BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HĨA CÁC CẶP MỒI MICROSATELLITE TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : BÙI THỊ LIÊN HÀ Sinh viên thực MSSV: 1151110518 : TẠ THANH THẾ Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, hình ảnh kết luận văn trung thực Nếu có gian dối nào, tơi xin chịu hồn toàn trách nhiệm TP HCM, ngày … tháng … năm 2015 Sinh viên, Tạ Thanh Thế iii Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức cho em năm học qua Những kiến thức mà em nhận giảng đường đại học khơng tảng cho q trình thực luận văn tốt nghiệp mà hành trang quý báu giúp em vững bước tương lai Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II Ths Bùi Thị Liên Hà tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm tạo điều kiện tốt cho em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến chị Lê Ngọc Thùy Trang bạn sinh viên phòng thí nghiệm Di Truyền Phân Tử nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ động viên em suốt thời gian qua Đồng thời, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến người bạn chỗ dựa vững sát cánh bên suốt năm học qua Cuối cùng, gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ động viên giúp đỡ vượt qua khó khăn sống trình học tập TP HCM, ngày … tháng … năm 2015 Sinh viên, Tạ Thanh Thế iv Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH xii MỞ ĐẦU……… 1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu cá Tra (Pangasianodon hypophthamus) 1.1.1 Hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái 1.1.3.1 Đặc điểm phân bố 1.1.3.2 Đặc điểm sinh sản 1.2 Tình hình chọn giống cá tra đồng sông Cửu Long 1.2.1 Tình hình ni cá tra đồng sơng Cửu Long 1.2.2 Tình hình chất lượng giống cá Tra đồng sông Cửu Long 1.2.3 Một số chương trình nghiên cứu liên quan đến cá tra 1.3 Ứng dụng di truyền phân tử vào chọn giống 10 1.3.1 Phân loại 10 1.3.2 RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) 11 1.3.3 Amplifíed Fragment Length Polymorphism (AFLP) 12 v Đồ án tốt nghiệp 1.3.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplifíed Polymorphism DNA) 13 1.3.5 Microsatellite (SSR) 13 1.4 Chỉ thị Microsatellite nghiên cứu đa dạng di truyền 14 1.4.1 Khái niệm Microsatellite 14 1.4.2 Tính chất 15 1.4.3 Sự phát triển primer Microsatellite .16 1.4.4 Giới hạn Microsatellite .16 1.4.5 Các loại Microsatellite .18 1.4.6 Cơ chế hình thành microsatellite .18 1.4.7 Nguyên tắc phát microsatellite mồi microsatellite 19 1.4.8 Ưu nhược điểm cùa microsatellite 21 1.4.8.1 Ưu điểm 21 1.4.8.2 Nhược điểm 21 1.4.9 Vai trò microsatellite 22 1.4.10 Ứng dụng microsatellite 23 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 24 2.2 Vật liệu nghiên cứu 24 2.2.1 Nguồn mẫu 24 2.2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị .24 2.2.2.1 Mồi 24 2.2.2.2 Thang .25 2.2.2.3 Các hóa chất sử dụng tách chiết DNA 26 2.2.2.4 Hóa chất sử dụng PCR 26 vi Đồ án tốt nghiệp 2.2.2.5 Hóa chất sử dụng điện di agarose 27 2.2.2.6 Dụng cụ thiết bị 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp thu bảo quản mẫu 27 2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA 28 2.3.2.1 Quy trình 28 2.3.2.2 Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết 28 2.3.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .29 2.3.3.1 Khái niệm .29 2.3.3.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 29 2.3.3.3 Các tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR 31 2.3.3.4 Ưu nhược điểm phản ứng PCR .33 2.3.3.5 Ứng dụng .33 2.3.4 Phương pháp điện di gel agarose 33 2.3.4.1 Nguyên tắc .34 2.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng 35 2.4 Bố trí thí nghiệm 37 2.4.1 Thí nghiệm 1: tách chiết DNA 38 2.4.1.1 Tách chiết DNA .38 2.4.1.2 Kiểm tra DNA tách chiết .38 2.4.2 Thí nghiệm 2: tối ưu hóa phản ứng PCR 39 2.4.2.1 Thí nghiệm 2.1: khảo sát nhiệt độ bắt cặp cặp mồi microsatellite 39 2.4.2.2 Thí nghiệm 2.2: khảo sát nồng độ MgCl2 42 vii Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.3 Thí nghiệm 2.3: khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase .42 2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính hoạt động cặp mồi microsatellite 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .45 3.1 Kết tách chiết DNA 45 3.2 Kết tối ưu hóa phản ứng PCR 46 3.2.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp cặp mồi microsatellite 46 3.2.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 53 3.2.3 Khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase 57 3.3 Khảo sát tính hoạt động cặp mồi microsatellite 58 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 4.1 Kết luận 60 4.2 Đề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µg : Microgram µl : Microlite µM : Micromol/lite mM : Milimolar (milimol/lite) AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism ALP : Amplicon Length Polymorphism AP-PCR : Arbitrary Primer-PCR bp : Base pair DAF : DNA Amplification Fingerprinting DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate EBV : Estimated Breeding Value EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid g : Gram : Hecta kb : kilobases kg : Kilogram M : Ladder DNA mA : Miliampe mM : Milimolar (milimol/lite) nu : Nucleotide PCR : Polymerase chain reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA RE : Restriction enzyme RFLP : RestrictionFragment Length Polymorphism SDS : Sodium Dodecyl Sulphate SNP : Single Nucleotide Polymorphism SSCP : Single Strand Conformation Polymorphism ix Đồ án tốt nghiệp SSR : Simple Sequence Repeat (Microsatellite) STR : short tandem repeats STS : Sequence-Taqged Sites Ta : Annealing temperature Taq DNA polymerase: Thermos aquaticus DNA polymerase TBE : Tris Borate EDTA UV : Ultra Violet - tia cực tím V : Vơn VNTR : Variable Number Tamdem Repeat x Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 2005) .11 Bảng 2.1 Thông tin 16 cặp mồi microsatellite dùng nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Các thông số điện di DNA gel agarose 36 Bảng 2.3 Gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi microsatellite 40 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt mồi CB12, CB13, CB14, CB15, CB18, CB19 .40 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt mồi Pg –13, PSP – G565, PSP – G579, PSP – G593 .41 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt mồi Ph–7, Ph–9, Ph–21, Ph–25 41 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt mồi Phy01, Phy03 .41 Bảng 2.8 Nồng độ MgCl2 khảo sát cho cặp mồi microsatellite 42 Bảng 2.9 Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát 42 Bảng 2.10 Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq polymerase cho phản ứng PCR .43 Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt cặp mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu 52 Bảng 3.2 Bảng kết tối ưu nồng độ MgCl2 12 cặp mồi 56 xi Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ cặp mồi Phy01 Từ kết hình 3.8 cho thấy sản phẩm khuếch đại gradian nhiệt độ cho sản phẩm có kích thước Vạch sản đậm dần từ đầu nhiệt độ đầu đến nhiệt độ mờ dần từ nhiệt độ tới cuối dãy gradian Trong giếng ứng với nhiệt độ bắt cặp có giếng số ứng với nhiệt độ 64,30C cho vạch sản phẩm rõ, sản phẩm phụ đẹp Nên 64,30C chọn nhiệt độ bắt mồi tốt mồi Phy01, nhiệt độ chênh lệch không lớn với nhiệt độ Ta chuẩn 660C Hình 3.9 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ cặp mồi Phy03 Từ kết hình 3.9 cho thấy sản phẩm khuếch đại gradian nhiệt độ mờ điều kiện tối ưu chưa phù hợp Vạch sản mờ dần từ đầu nhiệt độ đầu đến nhiệt độ cuối dãy gradian Riêng giếng số ứng với nhiệt độ 58,60C 600C không xuất vạch sản phẩm Giếng số ứng với nhiệt độ 52,90C vạch sản phẩm rõ, sản phẩm phụ đẹp Nên 52,90C chọn nhiệt độ bắt mồi tốt mồi Phy03, nhiệt độ chênh lệch không lớn với nhiệt độ Ta chuẩn 540C 50 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ cặp mồi Ph–7 Từ kết hình 3.10 cho thấy sản phẩm khuếch đại gradian nhiệt độ đậm Vạch sản phẩm đậm dần từ giếng 1(550C) đến giếng 8(650C) Riêng giếng số với nhiệt độ 60,70C cho vạch sản phẩm đậm, rõ sản phẩm đặc hiệu Nên 60,7oC chọn nhiệt độ bắt mồi tốt mồi Ph–7, nhiệt độ chênh lệch lớn với nhiệt độ Ta chuẩn 57,10C Hình 3.11 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ cặp mồi Ph–21 Từ kết hình 3.11 cho thấy sản phẩm khuếch đại gradian nhiệt độ mờ tất nhiệt độ bắt cặp Tuy nhiên với giếng với nhiệt độ 60,70C cho vạch sản phẩm đậm, rõ sản phẩm đặc hiệu Nên 60,70C chọn nhiệt độ bắt mồi tốt mồi Ph–21, nhiệt độ chênh lệch lớn với nhiệt độ Ta chuẩn 57,10C 51 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ cặp mồi PSP–G579 Từ kết hình 3.12 cho thấy sản phẩm khuếch đại gradian nhiệt độ cho sản phẩm tương đối nhiệt độ bắt mồi Sản phẩm khếch đại DNA nhiều, vạch sản phẩm đậm Tuy nhiên giếng số ứng với nhiệt độ 52,90C cho vạch sản phẩm rõ, sản phẩm phụ đẹp Nên 52,90C chọn nhiệt độ bắt mồi tốt mồi PSP–G579, nhiệt độ gần với nhiệt độ Ta chuẩn 54,30C Hình 3.13 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ cặp mồi Pg–13 Từ kết hình 3.13 cho thấy sản phẩm khuếch đại gradian nhiệt độ cho sản phẩm không nhiệt độ bắt mồi khác Sản phẩm khếch đại DNA có vạch đậm nhiều Tuy nhiên giếng số ứng với nhiệt độ 54,30C cho vạch sản phẩm rõ, sản phẩm phụ đẹp Nên 54,30C chọn nhiệt độ bắt mồi tốt mồi Pg–13, nhiệt độ với nhiệt độ Ta chuẩn 54,30C Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt cặp mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu 52 Đồ án tốt nghiệp Mồi CB12 CB13 CB14 CB15 CB18 CB19 Phy01 Phy03 Ta chuẩn (0C) Ta thực tế (0C) Ph- Ph- PSP- Pg- 21 G579 13 52,1 57,2 52,1 57,8 52,5 52,1 66 54 57,1 57,1 54,3 54,3 55,7 62,1 54,3 60,7 54,3 51,4 64,3 52,9 60,7 60,7 52,9 54,3 Sau tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho 16 cặp mồi microsatellite theo gradient nhiệt độ Nhiệt độ khảo sát nghiên cứu không chênh lệch mức cho phép so với nhiệt độ khảo sát tác giả công bố, điều chứng tỏ nhiệt độ mà nghiên cứu khảo sát tối ưu cho cặp mồi phù hợp với điều kiện thiết bị hóa chất nơi nghiên cứu 3.2.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 Theo kết từ nghiên cứu “Nghiên cứu thị vi vệ tinh (microsatellite) xác định huyết thống cá tra (Pagasius hypophthalmus)” tác giả Nguyễn Hữu Ninh Lưu Thị Hương Giang, năm 2012 ; nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử tạo giống thủy sản có giá trị kinh tế cao” tác giả Phạm Anh Tuấn, năm 2005 cho thấy nồng độ MgCl2 có ảnh hưởng đến phản ứng PCR Nghiên cứu tiến hành khảo sát nồng độ MgCl2 để tìm nồng độ xúc tác tốt Dựa kết nhiệt độ bắt cặp tối ưu xác định bảng 3.1 (Bảng nhiệt độ bắt cặp mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu), tiếp tục tối ưu hóa nồng độ MgCl2 cho 12 cặp mồi microsatellite Như dựa vào bảng 2.9 (Bảng nồng độ MgCl2 khảo sát cho cặp mồi microsatellite) thay tối ưu hóa nồng độ xúc tác MgCl2 tối ưu hóa thể tích xúc tác MgCl2 sau suy nồng độ tương ứng Kết tối ưu cho thấy thể tích khác MgCl2 có khả xúc tác cho phản ứng PCR với mồi để tạo sản phẩm Các kết chọn sau lần lặp lại phản ứng 53 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14 Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.15.Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi CB14 MgCl2 cặp mồi CB15 Hình 3.14 3.15 hai hình minh họa cho phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 hai cặp mồi CB14 CB15 Ở hình số 3.14, vạch sản phẩm giếng ứng với thể tích MgCl2: 1, 2; 2,5 µl tương đối khơng rõ nét, cịn giếng ứng với thể tích 1,5 µl khơng có vạch sản phẩm khếch đại, chứng tỏ nồng độ MgCl2 chưa tối ưu Điều cho thấy nồng độ MgCl2 không phù hợp cho cặp mồi microsatellite CB14 Trong giếng có vạch sản phẩm khếch đại giếng tích MgCl2 µl ứng với nồng độ 1,25 mM đậm chứng tỏ nồng độ MgCl2 1,25 mM nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite CB14 Ở hình 3.15, giếng số 3, khơng có vạch sản phẩm khếch đại nên thể tích nồng độ MgCl2 ứng với giếng không tối ưu Vạch sản phẩm khếch đại giếng số rõ nét nên thể tích MgCl2 µl tương ứng với nồng độ MgCl2 1,25 mM thích hợp cho mồi CB15 Tương tự, thực phản ứng cho mồi lại kết nồng độ MgCl2 tối ưu hình minh họa sau: 54 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.16 Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.17 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi CB12 MgCl2 cặp mồi CB13 Hình 3.18 Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.19 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi CB18 MgCl2 cặp mồi CB19 Hình 3.20 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi Phy01 55 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.21 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi Phy03 Hình 3.22 Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.23 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi Ph-7 MgCl2 cặp mồi Ph-21 Hình 3.24 Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.25 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi PSP-G579 MgCl2 cặp mồi Pg–13 Bảng 3.2 Bảng kết tối ưu nồng độ MgCl2 12 cặp mồi 56 Đồ án tốt nghiệp Mồi CB12 CB13 Thể tích MgCl (µl)/ 20 µl Nồng độ xúc tác (mM) CB14 CB15 CB18 CB19 Phy0 Phy0 Ph-7 Ph21 PSPG57 Pg13 2,.5 1,5 1 1 1 1.5 1,5 1 3,125 1.875 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,875 1,875 1,25 1,25 3.2.3 Khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase Dựa kết nhiệt độ bắt cặp tối ưu xác định bảng 3.1 (Bảng nhiệt độ bắt cặp mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu) kết nồng độ MgCl2 tối ưu xác định bảng 3.2 (Bảng kết tối ưu nồng độ MgCl2 12 cặp mồi), tiếp tục tối ưu hóa nồng độ Taq DNA polymerase để nồng độ xúc tác tốt cho phản ứng PCR Tiến hành phản ứng tối ưu hóa nồng độ Taq DNA polymerase theo nồng độ dựa vào bảng 2.10 (Bảng nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát) kết minh họa hình 3.26 Hình 3.26 Kết điện di thay đổi nồng độ Taq DNA polymerase gel Agarose 2,5 % Ở nồng độ Taq 1,25 U (giếng 1) cho tín hiệu khuếch đại yếu, có lần khơng cho kểt Lượng enzyme cần thiết phụ thuộc vào hàm lượng mẫu 57 Đồ án tốt nghiệp DNA kích thước vạch sản phẩm PCR Trên thực tế thành phần hiệu chỉnh Nhưng sử dụng nồng độ thấp (1,25 U) nhà sản xuất mà không cho kết mong muốn nên băt buộc phải tăng nồng độ enzyme lên Khi tăng nồng độ Taq DNA polymerase lên 1,5 U (giếng 2) sản phẩm khếch đại tốt Tiếp tục tăng lên 1,75 U (giếng 3) hay U (giếng 4) sản phẩm khếch đại khơng thay đổi so với 1,5 U (giếng 2) Đê tiết kiệm hóa chất mà đạt hiệu suất phản ứng PCR cao nồng độ 1,5 U Taq DNA polymerase cho tối ưu Theo số nghiên cứu nghiên cứu Kainz (2000) cho số phần tử DNA tổng số vượt gấp 30 lần số phần tư DNA polymerase thời điểm xảy bảo hịa sản phẩm khếch đại phản ứng PCR Vì khuyến cáo không nên tăng nồng độ enzyme DNA polymerase cao chất dung dịch bảo quản enzyme gây ức chế phản ứng PCR tạo lượng lớn sản phẩm không đặc hiệu khác Tuy nhiên tùy thuộc vào đặc tính enzyme hãng sản xuất Cụ thể nhà sản xuất Bioline với hướng dẫn kèm hóa chất, lượng enzyme khuyến cáo tăng giảm nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25 U đến U mà không ảnh hưởng đến phán ứng PCR 3.3 Khảo sát tính hoạt động cặp mồi microsatellite Sau có kết nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 nồng độ Taq tối ưu cho cặp mồi microsatellite, thực phản ứng PCR với mẫu DNA tách chiết từ mẫu vây cá Tra lựa chọn ngẫu nhiên Mục đích việc thực phản ứng PCR nhằm tiếp tục kiểm tra độ hoạt động cặp mồi microsatellite, đồng thời kiểm tra tính ổn định phản ứng sau tối ưu hóa để làm tảng cho khảo sát tham số di truyền quần thể cá tra thu thập tích hợp cho chương trình chọn giống Sau thực phản ứng kiểm tra độ hoạt động cặp mồi microsatellite kiểm tra tính ổn định phản ứng sau tối ưu hóa chọn cặp mồi có độ hoạt động tốt từ 12 cặp mồi tối ưu: CB13, CB14, CB15, CB19, Pg–13 Ph–7 Hình 3.27, 3.28 hình ảnh đại diện minh họa 58 Đồ án tốt nghiệp cho kết phản ứng PCR kiểm tra tính ổn định đa hình mẫu cá tra đại diện cặp mồi Hình 3.27 Sản phẩm khuếch đại mồi CB19 12 mẫu cá tra Hình 3.28 Hình kiểm tra đa hình sản phẩm khuếch đại mồi CB13, CB14, CB18, CB19, Pg-13, Ph-7 mẫu cá tra Tất cặp mồi microsatellite hoạt động tốt hầu hết mẫu cá tra phân tích (Hình 3.28) Q trình tối ưu hóa phản ứng PCR đạt kết cao, lượng sản phẩm PCR lớn, vạch sản phẩm rõ nét không tạo smear nhiều Đa số vạch DNA các mồi có đa hình,và nội vạch DNA mồi có đa hình Nghĩa mồi có tính đa hình phù hợp ứng dụng cho nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền vật liệu cá tra nghiên cứu 59 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Quá trình tách chiết DNA cá Tra với quy trình tham khảo đạt hiệu cao Lượng DNA mẫu thu nhiều, bị đứt gãy không lẫn nhiều tạp chất Kết tối ưu hóa đạt hiệu cao, phản ứng PCR với yếu tố tối ưu hóa tạo lượng sản phẩm PCR nhiều hẳn quy trình chuẩn Vạch sản phẩm PCR rõ nét khơng có nhiều sản phẩm tạp Chọn 12 cặp mồi microsatellite chọn từ 16 cặp mồi hoạt động tốt số lượng mẫu lớn Sản phẩm PCR tạo nhiều sản phẩm khơng đặc hiệu Chọn cặp mồi microsatellite có tính đa hình cao cho nghiên cứu 4.2 Đề nghị Microsatellite (SSR) thị phân tử triển vọng để phân tích đa dạng di truyền Tuy nhiên, phạm vi đề tài sử dụng số lượng cặp mồi microsatellite cịn hạn chế Do cần tiếp tục nghiên cứu, phát triển thêm nhiều cặp mồi microsatellite để đánh giá đa dạng di truyền với độ tin cậy cao hơn, phục vụ cho công tác chọn giống Cần tiến hành thí nghiệm số lượng mẫu lớn, khảo sát kết hợp thêm số cặp mồi microsatellite để có kết xác mức độ đa dạng di truyền cá Tra thu thập chương trình chọn giống Kết phân tích bước sau cần thực hệ thống điện di mao quản để tăng hiệu phân tách phân đoạn DNA microsatellite 60 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999) Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2005) Sinh học phân tử: Giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh Bùi Thị Liên Hà (2004) Bước đầu thăm dò ứng dụng số thị DNA phân tích đa dạng di truyền cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Đề tài tập sự, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh Huỳnh Quốc Khanh (2009) Thực nghiệm ương cá Tra giống (Pangasianodon Hypophthalmus) trung tâm giống thủy sản tỉnh An Giang Trường Đại Học Thủy Sản Cần Thơ Nguyễn Thị Lang (2002) Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Văn Sáng, Phạm Đình Khơi, Đinh Hùng, Vũ Hải Định (2005) Chọn giống cá tra nhằm nâng cao tỷ lệ philê: Các thông số di truyền Tuyển tập báo cáo hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ vào nuôi trồng thủy sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II: 359 – 368 Nguyễn Văn Thường (2008) Tổng quan dẫn liệu định loài cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) phân bố vùng hạ lưu sơng Mê Kong, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ(1): 84 – 89 Phạm Thành Hổ (2005) Di truyền học Nhà xuất Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh 10 Phạm Thành Hổ (2005) Nhập mơn Công nghệ sinh học Nhà xuất Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh 61 Đồ án tốt nghiệp 11 Trịnh Đình Đạt (2006) Cơng nghệ sinh học tập 4: “Cơng nghệ Di truyền” Nhà xuất Giáo dục, TP Hồ Chí Minh 12 Trương Thủ Khoa, Trần Thị Thu Hương (1993) Định loại cá nước vùng đồng sông Cửu Long Khoa thủy sản trường đại học Cần Thơ TÀI LIỆU TIẾNG ANH 13 Ferraris C.J (2007) Checklist of Catfishes, recent and fossil (Osteichthyes, Siluriformes), andcatalogue of siluriform primary types Zootaxa 1418 © 2007 Magnolis Press 14 Hayden M.J., Sharp P.J (2001) Targeted development of informative microsatellite (SSR) marker, Nucleic Acid Research, 29: e44 15 Hung L.T., Lazard J., Mariojoul C., Moreau Y (2003) Comparison of starch utilization in fingerlings of two Asian catfishes from the Mekong River (Pangasius bocourti) Sauvage, 1980,( Pangasius hypophthalmus) Sauvage, 1878 Aquaculture Nutrition 9: 215 – 222 16 Kashi Y., Hallerman E M., Soller M (1990) Marker-assisted selection of candidate bulls for progeny testing programs Animal Production 51: 63 – 74 17 Kottelat M., Vidthayanon C (1993) Boraras micros, a new genus and species of minute freshwater fish from Thailand (Teleostei: Cyprinidae) Ichthyological Exploration Freshwater (2): 161 – 176 18 Murray P.R., Jones R.N., Allen S.D (1993) Multilaboratoey evaluation of the in vitro activity of 13 beta-lactam antibioties against 1471 clinical isolatoes of aerobic and anaerobic bacteria Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 16: 191 – 203 19 Poulsen A.F., Hortle K G., Valbo-Jorgensen, Chan J.S., Chhuon C.K., Viravong S., Bouakhamvongsa K., Suntornratana U., Yoorong N., Nguyen T.T., Tran B.Q (2004) Distribution and ecology of some important riverine fish species of the Mekong River Basin MRC Technical Paper No 10 62 Đồ án tốt nghiệp 20 Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M., Vogel J., Tingey S., Rafalski A (2004) The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (Microsatellite) markers for germplasm analysis Genetics and Molecular Biology 27 (4): 579 – 588 21 Rainboth W.J (1996) Fishes of the Cambodian Mekong FAO species identification sheets for fishery purposes Food and Agriculture Organization, Rome 265p 22 Roberts T.R., Vidthayanon C (1991) Systematic revision of the asian catfish family Pangasiidae with biological observations and descriptions of three new species Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia 143: 97 – 144 23 Tautz D (1984) Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic DNA markers Nucleic Acids Research 12: 4127 – 4138 24 Vidthayanon C (1993) Taxonomic revision of the Catfish family Pangasiidae The sis sumitted to Tokyo University of Fisheries, Laboratory Aquactic Biology, Department of Aquatic Biosciences, Tokyo University of Fisheries THAM KHẢO TỪ INTERNET 25 Trí Quang, Vực dậy chất lượng cá tra giống, 7/2015 http://www.thuysanvietnam.com.vn/vuc-day-chat-luong-ca-tra-giong-article11276.tsvn 26 Lạc Long VCCI Cần Thơ, Phát triển cá Tra phải đầu tư từ giống, 7/2015 http://vnpangasius.com.vn/thong-tin/chi-tiet/308/phat-trien-ca-tra-phai-dau-tutu-giong/ 27 Thành Công, Cần nhiều ñ lực để nâng cao chất lượng cá tra giống, 7/2015 http://snnptnt.tiengiang.gov.vn/SNN/42/668/1125/81383/Tin-tuc su-kien/Cannhieu-no-luc-de-nang-cao-chat-luong-ca-tra-giong.aspx 28 Tình hình sản xuất, tiêu thụ thủy sản tháng năm 2015, 7/2015 63 Đồ án tốt nghiệp http://www.fistenet.gov.vn/thong-tin-huu-ich/thong-tin-thong-ke/thong-ke1/tinh-hinh-san-xuat-tieu-thu-thuy-san-thang-1-nam-2015/ 29 Phạm Tiến Thành, Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền quần đàn cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) có nguồn gốc tự nhiên, từ trại giống từ chương trình chọn giống Việt Nam, 7/2015 http://aquanetviet.org/post/264675/b-c-u-nh-gi-a-d-ng-di-truy-n-qu-n-n-c-trapangasianodon-hypophth 30 Nguyễn Văn Sáng, Viện nghiên cưu nuôi trồng thủy sản II, Đánh giá hiệu chọn giống cá tra, 7/2015 http://vienthuysan2.org.vn/index.php/vi/hoat-dong-nckh/Chon-giong-san-xuatgiong/Danh-gia-hieu-qua-chon-giong-ca-tra-28/ 31 http://blogtiengviet.net/media/usersd/domboy909/307.pdf 64 ... lý cá tra giống việc cần thiết Với ý nghĩa thực tiễn ý nghĩa khoa học vậy, tiến hành thực hiền đề tài ? ?Tối ưu hóa cặp mồi microsatellite phân tích đa dạng di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthamus) ”... độ bắt cặp cặp mồi microsatellite Để cho cặp mồi bắt cặp cách hoàn toàn đặc hiệu sợi DNA khn phải trì giai đoạn bắt cặp chu kỳ nhiệt nhiệt độ tối ưu cho bắt cặp mồi, gọi nhiệt độ bắt cặp (Ta)... MgCl2 cặp mồi Ph-7 56 Hình 3.23 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi Ph-21 56 Hình 3.24 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi PSP-G579 .56 Hình 3.25 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 cặp mồi