Phân lập các loài vi nấm kí sinh trên nấm linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh gây hại cây trồng của những loài có triển vọng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC LỒI VI NẤM KÍ SINH TRÊN NẤM LINH CHI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG CỦA NHỮNG LỒI CĨ TRIỂN VỌNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực MSSV: 1051110073 : NGUYỄN THÁI MINH HIẾU Lớp: 10DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu kết Đồ án trung thực Mọi thơng tin trích dẫn Đồ án ghi rõ nguồn gốc Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thái Minh Hiếu LỜI CÁM ƠN Xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để em học tập hồn thành tốt khóa học 2010 – 2014 Xin cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm Môi trường giảng dạy truyền đạt cho em kiến thức quan trọng tạo tảng kiến thức vững để hồn thành tốt Đồ án sau ứng dụng vào công việc thực tiễn Xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Thị Hai tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Và em gửi lời cảm ơn đến bạn khóa đặc biệt em Huỳnh Nhi tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần, em trải qua khó khăn suốt trình thực Đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình ln bên cạnh, cổ vũ, động viên tinh thần, tạo điều kiện để hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp Tp HCM, Ngày 31 tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thái Minh Hiếu Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC - MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nấm Linh chi 1.1.1 Phân loại (Sissi Wachtel-Galor Iris F.F.Benzie, 2011) 1.1.2 Hình thái thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001) 1.1.3 Thành phần hóa học giá trị dược liệu nấm Linh chi đỏ 1.1.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ nấm Linh chi giới Việt Nam 1.1.5 Nấm bệnh thường gặp trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005) 1.2 Giới thiệu nấm Trichoderma 12 1.2.1 Phân loại 12 1.2.2 Đặc điểm hình thái 12 1.2.3 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa (Gary J Samuels, 2004) 13 1.2.4 Cơ chế đối kháng nấm Trichoderma phòng trừ nấm gây bệnh trồng (Gary J Samuels, 2004; Gary E Harman cộng sự, 2005) 14 1.2.5 Một số nghiên cứu ứng dụng nấm Trichoderma giới Việt Nam 18 -i- Đồ án tốt nghiệp 1.3 Giới thiệu với nấm Aspergillus 20 1.3.1 Phân loại 20 1.3.2 Đặc điểm hình thái 20 1.3.3 Đặc điểm sinh lý, hóa sinh 21 1.3.4 Một số nghiên cứu ứng dụng nấm Aspergillus giới Việt Nam 22 1.4 Bệnh nấm Rhizoctonia spp gây (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 23 1.5 Bệnh nấm Fusarium spp gây (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 25 1.6 Bệnh nấm Colletotrichum spp gây 28 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 31 2.2 Vật liệu 31 2.2.1 Nguồn mẫu phân lập 31 2.2.2 Nguồn nấm bệnh 31 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 31 2.2.4 Hóa chất 32 2.2.5 Các loại môi trường 33 2.3 Nội dung nghiên cứu 33 2.4 Phương pháp nghiên cứu 34 2.4.1.Phương pháp phân lập nấm kí sinh gây bệnh nấm Linh chi (Agrios, 2005) 34 2.4.2 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) 35 - ii - Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh (Agrios, 2005) 36 2.4.4 Phương pháp khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) số chủng nấm kí sinh gây bệnh (Tơ Duy Khương, 2007) 37 2.4.5 Phương pháp khảo sát khả đối kháng nấm Trichoderma nấm bệnh gây hại trồng điều kiện in vitro (Laila Naher cộng sự, 2012) 38 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết phân lập nấm kí sinh gây bệnh nấm Linh chi 40 3.1.1 Kết phân lập nấm kí sinh nấm Linh chi 40 3.1.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm T1, T2, A1 41 3.1.3 Kết định danh đến loài chủng nấm T1, T2 A1 44 3.1.4 Kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch điều kiện in vitro 47 3.2 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào (cellulase chitinase) hai lồi Trichoderma virens Trichoderma harzianum kí sinh nấm Linh chi51 3.3 Khảo sát khả đối kháng lồi nấm Trichoderma virens Trichoderma harzianum kí sinh nấm Linh chi nấm bệnh gây hại trồng điều kiện in vitro 52 3.3.1 Khả đối kháng với nấm Fusarium sp 53 3.3.2 Khả đối kháng với nấm Rhizoctonia sp 55 3.3.3 Khả đối kháng với nấm Colletotrichum sp1 57 3.3.4 Khả đối kháng với nấm Colletotrichum sp2 59 3.3.5 Khả đối kháng với nấm Colletotrichum sp3 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 - iii - Đồ án tốt nghiệp 4.1 Kết luận 64 4.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO .66 PHỤ LỤC - iv - Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT -  CMC: Carboxymethyl cellulose ĐC: Đối chứng MSM: Minimal Synthetic Medium PGA: Potato D-Glucose Agar TN: Thí nghiệm VSV: Vi sinh vật -v- Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG -  Bảng Trang Bảng 1.1 Một số loài nấm mốc thường gặp nuôi trồng nấm 10 Bảng 2.1 Nguồn nấm Linh chi bị bệnh 31 Bảng 3.1 Tần suất xuất chủng nấm phân lập nấm Linh chi bệnh 41 Bảng 3.2 Tỷ lệ tai nấm Linh chi bị nhễm bệnh sau lây bệnh nhân tạo 48 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái T virens T harzianum phân lập ban đầu 50 Bảng 3.4 Đường kính vịng phân giải hai loài nấm Trichoderma virens Trichoderma harzianum sau ngày nuôi cấy 52 Bảng 3.5 Khả đối kháng T virens T harzianum với nấm Fusarium 54 Bảng 3.6 Khả đối kháng T virens T harzianum với nấm Rhizoctonia sp 56 Bảng 3.7 Khả đối kháng T virens T harzianum với nấm Colletotrichum sp1 58 Bảng 3.8 Khả đối kháng T virens T harzianum với nấm Colletotrichum sp2 60 Bảng 3.9 Khả đối kháng T virens T harzianum với nấm Colletotrichum sp3 62 - vi - Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH -  Hình Trang Hình 1.1 Nấm Linh chi (Gerdonama luciadum) Hình 1.2 Hình thái thể nấm Linh chi đỏ Hình 1.3 Nấm bệnh thường gặp trồng nấm Hình 1.4 Hình thái nấm Trichoderma harzianum 12 Hình 1.5 Trichoderma kí sinh nấm Pythium gây bệnh họ đậu (Nấm Trichoderma (màu vàng) công nấm Pythium (màu xanh)) 15 Hình 1.6 Trichoderma tiết enzyme chitinase kháng sinh peptaibols phân hủy vách tế bào nấm bệnh 16 Hình 1.7 Ức chế phát triển nấm Pythium ultimum chất kháng sinh tiết từ Trichoderma hazianum 17 Hình 1.8 Hệ bào tử đính giống nấm sợi Aspergillus 21 Hình 1.9 Biểu bệnh Rhizoctonia gây 25 Hình 1.10 Héo Fusarium chuối F oxysporum f.sp.cubense 26 Hình 1.11 Biểu bệnh héo vàng nấm Fuasarium spp gây cà chua 27 Hình 1.12 Biểu bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây loại trái nhiệt đới 28 Hình 1.13 Biểu bệnh thán thư nấm Colletotrichum acutatum gây trái ớt ớt 29 Hình 1.14 Biểu bệnh thán thư nấm Colletotrichum gloeosporioides gây trái long cành long 30 Hình 2.1 Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp 40 Hình 3.1 Hình thái đại thể chủng nấm T1 nuôi cấy môi trường PGA 42 Hình 3.2 Hình thái vi thể chủng nấm T1 quan sát kính hiển vi vật kính 40X 42 Hình 3.3 Hình thái đại thể chủng nấm T2 ni cấy môi trường PGA 43 - vii - Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Xuân Đồng (1982) Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam, ,tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Bùi Xuân Đồng (1984) Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam, ,tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Bùi Xuân Đồng Nguyễn Huy Văn (2000) Vi nấm dùng công nghệ sinh học, NXB Khoa học Kỹ Thuật, Hà Nội Đinh Minh Hiệp (2007) Hệ chitinase Trichoderma vai trò kiểm soát sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đơn, Nguyễn Tiến Thắng, Ngơ Kế Sương (2007) Khảo sát hoạt tính enzym chitinase, β-glucanase, cellulase, pectinase, amylase, protease chủng Trichoderma phân lập Việt Nam, Hội nghị khoa học toàn quốc "Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống", NXB Khoa học Kỹ thuật, trang 708-710 Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng cộng (2005) Điều tra khảo sát phân bố chủng nấm Trichoderma thành phố Hồ Chí Minh tỉnh Đông Nam Bộ, Đề tài cấp Bộ - Bộ Khoa học Công Nghệ Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2008) Khảo sát khả đối kháng in vitro chủng nấm Trichoderma loài nấm gây bệnh trồng (Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Phytophthora palmivora), Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập 46, số 4A, trang 93-99 Dương Minh, Lê Phước Thạnh Đào Thị Hồng Xuyến (2010), Một số sản phẩm nghiên cứu từ nấm Trichoderma có triển vọng Đại học Cần Thơ, Tạp chí Khoa học 16: 173 – 179 Huỳnh Văn Phục (2006) Khảo sát tính đối kháng nấm Trichoderma spp Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh lúa - 66 - Đồ án tốt nghiệp bắp, Khóa luận tốt nghiệp chun ngành Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Lê Duy Thắng (2001) Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập 1, NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh Lê Duy Thắng (2005) Sổ tay hướng dẫn trồng nấm, NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng (2006) Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học: Thí nghiệm vi sinh vật học, Tập 2, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng (1983) Một số sản phẩm vi nấm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2001), Công nghệ nuôi trồng nấm, tập NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đinh Lương (1982).Vi nấm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Roger Shivas Dr Dean Beasley (2005) Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật, Bảo tàng bệnh cây, Sở Nông nghiệp Thủy sản Queensland, Australia Tô Duy Khương (2007) Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật, Luận văn thạc sĩ sinh học chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP Hồ Chí Minh Vũ Triệu Mân (2007) Giáo trình Bệnh chuyên khoa, Chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội - 67 - Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI A K Mukherjee, S Kranthi, A Sampath Kumar, P K Mukherjee (2014) Original article: Biocontrol potential of three novel Trichoderma strains: isolation, evaluation and formulation, This article is published with open access at Sp.ringerlink.com Agrios G.N (2005) Plant pathology, 5th edition, Elsevier Academic Press: San Diego, California Bao X, Wang X, Dong Q, Fang J, Li X (2002) Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum, Phytochemistry Boh B, Berovic M, Zhang J, Zhi-Bin L (2007) Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds, Biotechnol Annu Rev Borchers A T, Stern J S, Hackman R M, Keen C L, Gershwin M E (1999) Minireview: Mushrooms, tumors and immunity, Proc Soc Exp Biol Med Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L and Phan H.T (2008) Diagnostic manual for plant diseases in Vietnam, ACIAR Monograph No 129, 210 pp ACIAR: Canberra Chang S T, Buswell J A (1996) Mushroom nutriceuticals, World J Microbiol Biotechnol Chang S T, Buswell J A (1999) Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P Karst (Aphyllophoromycetideae): A mushrooming medicinal mushroom, Int J Med Mushrooms Chang S T, Buswell J A (2008) Safety, quality control and regulational asp.ects relating to mushroom nutriceuticals, Mushroom Biology and Mushroom Products Chet, L, G.E.Harman, and R.Baker (1981) Trichoderma hamatum: Its hyphal interactions with Rhizoctonia solani and Pythium spp., Microb Ecol 7, pp 28 – 29 Elad and Y., I.Chet, P.Boyle and Y.Hennis (1983) Parasitism of Trichoderma - 68 - Đồ án tốt nghiệp spp on Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii scaning electron microscopy and fluorescence microscopy, Phytopathology 73: pp 85 – 88 Elad Y, Chet I, Henuls Y (1982) Degradation of plant pathogenic fungi by Trichoderma harzianum, J Can J Microbiol, 28: 719 – 725 Esp.osito E, Silva D.M (1998) Systematics and environmental application of the Genus Trichodema, Crical reviews in Microbiology 24 (2), pp 89 – 98 Francesco Vinale (2008) Trichoderma–plant–pathogen interactions Soil Biology & Biochemistry: p 1-10 Gao Y, Zhou S (2009) Cancer prevention and treatment by Ganoderma, a mushroom with medicinal properties, Food Rev Int Gary E Harman, C P Kubicek (2005) Trichoderma And Gliocladium: Enzymes, Biological Control and commercial applications, Volume 2, This edition published in the Taylor & Francis e-Library Gary J Samuels (2004) Trichoderma aguide to identification and biology, United States Department of Agriculture Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA Hadden J F and L L Black (1989) Anthranose of pepper caused by Collettotrichum spp proceeding of the international symposium on integrated management practices: Tomato and pepper production in the tropics, Asian Vegetable Research and Development Centre, Taiwan, 189 – 199 Harman G E., et al (2004) Trichoderma sp.ecies opportunistic, avirulent plant symbionts, Nat Rev Microbiol, 2(1): p 43-56 Hatvani L, et al (2012) Mushroom Green Mould Disease In Croatia, Arh Hig Rada Toksikol, 63:481-487 Holliday P (1980) Fungus diseases of tropical crops, Published by Cambrige University Press, England Hubbard, et al (1983) Phytopathology ,73:655-659 Jaw-Fen Wang (2010) Characterization of Colletotrichum spp.Characterization - 69 - Đồ án tốt nghiệp of Colletotrichum spp causing pepper anthracnose and development of resistant pepper lines, Asian Seed Congress Kim B S (2007) Country report of anthranose research in Korea, First international symposium on chi li anthranose, National hoticultural research institute, Rural development of administration republic of Korea Kimura Y, Taniguchi M, Baba K (2002) Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: Mechanism of action and isolation of an active substance, Anticancer Res L Kredics, L García Jimenez, S Naeimi, D Czifra, P Urbán, L Manczinger, L Hatvani, C Vágvölgyi and L Hatvani (2010) A challenge to mushroom growers: the green mould disease of cultivated champignons, Department of Microbiology, Faculty of Science and Informatics, University of Szeged, Közép fasor 52 H-6726 Szeged, Hungary Laila Naher, Umi Kalsom Yusuf, Shafiquzzaman Siddiquee, Jannatul Ferdous and M Aminur Rahman Effect of media on growth and antagonistic activity of selected Trichoderma strains against Ganoderma, African Journal of Microbiology Research Vol 6(48), pp 7449-7453 Lin S C (2000) Beijing, China: Chinese Agricultural Press, Medicinal Fungi of China-Production and Products Development Masanto Masyahit, Kamaruzaman Sijam, Yahya Awang and Mohd Ghazali Mohd Satar (2009) The First Report of the Occurrence of Anthracnose Disease Caused by Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc on Dragon Fruit (Hylocereus spp.) in Peninsular Malaysia, American Journal of Applied Sciences (5): 902-912 Mau J L, Lin H C, Chen C C (2001) Non-volatile components of several medicinal mushrooms, Food Res Int Mau J L, Lin H C, Chen C C (2002) Antioxidant properties of several medicinal mushrooms, J Agric Food Chem Mendoza-Mendoza A, Pozo MJ, Grzegorski D, Martínez P, García JM, Olmedo- 70 - Đồ án tốt nghiệp Monfil V, Cortés C, Kenerley C, Herrera-Estrella A (2003) Enhanced biocontrol activity of Trichoderma through inactivation of a mitogenactivated protein kinase, Proc Natl Acad Sci U S A Mukherjee PK, Latha J, Hadar R, et al (2004) Role of two G-protein alpha subunits, TgaA and TgaB, in the antagonism of plant pathogens by Trichoderma virens, Appl Environ Microbiol Pai-Feng Kao, Shwu-Huey Wang, Wei-Ting Hung, Yu-Han Liao, Chun-Mao Lin and Wen-Bin Yang (2012) Structural Characterization and Antioxidative Activity of Low-Molecular-Weights Beta-1,3-Glucan from the Residue of Extracted Ganoderma lucidum Fruiting Bodies, Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volume 2012 (2012), Article ID 673764, pages Phoulivong S, McKenzie EHC, Hyde KD (2012) Cross infection of Colletotrichum sp.ecies; a case study with tropical fruits, Current Research in Environmental & Applied Mycology 2(2), 99–111, Doi 10.5943/cream/2/2/2 Silva RN, da Silva SP., Brandão RL, Ulhoa CJ Regulation of N-acetyl-beta-Dglucosaminidase produced by Trichoderma harzianum: evidence that cAMP controls its expression, Laboratório de Enzimologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Brazil Sissi Wachtel-Galor and Iris F.F.Benzie (2011) Lingzhi Polyphorous Fungus (Ganoderma lucidum), Herbal and Traditional Medicine: Biomolecular and Clinical Asp.ects, ISBN – Master e-book TSBN Stanley Freeman, Dror Minz, Inna Kolesnik, Olga Barbul, Aida Zveibil1, Marcel Maymon, Yehuda Nitzani, Benny Kirshner, Dalia Rav-David, Alon Bilu, Arnon Dag, Sharoni Shafir and Yigal Elad (2004) Trichoderma biocontrol of Colletotrichum acutatum and Botrytis cinerea and survival in strawberry, European Journal of Plant Pathology 110: 361–370 Steve Bost (2013) Tomato Wilt Problems, Plant deseases, University of Tennessee Institute of Agriculture, U.S - 71 - Đồ án tốt nghiệp Susanne Zeilinger and Markus Omann (2007) Trichoderma Biocontrol: Signal Transduction Pathways Involved in Host Sensing and Mycoparasitism, Gene Regul Syst Bio 2007; 1: 227–234 Susanne Zeilinger, Dr Kurt Brunner, Dipl Ing Barbara Reithner, Isabel Peissl Signal transduction in host sensing and mycoparasitic resp.onse of Trichoderma atroviride The 7th International Aspergillus Meeting (2009): “Asp.erfest 7”, NH Conference Centre Leeuwenhorst, The Netherlans Upton R (2000) American Herbal Pharmacopeia and Therapeutic Compendium: Reishi Mushroom, Ganoderma lucidum, Standards of Analysis, Quality Control and Therapeutics,U.S.A Canada: Santa Cruz Weindling, R (1932) Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi, Phytopathology 22, 837-845 Zhang L, Zhang M, Chen J (2001) Solution properties of antitumor carboxymethylated derivatives of a-(1→3)-D-Glucan from Ganoderma lucidum, Chin J Polym Sci Zhang W, Tang Y J (2008) A novel three-stage light irradiation strategy in the submerged fermentation of medicinal mushroom Ganoderma lucidum for the efficient production of ganoderic acid and Ganoderma polysaccharides, Biotechnol Prog Zhou X, Lin J, Yin Y, Zhao J, Sun X, Tang K (2007) Ganodermataceae: Natural products and their related pharmacological functions, Am J Chin Med Zofia Olempska-Beer (2008) Asp.araginase from Aspergillus niger expressed in A Niger, Chemical and Technical Assessment - 72 - Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU INTERNET Cổ Đức Trọng (2012), Gía loại nấm Linh chi thị trường TP Hồ Chí Minh, Cơng ty TNHH Linh chi Vina http://linhchivina.com.vn/?frame=khoahoc&id=&p=6 Hình ảnh nấm Trichderma harzianum CBS 102174 http://www.mycobank.org/BioloMICS.asp.x?Link=T&TargetKey=14682616 000002126&Rec=4818 Nấm Linh chi Việt Nam - Nguồn gốc thực trạng http://www.linhchivietnam.net/linh-chi-viet-nam/nam-linh-chi-viet-namnguon-goc-va-thuc-trang.html Trương Mạnh Hoài (2012), Phát triển nghề trồng nấm, Báo Nhân dân http://linhchivina.com.vn/?frame=news_detail&id=382 Lê Xuân Thám cộng (2011) Nấm Linh chi Việt Nam - Dược tính vừa phát hiện, Trung tâm Hạt nhân TP Hồ Chí Minh http://www.linhchivietnam.net/linh-chi-viet-nam/nam-linh-chi-viet-namduoc-tinh-moi-nhat-vua-duoc-phat-hien.html Nghiên cứu ứng dụng nấm Trichoderma giới http://www.cabi.org/ - 73 - Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A Danh mục thành phần môi trường sử dụng nghiên cứu A.1 Mơi trường ½ Potato D-Glucose Agar (½ PGA) Thành phần (g/l): Khoai tây : 100g D-Glucose : 10g Agar : 20g Nước cất :1000ml Kháng sinh Chloramphenicol (0,01%) Môi trường dùng để phân lập nấm bệnh môi trường PGA giảm hàm lượng khoai tây đường xuống nửa có bồ sung kháng khuẩn A.2 Mơi trường Potato D-Glucose Agar (PGA) Thành phần (g/l): Khoai tây : 200g D-Glucose : : 20g Agar : 20g Nước cất :1000ml Môi trường PGA dùng để nuôi cấy, giữ giống khảo sát khả đối kháng A.3 Môi trường Minimal Synthetic Medium (MSM) Thành phần (g/l): MgSO4.7H2O : 0,2g MnSO4 : 0,002g K2HPO4 : 0,9g ZnSO4 : 0,002g KCl : 0,2g Cơ chất : 10g NH4NO3 : 1g Agar : 20g FeSO4.7H2O : 0,002g Đệm phosphate 50mM , pH = 6,3 -1- Đồ án tốt nghiệp Cơ chất để khảo sát hoạt tính enzyme cellulase chitinase CMC huyền phù chitin với thuốc thử lugol Phụ lục B Bảng số liệu B.1 Đường kính (mm) vịng phân giải CMC chitin sau ngày ni cấy Lần lặp Chủng lại Đường kính Đường kính vịng phân giải CMC vòng phân giải chitin 23 50 25 49 22 48 20 47 23 48 24 47 30 50 28 52 T 29 52 harzianum 28 53 29 53 28 54 T virens B.2 Trung bình Đường kính (mm) vịng phân giải CMC chitin sau ngày nuôi cấy Summary Statistics for Vong phan giai Chitin Trichoderma T harzianum Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimum 52.3333 1.36626 2.61069% 50.0 Maximum 54.0 Range Stnd skewness 4.0 -0.888766 T virens Total 12 48.1667 50.25 50.0 54.0 3.0 7.0 Summary Statistics for Vong phan giai CMC Trichoderma Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimum Maximum Range Stnd skewness T harzianum 28.6667 0.816497 2.84824% 28.0 30.0 2.0 0.857321 T virens 22.8333 1.7224 7.54336% 20.0 25.0 5.0 -0.678436 Total 12 25.75 3.30633 12.8401% 20.0 30.0 10.0 -0.472192 1.16905 2.49089 2.42708% 4.957% -2- 47.0 47.0 0.667628 0.116046 Đồ án tốt nghiệp B.3 Đường kính tản nấm Fusarium sp đĩa đối kháng đối chứng qua ngày nuôi cấy đối kháng Lần nhắc Công thức Lặp Lần Lần Lần Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy lại 7 42 42 42 40 40 40 40 40 40 42 42 42 39 39 39 43 43 43 41 41 41 41 41 41 42 42 T 41 41 41 40 40 40 40 40 40 harzianum 40 40 40 39 39 39 42 42 42 42 42 42 41 41 41 41 41 41 45 71 90 46 69 90 44 71 90 43 72 90 45 70 90 43 69 90 45 77 90 45 70 90 46 72 90 T virens Đối chứng 42 B.4 Trung bình tỷ lệ (%) đối kháng T virens T harzianum với nấm Fusarium sp qua ngày nuôi cấy Summary Statistics for Ty le doi khang Fusarium Tri Fu Count Average Standard Coeff of variation Minimum Maximum Range Stnd skewness deviation Har-Fu 8.95522 2.23881 25.0% 5.97015 12.6866 6.71642 0.131223 Har-Fu 42.9017 1.40406 3.27273% 41.0296 45.2418 4.21217 0.131223 Har-Fu 54.8148 1.11111 2.02703% 53.3333 56.6667 3.33333 0.131223 Vi-Fu 7.9602 2.84171 35.6989% 3.73134 12.6866 8.95522 0.318465 Vi-Fu 42.2777 1.78216 4.21537% 39.6256 45.2418 5.61622 0.318465 Vi-Fu 54.321 1.41033 2.59629% 52.2222 56.6667 4.44444 0.318465 Total 54 35.2051 19.8041 56.2534% 3.73134 56.6667 52.9353 -1.61012 -3- Đồ án tốt nghiệp B.5 Đường kính tản nấm Rihzoctonia sp đĩa đối kháng đối chứng qua ngày nuôi cấy đối kháng Lần nhắc Công thức Lặp Lần Lần Lần Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy lại 7 40 40 40 39 39 39 40 40 40 39 39 39 40 40 40 38 38 38 38 38 38 41 41 41 40 40 40 T 42 42 42 40 40 40 41 41 41 harzianum 43 43 43 42 42 42 43 43 43 45 45 45 42 42 42 40 40 40 47 80 90 44 80 90 45 80 90 45 79 90 47 79 90 46 81 90 46 78 90 44 81 90 45 80 90 T virens Đối chứng B.6 Trung bình tỷ lệ (%) đối kháng T virens T harzianum với nấm Rihzoctonia sp qua ngày nuôi cấy Summary Statistics for Ty le doi khang Rihzoctonia Tri Ri Count Average Standard Coeff of variation Minimum Maximum Range Stnd skewness deviation Vi-Ri 13.2029 2.23084 16.8966% 9.77995 16.3814 6.60147 0.331173 Vi-Ri 50.5571 1.27077 2.51354% 48.6072 52.3677 3.76045 0.331173 Vi-Ri 56.1728 1.12644 2.00531% 54.4444 57.7778 3.33333 0.331173 Har-Ri 7.57946 3.47928 45.904% 0.977995 11.9804 11.0024 -0.597546 Har-Ri 47.3538 1.98193 4.18537% 43.5933 49.8607 6.26741 -0.597546 Har-Ri 53.3333 1.75682 3.29404% 50.0 55.5556 5.55556 -0.597546 Total 38.0332 20.0816 52.8001% 0.977995 57.7778 56.7998 -2.10466 54 -4- Đồ án tốt nghiệp B.7 Đường kính tản nấm Colletotrichum sp1 đĩa đối kháng đối chứng qua ngày nuôi cấy đối kháng Lần nhắc Công thức Lặp Lần Lần Lần Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy lại 7 44 44 44 46 46 46 43 43 43 45 45 45 45 45 45 43 43 43 44 44 44 46 46 46 44 44 44 T 37 37 37 39 39 39 40 40 40 harzianum 40 40 40 38 38 38 42 42 42 42 42 42 39 39 39 41 41 41 43 70 90 45 70 90 44 71 90 43 69 90 45 72 90 46 70 90 44 71 90 45 72 90 45 70 90 T virens Đối chứng B.8 Trung bình tỷ lệ (%) đối kháng T virens T harzianum với nấm colletotrichum sp1 qua ngày nuôi cấy Summary Statistics for Ty le doi khang Collettotrichum1 Tri Col Count Average Standard Coeff of deviation variation Minimum Maximum Range Stnd skewness Vi-Col1 0.497512 2.53072 508.675% -2.98507 3.73134 6.71642 -0.215349 Vi-Col1 37.0079 1.60213 4.32915% 34.8031 39.0551 4.25197 -0.215349 Vi-Col1 50.6173 1.25599 2.48134% 48.8889 52.2222 3.33333 -0.215349 Har-Col1 10.9453 3.84165 35.0987% 5.97015 17.1642 11.194 Har-Col1 43.622 2.43204 5.57525% 40.4724 47.5591 7.08661 0.163527 Har-Col1 55.8025 1.9066 3.41669% 53.3333 58.8889 5.55556 0.163527 Total 33.0821 20.7395 62.6912% -2.98507 58.8889 61.874 54 -5- 0.163527 -1.66222 Đồ án tốt nghiệp B.9 Đường kính tản nấm Colletotrichum sp2 đĩa đối kháng đối chứng qua ngày nuôi cấy đối kháng Lần nhắc Công thức Lặp Lần Lần Lần Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy lại 7 37 37 37 40 40 40 41 41 41 38 38 38 37 37 37 40 40 40 42 42 42 39 39 39 38 38 38 T 33 33 33 34 34 34 33 33 33 harzianum 35 35 35 35 35 35 34 34 34 37 37 37 37 37 37 35 35 35 43 65 84 44 65 87 41 65 84 43 64 85 43 66 88 42 65 83 42 64 85 45 64 86 42 66 86 T virens Đối chứng B.10 Trung bình tỷ lệ (%) đối kháng T virens T harzianum với nấm colletotrichum sp2 qua ngày nuôi cấy Summary Statistics for Ty le doi khang Colletotrichum2 Tri Col2 Count Average Standard Coeff of variation Minimum Maximum Range Stnd skewness deviation Vi-Col2 8.57143 4.12325 48.1046% 1.81818 13.5065 11.6883 -0.383495 Vi-Col2 39.726 2.71824 6.84246% 35.274 42.9795 7.70548 -0.383495 Vi-Col2 54.1667 2.06699 3.81599% 50.7813 56.6406 5.85938 -0.383495 Har-Col2 18.7013 3.46293 18.5171% 13.5065 22.8571 9.35065 -0.593538 Har-Col2 46.4041 2.28293 4.91966% 42.9795 49.1438 6.16438 -0.593538 Har-Col2 59.2448 1.73598 2.93017% 56.6406 61.3281 4.6875 Total 37.8024 18.7396 49.5724% 1.81818 61.3281 59.5099 -1.48897 54 -6- -0.593538 Đồ án tốt nghiệp B.11 Đường kính tản nấm Colletotrichum sp3 đĩa đối kháng đối chứng qua ngày nuôi cấy đối kháng Lần nhắc Công thức Lặp Lần Lần Lần Ngày sau cấy Ngày sau cấy Ngày sau cấy lại 7 40 40 40 39 39 39 39 39 39 38 38 38 40 40 40 38 38 38 38 38 38 37 37 37 38 38 38 T 39 39 39 40 40 40 41 41 41 harzianum 38 38 38 38 38 38 40 40 40 40 40 40 39 39 39 41 41 41 40 74 86 41 63 88 44 68 86 42 66 87 44 70 88 45 65 88 43 64 86 43 70 85 42 69 86 T virens Đối chứng B.12 Tỷ lệ (%) đối kháng T virens T harzianum với nấm colletotrichum sp3 qua ngày nuôi cấy Summary Statistics for Ty le doi khang Colletotrichum3 Tri Col3 Count Average Standard Coeff of variation Minimum Maximum Range Stnd skewness deviation Vi-Col3 9.63542 2.37608 24.6598% 6.25 13.2813 7.03125 -0.331173 Vi-Col3 43.0213 1.49822 3.4825% 40.8867 45.3202 4.4335 Vi-Col3 55.4557 1.17126 2.11207% 53.7869 57.2529 3.46598 -0.331173 Har-Col3 7.29167 2.64935 36.3339% 3.90625 10.9375 7.03125 0.215349 Har-Col3 41.5435 1.67052 4.02114% 39.4089 43.8424 4.4335 Har-Col3 54.3004 1.30597 2.40508% 52.6316 56.0976 3.46598 0.215349 Total 35.208 56.465% 3.90625 57.2529 53.3466 -1.55807 54 19.8802 -7- -0.331173 0.215349 ... vi nấm kí sinh nấm Linh chi đánh giá khả đối kháng nấm bệnh gây hại trồng lồi có triển vọng? ?? Mục đích nghiên cứu Phân lập định danh đến lồi vi nấm kí sinh gây bệnh nấm Linh chi Tuyển chọn lồi vi. .. chọn lồi vi nấm có triển vọng ứng dụng kháng nấm bệnh hại trồng Mục tiêu nghiên cứu − Phân lập nấm kí sinh gây bệnh nấm Linh chi định danh đến loài chủng nấm phân lập − Khảo sát khả sinh enzyme... − Phân lập nấm kí sinh gây bệnh nấm Linh chi định danh đến loài chủng nấm phân lập − Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase ) số chủng nấm kí sinh gây bệnh − Khảo sát khả đối