Nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh care ở chó nuôi tại hà nội và chế kháng thể phòng trị bệnh TT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH CARE Ở CHÓ NI TẠI HÀ NỘI VÀ CHẾ KHÁNG THỂ PHỊNG TRỊ BỆNH Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã sớ : 64 01 02 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hữu Nam PGS.TS Phạm Ngọc Thạch Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: PGS.TS Cù Hữu Phú Hội Thú y Phản biện 3: PGS.TS Lại Thị Lan Hương Học viện Nông nghiệp Việt Nam Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 24 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh Sài sốt chó (Canine Distemper) hay Care bệnh nguy hiểm phổ biến chó Bệnh phân bố nhiều quốc gia giới gây bệnh hầu hết loại thú ăn thịt chồn, cáo, hổ, báo, sư tử, Do đó, bệnh tổ chức thú y giới (OIE) quan tâm cập nhật tình hình năm qua Ở Việt Nam, bệnh Care phát từ năm 1920 Chó mắc bệnh thường chết với tỷ lệ cao, lên đến 100% không điều trị kịp thời Trong năm gần đây, phong trào ni chó cảnh nước ta tăng nhanh khiến số lượng chó giống ngoại nhập tăng lên đáng kể Các giống chó ngoại phổ biến nước ta thường giống có kích thước lớn Bergie, Alaska,… số giống chó nhỏ Phốc, Poodle, Corgi hay Pomeranian Theo đó, nguy bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lây lan Care bùng phát tăng lên Tuy vậy, nghiên cứu đặc điểm bệnh Care cịn hạn chế Thơng tin tỷ lệ chó mắc bệnh Care, đặc điểm lưu hành phân bố bệnh chưa thống kê đầy đủ khu vực Hà Nội Chúng tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm xác định lưu hành bệnh Care khu vực nội thành Hà Nội làm sở khoa học cho việc phòng trị bệnh, tìm yếu tố nguy liên quan đến bệnh Đồng thời nghiên cứu chế tạo chế phẩm kháng thể kháng virus Care để điều trị bệnh Care cho chó mắc bệnh đạt hiệu cao 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Hoàn thiện nghiên cứu đặc điểm bệnh Care địa bàn Hà Nội Với mục đích mơ tả bệnh phân bố bệnh ảnh hưởng thời tiết mùa vụ, lứa tuổi chó Đồng thời xác định tỷ lệ nhiễm bệnh giống chó nội chó ngoại nhập Đồng thời nghiên cứu chế tạo kháng thể Care từ chủng virus thực địa, xác định liều điều trị cho chó mắc bệnh Xây dựng phác đồ điều trị thử nghiệm bệnh Care cho giai đoạn bệnh Phục vụ cho cơng tác phịng trị bệnh có hiệu cao 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: - Chó mắc bệnh tự nhiên mang đến khám điều trị hệ thống Bệnh viện thú cảnh Công ty Hanvet Hà Nội, Bệnh viện Thú y Petheath, Bệnh viện Thú y Hải Đăng, Phòng khám Thú y Hà Nội; Bao gồm tất giống chó nội chó ngoại lứa tuổi năm liên tục (từ tháng 1/2013 tới tháng 12/2018) Thông tin thời gian khám, giống, lứa tuổi, lịch tiêm phòng ghi chép đầy đủ chi tiết - Chó từ tháng tuổi ni thí nghiệm trung tâm nghiên cứu cơng ty Hanvet; nuôi trại thực nghiệm Khoa Thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Thỏ từ tháng tuổi ni thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu Công ty Hanvet * Địa điểm nghiên cứu: + Phịng Thí nghiệm Trung tâm Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam + Phịng Thí nghiệm Bộ mơn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam + Trung tâm Nghiên cứu Sinh phẩm, Công ty cổ phần Dược Hanvet + Bệnh viện Thú cảnh Hanvet - Công ty Dược Hanvet * Thời gian nghiên cứu: - Thời gian tiến hành đề tài luận án từ tháng 6/2014 - tháng 12/ 2018 - Số liệu đề tài thu thập từ tháng 01/2013 đến tháng 12/2018 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm bệnh Care đàn chó nuôi Hà Nội giai đoạn tháng năm 2013 đến tháng 12 năm 2018; - Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care từ chủng virus nhược độc lưu giữ Trung tâm Nghiên cứu Sinh phẩm - Công ty Hanvet; - Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm điều trị thử nghiệm kháng thể kháng virus Care trại thực nghiêm khoa thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Ứng dụng điều trị thử nghiệm kháng thể kháng virus Care Bệnh Viện Thú Cảnh Hanvet 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây cơng trình nghiên cứu hồn chỉnh có hệ thống bệnh Care chó khu vực Hà Nội Kết khảo sát thực trạng bệnh Care, đánh giá mô tả đặc điểm bệnh tất giống chó, lứa tuổi chó, mùa vụ mắc bệnh Bên cạnh xây dựng quy trình chế tạo kháng thể kháng virus Care chủng phân lập Việt Nam chữa bệnh cho chó đạt hiệu cao 1.5.Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu sở cho việc hiểu biết rõ đặc điểm bệnh Care (CDV) Việt Nam Đây tư liệu khoa học có giá trị cho nghiên cứu bệnh Care nghiên cứu vaccine phòng bệnh Luận án tài liệu tham khảo tốt phục vụ nghiên cứu khoa học tư liệu tham khảo dùng giảng dạy chuyên ngành thú y Là tài liệu cần thiết cho người làm công tác thú y thực hành Bệnh viện Thú y Phòng khám thú y 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề tài sở khoa học để đưa biện pháp phòng chống bệnh Care chó Từ khuyến cáo người ni chó sử dụng vaccine Care phù hợp theo lứa tuổi Kết nghiên cứu đưa sản phẩm kháng thể kháng virus Care để phòng trị bệnh, đồng thời xây dựng phác đồ điều trị hiệu đàn chó mắc bệnh Care PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE 2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care giới Care bệnh truyền nhiễm cấp tính chó Canine distemper virus (CDV) gây Bệnh lây lan nhanh, xảy lứa tuổi chủ yếu chó non với các triệu chứng sốt, viêm phổi, viêm ruột cuối thường có hội chứng thần kinh (Greene & cs., 2006; Appel & cs., 1978) Đặc biệt bệnh gây chết với tỷ lệ cao Bệnh Care báo cáo lần châu Âu vào năm 1760 (Appel Max Jg & cs., 1972) Bệnh xuất số nước châu Á Nam Mỹ từ kỷ 18 (Timothy, 2008; Woma & cs., 2009) Các triệu chứng lâm sàng tiến triển bệnh mô tả từ năm 1809 Edward Jenner (Shell, 1990) Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp Henri Carré phân lập virus Care từ nước mũi chó bị bệnh Sau năm 1923, Putoni lần chế vắc xin nhược độc, nhiên virus vắc xin độc tính cịn cao Từ năm 1948 sau, với phát triển mạnh mẽ virus học, nhiều vắc xin phịng bệnh Care có hiệu đời Hiện bệnh có khắp nơi giới, khơng xảy chó ni mà cịn nhiều quần thể động vật hoang dã Bệnh Care thường thấy châu Á Dịch bệnh diễn vùng khác Nhật Bản Lan NT & cs (2006), Thái Lan Keawcharoen & cs (2005), Hàn Quốc An & cs (2008) Ấn Độ Latha & cs (2007) 2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Care Việt Nam Bệnh Care phát Việt Nam từ năm 1920 Nghiên cứu Hồ Đình Chúc (1993) thời kỳ ủ bệnh Care thường - ngày (dài 17 - 21 ngày) kéo dài khoảng thời gian tháng Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ 50 - 80%, chí lên đến 100% không điều trị kịp thời Cho đến nay, bệnh xảy hầu hết tỉnh gây thiệt hại lớn tỷ lệ tử vong bệnh cao (Lê Thị Tài, 2006) Tất lồi chó cảm thụ bệnh, mẫn cảm lồi chó lai, chó cảnh, chó nội mẫn cảm (Tơ Du & Xuân Giao, 2006) Trong nghiên cứu Lan & cs (2009), hai chủng virus Care Vn86 Vn99 phân lập từ chó tháng tuổi có đặc điểm viêm não khơng mưng mủ, viêm phổi, suy giảm tế bào lympho viêm dày ruột Kết phân tích sinh học phân tử chủng phân lập thuộc nhóm cổ điển (Classic type), khác xa với nhóm Asia Asia Theo Trần Văn Nên & cs (2017), vắc xin vô hoạt Care chế từ chủng CDVVNUA-768 đánh giá có khả bảo hộ chó cơng cường độc với chủng CDV-HUA-04H Thí nghiệm tiêm vắc xin vô hoạt Care chế từ chủng CDV-VNUA-768 cho chó becgie tuần tuổi, sau tuần cơng cường độc chủng virus CDV-HUA-04H Đáp ứng miễn dịch kháng thể chó thí nghiệm sau tiêm vắc xin vô hoạt Care gây khảo sát phản ứng ELISA phát kháng thể 2.2 BỆNH CARE TRÊN CHÓ 2.2.1 Dịch tễ học Trong tự nhiên giống chó cảm thụ, mẫn cảm chó nhập ngoại, chó nhập nội mắc Trần Thanh Phong (1996) Ngồi cáo, cầy loài động vật ăn thịt khác mắc, đặc biệt lồi chồn vơ mẫn cảm, thú ăn thịt biển có vầy mắc Trong phịng thí nghiệm tốt dùng chồn đen Ngồi dùng chuột lang, thỏ, chuột nhắt trắng, khỉ Trong tự nhiên hầu hết chó từ đến 12 tháng tuổi mắc bệnh, tỷ lệ mắc bệnh nhiều chó từ đến tháng tuổi Những chó bú mẹ mắc miễn dịch thụ động qua sữa đầu Việc gây bệnh thực nghiệm chó tháng tuổi dễ chó tuần tuổi chó tuần tuổi có miễn dịch thụ động thu nhận từ mẹ Tô Du & Xuân Giao (2006), nghiên cứu dịch tễ bệnh Care cho tất lồi chó cảm thụ bệnh, mẫn cảm chó lai chó ngoại nhập, chó nội mẫn cảm Bệnh xuất nhiều có thay đổi thời tiết đặc biệt vào ngày mưa 2.2.2 Cơ chế sinh bệnh Thời kỳ ủ bệnh Care thường từ 3-6 ngày (dài 17-21 ngày) kéo dài khoảng tháng Bệnh có tỷ lệ chết từ 50-80%, chí 100% khơng phát điều trị sớm Hồ Đình Chúc (1993) Lúc bệnh phát dạng kế phát (thường kết hợp bệnh pavovirus, viêm gan truyền nhiễm) tỷ lệ chết bệnh cao Tô Du & Xuân Giao (2006) Theo Trần Thanh Phong (1996), sau virus xâm nhập vào thể qua đường mũi, miệng nhân lên đại thực bào tế bào lympho đường hơ hấp, vịng 24 virus dã tới hạch lympho phổi Vào ngày thứ virus di cư tới lách, dày, ruột non gan Vào thời điểm chó bắt đầu sốt 2.2.3 Đặc Điểm Bệnh Lý 2.2.3.1 Triệu chứng Theo Trần Văn Nên & cs (2017), biểu bệnh thường đa dạng phụ thuộc vào tuổi chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khỏe, chế độ chăm sóc ni dưỡng độc lực mầm bệnh Đầu tiên chó xuất triệu chứng chung: mệt mỏi, ủ rũ, ăn ít, lười vận động, chảy nước mắt, nước mũi, nơn mửa, sau sốt, thân nhiệt lên đến 40-41,5°C kéo dài từ 24-26 thân nhiệt giảm xuống 38,5-39,5ºC lúc chó ăn ít, mệt mỏi 3-4 ngày sau xuất sốt thứ hai, có bội nhiễm vi khuẩn kế phát, sốt kéo dài 3-4 ngày, lúc bệnh trầm trọng hơn, không độc lực virus mà số lượng độc lực vi khuẩn bội nhiễm xuất với sốt thứ hai, chó bắt đầu biểu triệu chứng đường hơ hấp, tiêu hóa, da thần kinh 2.2.3.2 Bệnh tích Theo Appel Max Jg & Summers (1995), bệnh tích đại thể gặp sừng hoá mõm gan bàn chân Tuỳ theo mức độ kế phát vi khuẩn thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột, mụn mủ da v.v Bệnh tích đường tiêu hóa: Viêm cata ruột, lt ruột, hạch ruột sưng, gan thối hóa mỡ Đường hơ hấp: Viêm mũi, quản, khí quản, viêm phổi, có mụn mủ phổi, có vỡ gây viêm phế mạc Thần kinh: Viêm não, não tụ máu, tế bào thần kinh bị hoại tử Tế bào thượng bì đường hơ hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch tuyến nước bọt tìm thấy tiểu thể lenst nguyên sinh chất PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1.1 Nghiên cứu số đặc điểm bệnh Care chó Hà Nội - Đánh giá tình hình nhiễm bệnh Care chó ni khu vực Hà Nội - Xác định tỷ lệ mắc bệnh care giống chó nội chó ngoại nhập - Xác định lứa tuổi mắc bệnh, mùa vụ mắc bệnh - Các yếu tố nguy mắc bệnh - Mô tả số đặc điểm bệnh tích đại thể vi thể chó mắc bệnh Care 3.1.2 Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care - Nghiên cứu quy trình chế tạo kháng thể Care + Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể + Nghiên cứu xác định độ tuổi động vật sử dụng chế tạo kháng thể + Nghiên cứu xác định quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể + Xây dựng quy trình sơ chế tạo kháng thể - Chế tạo thử nghiệm kháng thể Care quy mô Pilot 3.1.3 Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm điều trị thử nghiệm bệnh Care kháng thể kháng virus Care - Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm - Nghiên cứu điều trị thử nghiệm kháng thể Care phòng trị bệnh 3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1 Trang thiết bị dụng cụ - Dụng cụ, vật phẩm lấy mẫu xét nghiệm: tăm vô trùng, túi vô trùng đựng bệnh phẩm, nhãn ghi tên… - Trang bị bảo hộ cho người khám, thu mẫu bệnh phẩm: găng tay, trang, áo blouse - Máy móc, thiết bị cần thiết: Tủ ấm CO2, tủ ấm thường, tủ ấp trứng, loại tủ lạnh, máy đo pH, máy khuấy từ, máy Elisa, máy PCR, kính hiển vi loại, pipetman loại - Ngồi cịn có dụng cụ thơng thường phục vụ cho sản xuất vacxin ống Valcol 15ml 50ml Ống eppendorf 1,5 ml.ống nghiệm, bình tam giác (250,500,1000ml) Đĩa pettri, dầu Tip loại, dĩa 96 giếng, Pank, kéo 3.2.2 Vật liệu hóa chất * Vật liệu hóa chất: - Chó mắc bệnh Care lứa tuổi mang tới khám Bệnh viện thú y, phịng khám thú y Hà Nội - Chó tháng tuổi khỏe mạnh chưa tiêm phòng vắcxin - Thỏ 2-4 tháng tuổi khỏe mạnh không mắc bệnh truyền nhiễm - Test chẩn đoán nhanh bệnh Care CDV Ag (Asan Pharmaceutical Co., LTD; Hàn Quốc) - Các chủng virus CDV-Hanvet cường độc phân lập từ mẫu bệnh phẩm chó mắc bệnh Care tự nhiên, lưu giữ trung tâm nghiên cứu sinh phẩm công Ty Hanvet - Do công ty Hanvet cung cấp - Chủng virus Care nhược độc lưu giữ Trung tâm nghiên cứu sinh phẩm - công ty Hanvet - Chủng virus CDV-HV cường độc phân lập Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Các loại môi trường kiểm tra vô trùng: thạch máu, TSB nước thịt gan yếm khí nhập từ hãng uy tín - Mơi trường ni tế bào, gây nhiễm virus, dung dịch đếm số: MEM, M199, DMEM, LH3E, EMEM, FBS, BS, CMF Hank, TE 0.025% - Sinh phẩm, hóa chất cần thiết từ nhiều cơng ty uy tín Meck, Sigma, Oxoid, Idexx Dùng cho trình gây nhiễm virus * Số liệu phần mềm - Số liệu thu thập về: chó mắc bệnh Care chó bị chết bệnh Care bệnh viện thú cảnh công ty Hanvet số phòng khám thú y, Bệnh viện thú y địa bàn nghiên cứu - Phần mềm sử dụng xử lý số liệu Excel 2007 Minitab 16.0 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phương pháp nghiên cứu số đặc điểm bệnh Care 3.3.1.1 Phương pháp điều tra phát bệnh Điều tra phát bệnh dựa vào thống kê hồ sơ bệnh án, mô tả bệnh, thống kê sinh học, phương pháp hồi cứu phương pháp cắt ngang (điều tra theo dõi vấn chủ vật nuôi, kết hợp theo dõi quan sát trực tiếp) Cụ thể sau: * Phương pháp xác định chó mắc bệnh Care Xác định chó bệnh dựa vào lịch tiêm phòng vacxin, triệu chứng lâm sàng đặc trưng bệnh, bệnh tích điển tác giả (Appel Max Jg & cs., 1994; Frölich & cs., 2000; Martella & cs., 2002); (Trần Văn Nên & cs., 2017) mô tả Mặt khác, phịng thí nghiệm, test chẩn đốn nhanh dùng để xác định bệnh chó có triệu chứng bệnh Care điển hình Những trường hợp chó có triệu chứng bệnh Care điển hình chẩn đốn test chẩn đốn nhanh cho kết âm tính chúng tơi tiến hành chẩn đốn phản ứng RT- PCR để loại trừ Tất chó bị bệnh lứa tuổi mùa năm, đưa đến khám Bệnh Viện Thú cảnh công ty Hanvet, Bệnh viện thú y Petheath, Bệnh viện thú y Hải Đăng, Bệnh viện thú vet Hà Nội tiến hành kiểm tra thăm hỏi bệnh từ chủ vật nuôi khám lâm sàng Trong nghiên cứu thực nội dung theo bước: Lập bệnh án theo dõi điều trị; Lấy mẫu làm test chẩn đốn nhanh; Thống kê tổng số chó mang đến số chó mắc bệnh Care * Phương pháp chẩn đoán bệnh Care test CDV Ag Dựa kết khám lâm sàng sau dùng Test thử CDV Ag để xác định bệnh: Lấy mẫu chẩn đoán nhanh bệnh Care test CDV Ag (ASAN PHARMACEUTICAL CO., LTD; Hàn Quốc) theo hướng dẫn nhà cung cấp 3.3.1.2 Phương pháp kiểm tra bệnh tích đại thể vi thể chó bị bệnh Care Mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể chó gây nhiễm theo tiêu chuẩn TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Cơng nghệ, 2010) Mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể chó chết nghi mắc bệnh Care qua chẩn đoán lâm sàng test thử CDV Ag có kết dương tính với virus Care Sau lấy mẫu quan: Não, hạch ruột, ruột non, ruột già, phổi, hạch phổi… ngâm formol 10% để làm tiêu kiểm tra biến đổi bệnh lý vi thể 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu chế tạo kháng thể Care 3.3.2.1 Thiết kế thí nghiệm a Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể Trong nghiên cứu này, hai đối tượng vật nuôi sử dụng để gây tối miễn dịch chó thỏ Nhóm gồm chó 02 tháng tuổi, giống Becgie lai, khỏe mạnh Số lượng 05 Nhóm gồm thỏ 02 tháng tuổi, giống Newzealand, khỏe mạnh Số lượng 05 Chó âm tính với kháng thể Care, Thỏ âm tính với virus gây xuất huyết thỏ Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc công ty Hanvet, có hiệu giá 104.0TCID 50/ml để gây miễn dịch cách tiêm da b Nghiên cứu chọn độ tuổi động vật sử dụng để tối miễn dịch thu kháng thể kháng virus Care Động vật sử dụng chó thỏ Sử dụng 15 động vật khỏe mạnh chia làm nhóm: + Nhóm 1: 05 02 tháng tuổi; + Nhóm 2: 05 03 tháng tuổi; + Nhóm 3: 05 04 tháng tuổi ‐ Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc công ty Hanvet, có hiệu giá 10 TCID 50/ml để tiêm động vật nhằm mục đích tạo kháng thể c Nghiên cứu quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể kháng virus Care ‐ Sau lựa chọn đối tượng độ tuổi động vật phù hợp, tiến hành nghiên cứu quy trình tối miễn dịch khác để nhằm tìm quy trình miễn dịch cho hiệu giá kháng thể tốt Sử dụng 15 động khỏe mạnh chia làm nhóm, miễn dịch với 03 quy trình khác 3.3.2.2 Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể phản ứng Elisa Các bước thực phản ứng Elisa theo kít ELISA INGEZIM MOQUILLO IgG Prod Ref: 15.CDG.K1 3.3.2.3 Phương pháp định lượng kháng thể kháng virus Care phản ứng trung hịa ‐ Huyết pha lỗng môi trường nuôi cấy tế bào theo số 10 số 2: huyết dương huyết âm, thao tác pha đĩa 96 giếng; ‐ Virus pha môi trường nuôi cấy tế bào 100 TCID50/50 µl liều trung hịa: nhỏ vào giếng thí nghiệm 50 µl; ‐ Điều kiện trung hịa 370C /1 giờ/ 5%C02 (20 phút láng lần); ‐ Nuôi đĩa phản ứng 370C /1 / 5%C02; ‐ Đọc kết hàng ngày: ngày thứ CPE bắt đầu xuất hiện: tế bào vỡ vụn thành mảnh nhỏ li ti, ngày thứ CPE rõ tế bào bị phá hủy giếng, ngày thứ đọc kết luận 3.3.2.4 Phương pháp kiểm nghiệm kháng thể Care * Kiểm nghiệm tiêu vô trùng khiết Phương pháp kiểm nghiệm tiêu vô trùng khiết thực theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8684:2011 * Kiểm nghiệm tiêu an toàn Kháng thể tiêm với liều gấp 05 lần 10 lần thỏ chó Sau 10 ngày liên tục theo dõi biểu lâm sàng Nếu chó thỏ khơng có biểu gì, mức độ ăn, uống thể trạng bình thường kháng thể coi đạt yêu cầu tiêu an toàn * Kiểm nghiệm tiêu hiệu lực Chỉ tiêu hiệu lực đánh giá gián tiếp qua kiểm tra hàm lượng kháng thể phương pháp ELISA phản ứng trung hòa 3.3.3 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm điều trị thực nghiệm 3.3.3.1 Thiết kế thí nghiệm Động vật thí nghiệm gồm 20 con, chó tháng tuổi có trọng lượng từ 2- kg/con Chó thí nghiệm chọn chó khơng mắc virus Care virus khác (bệnh Parvovirus, bệnh viêm gan chó ) khơng có kháng thể kháng virus Care 4.0 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo dõi khu vực Hà Nội có xu hướng giảm dần năm qua Điều hiểu biết điều kiện chăm sóc, ni dưỡng người ni chó thủ nâng cao Chó ni quan tâm, trọng việc tiêm vắc-xin phịng bệnh, chăm sóc ni dưỡng khám chữa bệnh định kỳ đầy đủ Tỷ lệ chó mắc Care nghiên cứu khu vực Hà Nội 3,15% Trong đó, số điều trị khỏi 157 con, số chết 261 con, cịn 157 khơng điều trị bệnh nghiêm trọng trả lại chủ nuôi chủ nuôi không muốn điều trị 4.1.2 Kết kiểm tra chó mắc bệnh Care test chẩn đoán nhanh CDV-Ag 4.1.2.1 Kết kiểm tra test chẩn đoán nhanh Kết thực theo quy trình kít thương mại CDV-Ag (Asan Pharm, Hàn Quốc) 4.1.2.2 Tỷ lệ chó bị bệnh virus Care kit CDV-Ag Kết thử nghiệm test CDV-Ag trình bày bảng 4.2 Tổng số mẫu thử phương pháp kít chẩn đốn nhanh 354 mẫu (từ năm 2013 - 2018), mẫu đại diện hai đối tượng chó nội chó ngoại nhiễm virus Care Bảng 4.2 Kết kiểm tra chó mắc bệnh Care test chẩn đốn nhanh CDV Ag Nhóm chó ngoại Nhóm chó nội Số Năm Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số test dương Số mắc Số test mắc (%) dương tính (%) tính 2013 76 51 45 88,24 53 22 20 90,91 2014 79 48 43 89,58 47 20 18 90 2015 57 42 40 95,24 36 11 81,82 2016 64 57 54 94,74 27 17 14 82,35 2017 62 45 41 91,11 32 19 17 89,47 2018 53 44 40 90,91 26 15 13 86,67 Tổng 391 287 263 91,64a 221 104 91 87,50b Ghi chú: a, b: thể sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 Qua bảng 4.2 thấy, số chó xác định nhiễm Care triệu chứng lâm sàng, tỷ lệ dương tính với test CDV Ag cao Ở giống chó ngoại tỷ lệ dương tính với test CDV Ag từ 88,24% đến 95,24% (trung bình 91,64%) Ở giống chó nội từ 81,82% đến 90,91% (trung bình 87,50%) 4.1.3 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo địa bàn điều tra Trong q trình điều tra, vấn chủ ni chó, ghi chép lại địa điểm xuất ca bệnh theo khu vực Quận, Huyện Hà Nội Số liệu thu thập tính tốn theo tỷ lệ phần trăm thể Bảng 4.3 11 Bảng 4.3 Tỷ lệ mắc bệnh Care chó theo địa bàn điều tra Hà Nội STT Địa bàn Quận Tây Hồ Quận Đống Đa Quận Hai Bà Trưng Quận Cầu Giấy Quận Hà Đơng Quận Thanh Xn Quận Hồn Kiếm Quận Ba Đình Quận Hồng Mai Tổng hợp Số theo dõi 2217 2696 2102 1986 1857 1714 1953 2014 1705 18244 Số mắc 73 186 85 63 27 54 49 28 10 575 Tỷ lệ mắc (%) 3.29bc 6.9a 4.04b 3.17bc 1.45d 3.15bc 2.51c 1.39d 0.59e 3.15 P-value