Khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus plantarum l5 vào bảo quản và xử lý hạt bắp

1 ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƢỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XIX NĂM 2017 TÊN CƠNG TRÌNH KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM L5 VÀO BẢO QUẢN VÀ XỬ LÝ HẠT BẮP LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: Nông Lâm Ngƣ Nghiệp CHUYÊN NGÀNH: Nơng Nghiệp Mã số cơng trình: …………………………… (Phần BTC cấp thành ghi) i TĨM TẮT CƠNG TRÌNH Vi khuẩn lên men lactic từ lâu đƣợc sử dụng loại thực phẩm lên men truyền thống Bên cạnh đó, chúng cịn có khả sản sinh hợp chất ức chế phát triển vi sinh vật có nấm mốc Dù an tồn có nhiều ứng dụng nhƣng cơng trình nghiên cứu khả ứng dụng bảo quản xử lý hạt cịn Mục tiêu nghiên cứu khảo sát khả ứng dụng dịch nuôi cấy, yếu tố ảnh hƣởng đến khả nắng ức chế nấm Fusarium sp chủng Lactobacillus sp L5 thúc đẩy trình tăng trƣởng bảo quản hạt bắp Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 lấy từ phịng thí nghiệm đƣợc xác định khiết thử nghiệm sinh lý, sinh hoá kiểm tra khả sinh enzyme ngoại bào Chủng nấm mốc Fusarium sp lấy từ Trung tâm Ƣơm tạo, Khu nông nghiệp Cơng Nghệ Cao Thành Phố Hồ Chí Minh đƣợc kiểm tra khả phát triển Kế đến kiểm tra khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus plantarum với chủng nấm Fusarium sp., tỉ lệ đối kháng trung bình đạt 61% khơng cao so với chất kháng nấm Carbenzim 64% nhƣng cho thấy chất kháng nấm tiềm có nguồn gốc sinh học Tác nhân ức chế nấm mốc đƣợc tiến hành cách sử dụng dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum không trung hoà pH trung hoà pH 6,0 đồng thời không gia nhiệt gia nhiệt 15 phút cho thấy khả ức chế nấm thay đổi nhƣng không đáng kể theo pH, nhƣng giảm 35 - 40% gia nhiệt 100°C, 20 – 23% 80oC – 7% 65oC 15 phút Chứng tỏ ngồi trừ enzyme ngoại bào, cịn có tác nhân ức chế khác Dịch nuôi cấy dịch nuôi cấy gia nhiệt 15 phút có khả kích thích tăng trƣởng hạt bắp giống có khả bảo quản hạt bắp sau cảm nhiễm nấm 10 ngày Nghiên cứu cho thấy khả ứng dụng vi khuẩn lên men lactic từ thực phẩm truyền thống bảo quản xử lý hạt giống bắp, tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu rộng mở hƣớng bảo quản xử lý hạt giống nơng sản biện pháp có độ an tồn sinh học cao, khơng gây hại cho ngƣời sử dụng ii MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Tính cấp thiết đề tài: Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 2.1 Ngoài nƣớc 2.2 Trong nƣớc Mục đích nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu 6.1 Phƣơng pháp luận 6.2 Phƣơng pháp xử lí số liệu Kết đạt đƣợc CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Phân loại nấm 1.1.3 Một số độc tố tác hại độc tố nấm mốc 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic 15 1.2.1 Đặc điểm chung 15 1.2.1.1 Hình thái dinh dưỡng vi khuẩn lactic 15 1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 16 1.2.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic 17 1.2.2 Khả sinh sinh hợp chất kháng khuẩn chủng LAB 18 1.2.2.1 Bacteriocin 18 iii 1.2.1.2 Phân loại bacteriocin 19 1.2.3 Khả kháng nấm LAB ứng dụng 21 1.2.3.1 Khả kháng nấm LAB 21 1.2.3.2 Ứng dụng vi khuẩn LAB 22 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Địa điểm nghiên cứu: 24 2.2 Thời gian thực hiện: 24 2.3 Vật liệu nghiên cứu 24 2.3.1 Vật liệu: 24 2.3.2 Hố chất mơi trường sử dụng: 24 2.3.2.1 Hoá chất: 24 2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy: 24 2.4 Thiết bị dụng cụ: 24 2.4.1 Thiết bị: 24 2.4.2 Dụng cụ: 25 2.5 Phƣơng pháp luận: 25 2.5.1 Mục tiêu nghiên cứu: 25 2.5.2 Nội dung: 25 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu: 26 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu: 26 2.6.2 Khảo sát hình thái vi khuẩn 27 2.6.2.1 Nhuộm Gram 28 2.6.2.2 Nhuộm bào tử 28 2.6.2.3 Thử nghiệm di động 29 2.6.2.4 Thử nghiệm Catalase 30 2.6.2.5 Hàm lượng acid tổng 30 2.6.2.6 Thử nghiệm khả lên men đường 30 2.6.2.7 Thử nghiệm Protease 31 2.6.2.8 Thử nghiệm Chitinase: 31 iv 2.6.3 Khảo sát khả sinh IAA chủng vi khuẩn Lactobacillus L5 31 2.6.3.1 Định tính khả sinh IAA 31 2.6.3.2 Định lượng IAA có dịch ni cấy 32 2.6.4 Phương pháp định danh chủng Lactobacillus sp L5 32 2.6.5 Khả sát khả phát triển chủng nấm Fusarium sp.: 33 2.6.6 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Fusarium sp.: 34 2.6.7 Ảnh hưởng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 đến độ khoẻ mầm bắp 35 2.6.8 Khảo sát khả đối kháng dịch nuôi cấy sau gia nhiệt chủng Lactobacillus sp L5 với Fusarium sp.: 36 2.6.9 Khảo sát khả ảnh hưởng dịch buôi cấy chủng Lactobacillus sp L5 nảy mầm hạt 38 2.6.10 Khảo sát khả ảnh hưởng dịch ni cấy chủng Lactobacillus sp L5 có cảm nhiễm nấm mốc nảy mầm hạt 40 2.3.9 Ứng dụng sử dụng dịch nuôi cấy bảo quản hạt bắp 42 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 44 3.1 Khảo sát sinh lý, sinh hóa tính chủng Lactobacillus sp L5 44 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc đĩa MRS Agar 44 3.1.2 Hình thái tế bào 45 3.1.3 Thử nghiệm Catalase 46 3.1.4 Khả di động 46 3.1.5 Hàm lượng acid tổng 47 3.1.6 Khả lên men đường 48 3.1.7 Thử nghiệm Chitinase 49 3.1.8 Thử nghiệm Protease 50 3.3 Kết định danh vi khuẩn Lactobacillus sp L5 54 3.4 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus plantarum với chủng nấm mốc Fusarium sp.: 54 v 3.5 Khảo sát khả đối kháng dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus plantarum sau gia nhiệt 55 3.6 Khảo sát ảnh hƣởng dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum phát triển hạt bắp 58 3.6.1 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum tới thời gian nảy mầm…………………………………………………………………………………58 3.6.2 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus palntarum tới tỉ lệ nảy mầm 60 3.6.3 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum tới chiều cao 62 3.6.4 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum tới chiều dài rễ 65 3.6.5 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum tới sinh khối tươi 68 3.6.6 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy đến độ khoẻ 70 3.7 Ứng dụng dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum bảo quản hạt 72 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1 Kết luận 78 4.2 Kiến nghị 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật KĐKTH: Không đun, khơng trung hồ KĐTH: Khơng đun, trung hồ KTHCN: Khơng trung hồ, cảm nhiễm KTHKCN: Khơng trung hồ, khơng cảm nhiễm LAB: Lactic acid bacteria MRS: Man De Rogosa and Sharpe NT: Nghiệm thức PDA: Potato Dextrose Agar PDB: Potato Dextrose Broth THCN: Trung hoà, cảm nhiễm THKCN: Trung hồ, khơng cảm nhiễm VSV: Vi sinh vật vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số loại nấm độc tố chúng 13 Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa LAB phƣơng thức hoạt động 18 Bảng 1.3: Một số hợp chất đƣợc xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men 22 Bảng 3.2: Khả lên men loại đƣờng Lactobacillus sp L5 49 Bảng 3.3: Kết biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ IAA 51 Bảng 3.4: Đƣờng kính phát triển chủng nấm mốc Fusarium sp 52 Bảng 3.5: Tỉ lệ ức chế (%) chủng nấm mốc Fusarium sp Lactobacillus plantarum L5 54 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng yếu tố đến tỉ lệ ức chế Fusarium sp 55 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy tới thời gian nảy mầm 58 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy tới tỉ lệ nảy mầm 60 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chiều cao bắp ngày 62 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy tới rễ sau ngày 65 Bảng 3.11: Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy tới sinh khối tƣơi sau ngày 68 Bảng 3.12: Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy đến độ khoẻ mầm sau ngày 70 Bảng 3.13: Khả kháng nấm dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum L5 nghiệm thức ứng dụng bảo quản hạt bắp 72 viii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu trúc hố học Trichothecennes Detoxified 10 Hình 3.1: Khuẩn lạc Lactobacillus sp L5 đĩa MRS Agar (Trái) khuẩn lạc quan sát dƣới kín hiển vi (phải) 44 Hình 3.2: Vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau nhuộm Gram 45 Hình 3.3: Vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau nhuộm bào tử 45 Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 46 Hình 3.5: Khả di động chủng Lactobacillus sp L5 47 Hình 3.6: Hàm lƣợng acid lactic vi khuẩn Lactobacillus sp L5 theo thời gian 48 Hình 3.7: Khả lên men loại đƣờng Lactobacillus sp L5 49 Hình 3.8: Thử nghiệm chitinase chủng Lactobacillus sp L5 49 Hình 3.9: Thử nghiệm protease chủng Lactobacillus sp L5 50 Hình 3.10: Dịch ni cấy sau ly tâm đổi màu cho thuốc thử so với ĐC 51 Hình 3.11: Đồ thị thể mối tƣơng quan số OD530nm nồng độ IAA 51 Hình 3.12: Khả phát triển chủng nấm mốc Fusarium sp môi trƣờng MRS Agar cải tiến PDA sau ngày 53 Hình 3.13: Hình thái sợi nấm bảo tử nấm mốc Fusarium sp dƣới kính hiển vi 53 Hình 3.14: Khả ức chế nấm dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum nấm mốc Fusarium sp 55 Hình 3.15: Đồ thị thể ảnh hƣởng chế độ xử lý nhiệt dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum L5 lên khả kháng Fusarium sp 56 Hình 3.16: Khả ức chế nấm chủng Lactobacillus plantarum L5 sau gia nhiệt 57 Hình 3.17: Đồ thị biểu thị ảnh hƣởng dịch nuôi cấy trƣớc sau gia nhiệt thời gian nảy mầm hạt bắp 59 Hình 3.18: Đồ thị biểu thị ảnh hƣởng dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum L5 tới tỉ lệ nảy mầm 61 Hình 3.19: Đồ thị biểu thị ảnh hƣởng dịch nuôi cấy tới chiều cao bắp sau ngày 63 ix Hình 3.20: Chiều cao NT THKCN sau ngày 64 Hình 3.21: Chiều cao NT THCN sau ngày 64 Hình 3.22: Chiều cao NT KTHKCN sau ngày 64 Hình 3.23: Chiều cao NT THKCN sau ngày 65 Hình 3.24: Đồ thị thể chiều dài rễ nghiệm thức sau ngày 66 Hình 3.25: Chiều dài rễ bắp NT THKCN sau ngày 67 Hình 3.26: Chiều dài rễ bắp NT THCN sau ngày 67 Hình 3.27: Chiều dài rễ bắp NT KTH KCN sau ngày 68 Hình 3.28: Chiều dài rễ bắp NT KTHCN sau ngày 68 Hình 3.29: Biểu đồ thể sinh khối tƣơi NT sau ngày 69 Hình 3.30: Đồ thị biểu thị độ khoẻ mầm bắp sau ngày 71 Hình 3.31: Sự phát triển nấm mốc qua ngày nghiệm thức dịch nuôi cấy Lactobacillus plantarum L5 73 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ môn Dƣợc lý – Vệ sinh an tồn thực phẩm (2011) Giáo trình vệ sinh an toàn thực phẩm, Đại học Thái Nguyên, trang 45 – 52 Hoa Thị Minh Tú, Nguyễn Tiến Thành, Lê Thanh Mai, Lê Thanh Bình (2007) Một số tính chất bcteriocin đƣợc tổng hợp vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bị tƣơi Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 45, trang 82 Nguyễn Đức Lƣợng (2002) Công nghệ vi sinh vật tập Vi sinh vật học công nghiệp NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Hồng, Lê Đình Lƣơng (1982) Vi nấm NXB Khoa học kỹ thuật, trang 108 - 110 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty (2009) Vi Sinh Vật Học NXB Giáo Dục, trang 200 – 218 Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trƣơng Thị Hòa, Lê Thị Lan Chi (2009) Vi sinh vật nhiễm tạp lƣơng thực - thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, trang 66 - 81 Phạm Duy Tƣờng (2009) Dinh dƣỡng vệ sinh an toàn thực phẩm NXB Giáo Dục, trang 162-164 Tài liệu Tiếng Anh A Laitila, H-L Alakomi, L Raaska, T Mattila-Sandholm and A Haikara (2002) Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting of barley Barbara M Lund, Tony C Baird – Parker and Grahame W Gould (2000); The Microbiological Safety and Quality of Food, Volume I, II; Aspen Publisher, Inc Gaithersburg, Maryland 10 Basavaraj M Kuraber cộng (2012) Isolation and functional characterization of lactic acid bacteria from different sources: 21 - 40 11 Fowler G.G., Javis B and Tramer J (1975) The assay of nisin in foods Society of Applied Bacteriology Technology Ser.8, page 91-105 80 12 Gerkaeva T 2008 Introdiction to Fusarium – apictorial atlas, Mitt Biol Bundesand – u Forswisch Berlin – Dahlem 209: – 406 13 Gerlach Ƣ, Nirenberg HI (1982) The genus Fusarium – a pictorial atlas Mitt Biol Bundesanst Land – u Forstwirsch Berlin – Dahlem, page 1- 406 14 Ghiasian S.A, Rezayat S.M, Kord B.P, Maghsood A.H, Yazdanpanah H, Shephard G.S, Westhuizen L, Vismer H.F, Walter F.O.M 2005 Fumonisin production by Fusarium species isolated from freshly harvested cỏn in Iran Mycopathologia, 31 – 40 15 Klaenhammer R 1993 Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria FEMS Microbiology Reviews, vol.12 page 39-89 16 Magnusson, J and J Schnurer 2001 Lactobacillus coryniformis subsp coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound Appl Environ Microbiol 67(1): 1-5 17 Nabil Saad (2004) Aflatoxins: Occurrence and Health Risks 18 Roy, U., V K Batish, S Grover, and S Neelakantan 1996 Production of antifungal substance by Lactococcus lactis subsp lactis CHD-28.3 International Journal of Food Microbiology 32(1-2): 27-34 19 Roy, U., V K Batish, S Grover, and S Neelakantan 1996 Production of antifungal substance by Lactococcus lactis subsp lactis CHD-28.3 International Journal of Food Microbiology 32(1-2): 27-34 20 Scott, P.M 1984 Effects of food processing on mycotoxins J Food Prot., 47(6): 489 21 Seifert cs (1996) Fusarium interactive key Agriculture and Agri – Food Canada 22 United States Department of Agriculture (2009) Grain Fungal Diseases and Mycotoxin Reference PHỤ LỤC A THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM A1 Mơi trƣờng Potato Dextrose Agar Thành phần Gam/L D-glucose 20 Dịch chiết khoai tây 1000ml 1000ml Agar 20 pH 5,6 ± 0,2 Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, đun với 1000ml nƣớc cất 30 phút Thu dịch chiết định mức lên 1000ml A2 Môi trƣờng Potato Dextrose Broth Thành phần Gam/L D-glucose 20 Dịch chiết khoai tây 1000ml 1000ml pH 5,6 ± 0,2 Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, đun với 1000ml nƣớc cất 30 phút Thu dịch chiết định mức lên 1000ml A3 Môi trƣờng de Man, Rogosa Sharpe Agar (MRS agar): Thành phần lít: Thành phần Gam/L Beef extract 10.0 Yeast extract 10.0 Sodium acetate 5.0 Sodium acetate 5.0 Dextrose 20.0 Amonium citrate 2.0 Dipotassium phosphate 2.0 Tween 80 1.0 Magiesium sulfate 0.1 Manganese sulfate 0.05 Agar 15 Nƣớc cất 1000ml pH 25°C 6.5 ± 0.2 A4 Môi trƣờng de Man, Rogosa Sharpe Broth (MRS Broth): Thành phần Gam/L Beef extract 10.0 Yeast extract 10.0 Sodium acetate 5.0 Sodium acetate 5.0 Dextrose 20.0 Amonium citrate 2.0 Dipotassium phosphate 2.0 Tween 80 1.0 Magiesium sulfate 0.1 Manganese sulfate 0.05 Nƣớc cất 1000ml pH 25°C 6.5 ± 0.2 A5 Môi trƣờng Chitin 1% Thành phần Gam/L Chitin 10 Agar 15 Đệm Phosphate pH= 1000ml A6 Môi trƣờng Casein 1% Thành phần Gam/L Casein 10 Agar 15 Đệm Phosphate pH= 1000ml B PHỤ LỤC BẢNG LIỆU Chú thích: CBZ Carbenzim KTH Khơng trung hồ TH Trung hồ CN Cảm nhiễm KCN Không cảm nhiễm B.1 TỈ LỆ KHÁNG NẤM Ở CÁC MỨC NHIỆT ĐỘ: The SAS System 14:23 Thursday, July 12, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source DF Squares Model 10 13216.02667 Error 22 Corrected Total 0.980467 Source NGHIEMTHUC 263.28667 32 RSquare DF Mean Square 1321.60267 Pr > F 110.43 F 110.43 F 99.82 F 311.95 F 170.43