………… ……… …32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tần suất có mặt gen kháng kháng sinh A baumannii Bệnh viện Phổi Trung ương ……….………………………………………….33 3.1.1 Tần suất xuất gen đơn……………………………………………….33 3.1.2 Sự có mặt tổ hợp gen …………………………………………………38 3.2 Phân tích mức độ kháng kháng sinh mẫu A baumannii thu được…39 3.2.1 Khả kháng beta-lactam carbapenem ………………………………… 39 3.2.2 Các nhóm beta-lactam khác ……………………………………………… 41 3.2.3 Các kháng sinh khác……………………………………………………… 42 3.2.4 Đánh giá chung…………………………………………………………… 43 3.3 So sánh kết có mặt gen khả kháng kháng sinh dựa kháng sinh đồ xác định mối liên quan …………………………… ….44 3.4 Phân tích trình tự số mẫu để khẳng định độ xác phương pháp tìm hiểu khác biệt chủng thu số chủng khác giới………………………………………………………………………….47 3.4.1 Phân tích trình tự nhằm khẳng định độ xác phương pháp……….47 3.4.2 Phân tích biến đổi trình tự chủng thu số chủng khác giới……………………………………………………… 48 KẾT LUẬN………………………………… ………………………………… 51 KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO……… …………….52 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… …53 ... NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07... gen kháng kháng sinh A baumannii Bệnh viện Phổi Trung ương Phân tích mức độ kháng kháng sinh mẫu A baumannii thu Nghiên cứu mối liên quan khả kháng carbapenem với có mặt bốn gen đích mã hóa carbapenemase... với kháng sinh cần thiết hỗ trợ, chẩn đốn điều trị bệnh Vì vậy, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu số gen liên quan đến khả kháng carbapenem chủng Acinetobacter baumannnii phân lập Bệnh viện Phổi Trung ương? ??