Cải thiện khả năng ra rễ in vitro và nâng cao tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm của cây chanh dây tím có nguồn gốc từ tTCL lá đã được thiết lập trong nghiên cứu này. Mẫu tTCL lá được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar cho số chồi cao nhất (4 chồi/mẫu) sau 8 tuần.
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số (2020) CẢI THIỆN KHẢ NĂNG RA RỄ IN VITRO VÀ NÂNG CAO TỶ LỆ SỐNG SĨT NGỒI VƢỜN ƢƠM CỦA CÂY CHANH DÂY TÍM (Passiflora edulis Sims.) CĨ NGUỒN GỐC TỪ NI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ Trần Hiếu1, 2, 3, Hoàng Thanh Tùng1, Cao Đăng Nguyên2, Dƣơng Tấn Nhựt1* Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Trường Cao đẳng Sư phạm Ninh Thuận *Email: duongtannhut@gmail.com Ngày nhận bài: 02/7/2019; ngày hoàn thành phản biện: 4/9/2019; ngày duyệt đăng: 02/10/2019 TÓM TẮT Cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím có nguồn gốc từ tTCL thiết lập nghiên cứu Mẫu tTCL nuôi cấy môi trường MS bổ sung mg/l BA, 30 g/l sucrose g/l agar cho số chồi cao (4 chồi/mẫu) sau tuần Chồi sau nhân nhanh mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l Kin Ở giai đoạn rễ, chồi nuôi cấy hệ thống khác nhau, (1) hệ thống GB (2) hệ thống RPB Sau tuần nuôi cấy kết cho thấy, tỷ lệ rễ in vitro cải thiện đáng kể khơng có hình thành mô sẹo hệ thống RPB so với hệ thống GB Ngoài ra, hệ thống RPB cho tỷ lệ sống sót cao (100%) khả sinh trưởng phát triển tốt so với hệ thống GB sau tuần thích nghi ngồi vườn ươm Từ khóa: chanh dây tím, lớp mỏng tế bào, rễ, sống sót, tái sinh chồi MỞ ĐẦU Chanh dây tím (Passiflora edulis Sims.) giống có giá trị kinh tế quan trọng chi Passiflora (một chi lớn họ Passifloraceae) Nó trồng phổ biến vùng nhiệt đới cận nhiệt đới để cung cấp tươi làm nguyên liệu phục vụ cho ngành cơng nghiệp sản xuất nước giải khát Ngồi ra, sử dụng phổ biến vị thuốc dân gian Nam Mỹ để điều trị chứng nghiện rượu, bệnh liên quan đến thần kinh lo lắng, đau nửa đầu, hồi hộp ngủ [1] Giống loài chanh dây khác thuộc chi Passiflora chanh dây tím nhân giống phương pháp truyền thống gieo hạt, giâm cành, ghép 97 Cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím … Tuy nhiên, tạo từ phương pháp không kiểm soát mầm bệnh, số lượng chất lượng giống, Do đó, kỹ thuật vi nhân giống hữu ích việc bảo tồn nhân nhanh giống trồng mang kiểu gen quý tạo bệnh; có lồi thuộc chi Passiflora [2] Vi nhân giống bao gồm giai đoạn: thiết lập nguồn mẫu in vitro, nhân nhanh chồi, rễ in vitro thích nghi ex vitro [3]; đó, hiệu vi nhân giống phụ thuộc lớn vào số lượng chồi, tỷ lệ rễ in vitro hóa ngồi vườn ươm Hiện nay, nghiên cứu đối tượng chanh dây, nguồn mẫu đa dạng đỉnh sinh trưởng, đốt thân, trụ mầm, rễ mẫu thường sử dụng làm vật liệu để tái sinh nhân nhanh chồi in vitro [4-6] Theo nghiên cứu Lombardi cộng (2007) cho thấy, mẫu rễ cho hiệu tái sinh chồi cao mẫu lá, mẫu đốt thân; nhiên, hệ số tái sinh chồi đạt 5,1 chồi/mẫu [4] Bên cạnh đó, số nghiên cứu khác thực với mục đích tìm phương pháp tối ưu cho rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống vườn ươm; hiệu đạt thấp nghiên cứu Isutsa cộng (2004) chanh dây tím báo cáo tỷ lệ rễ đạt 47%, số rễ/chồi tỷ lệ sống sót 32% [7] Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) phát triển 30 năm, chứng minh phương pháp tối ưu cho hiệu tái sinh chồi ứng dụng thành công nhiều đối tượng trồng khác chuối, cam, dừa, măng cụt cà chua [8, 9] Hiện nay, kỹ thuật chưa ứng dụng đối tượng chanh dây Vì vậy, nghiên cứu cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím có nguồn gốc từ ni cấy tTCL thực VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Nguồn mẫu Lá thứ (tính từ chồi đỉnh xuống) từ chồi in vitro (1,5 tháng tuổi) chanh dây tím (hiện có Phịng Sinh học Phân tử Chọn tạo Giống trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên) sử dụng làm nguồn mẫu nghiên cứu Giá thể xơ dừa Xơ dừa (Công ty TNHH COCOGREEN, Việt Nam) ngâm rửa với nước nhiều lần để loại bỏ chất chát (tanin lignin), sau tiến hành hấp khử trùng sử dụng giá thể nuôi cấy thay cho agar nghiên cứu Hệ thống ni cấy 98 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số (2020) Hệ thống GB (chai thủy tinh 500 ml, 60 ml môi trường MSM (MS cải biên) [10], 30 g/l sucrose, g/l agar bổ sung 1-naphthaleneacetic acid (NAA) với nồng độ khác nhau) hệ thống RPB (hộp nhựa tròn 500 ml Đại Đồng Tiến (Việt Nam), thể tích mơi trường MSM khác nhau, 30 g/l sucrose, 20 g xơ dừa không bổ sung chất điều hịa sinh trưởng) Mơi trƣờng ni cấy Mơi trường nuôi cấy in vitro sử dụng nghiên cứu mơi trường MS [11] MSM có bổ sung 30 g/l sucrose; agar chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm Mơi trường điều chỉnh pH = 5,8 trước hấp khử trùng 121C, atm 30 phút 2.2 Phƣơng pháp Tái sinh chồi thông qua kỹ thuật lớp mỏng tế bào Lá cắt thành lớp mỏng theo chiều ngang (tTCL) với kích thước 10 mm x 2,5 mm Những tTCL nuôi cấy môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar Benzyladenine (BA), Kinetin (Kin) nồng độ khác (0; 0,5; 1,0; 1,5 2,0 mg/l) Thidiazuron (TDZ) (0; 0,25; 0,5; 0,75 1,0 mg/l) nhằm xác định loại nồng độ cytokinin thích hợp cho khả tái sinh chồi in vitro Sau tuần nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh chồi (%), số chồi/mẫu chiều cao chồi (cm) ghi nhận Những chồi tách khỏi cụm chồi tái sinh từ tTCL (tối ưu thí nghiệm trên) cấy chuyển sang mơi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l Kin [12] để tăng sinh chồi Ra rễ in vitro Chồi in vitro (kích thước cm) ni cấy hệ thống khác nhau, GB có bổ sung NAA nồng độ khác (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 3,0 mg/l) tùy theo nghiệm thức RPB với thể tích mơi trường MSM khác (20 ml; 40 ml 60 ml) nhằm đánh giá khả rễ hệ thống Sau tuần nuôi cấy, tỷ lệ rễ (%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (cm), chiều cao (cm), số lá/cây số SPAD - tổng hàm lượng chlorophyll đo máy SPAD-502 (Minolta Co., Ltd., Osaka, Japan) ghi nhận Thích nghi ngồi vƣờn ƣơm Những khỏe mạnh thí nghiệm rễ in vitro chuyển điều kiện vườn ươm nhằm đánh giá thích nghi khả sinh trưởng Cây (10 cây/nghiệm thức) lấy khỏi hệ thống nuôi cấy rửa lại nhiều lần nước để loại bỏ giá thể bề mặt rễ Sau đó, trồng vào chậu nhựa chứa hỗn hợp đất xơ dừa (tỷ lệ 1:1) vô trùng Trong tuần đầu, giữ ẩm cách che phủ kín màng nhựa polyethylen Sau tuần giữ ẩm, 99 Cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím … chuyển nhà kính tuần để thích nghi điều kiện ex vitro Tỷ lệ sống sót (%), chiều cao (cm), số lá/cây, chiều rộng (cm) chiều dài (cm) ghi nhận 2.3 Điều kiện nuôi cấy Điều kiện in vitro: bình ni cấy đặt 25±2C, độ ẩm 55-60%, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 40-45 µmol.m–2.s–1 ánh sáng huỳnh quang Điều kiện ex vitro: nhiệt độ 18-25°C, độ ẩm trung bình 70-75% sử dụng ánh sáng tự nhiên có che sáng 40% 2.4 Xử lý số liệu Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, với lần lặp lại Mỗi lần lặp lại cấy 20 bình/nghiệm thức với mẫu/bình Các số liệu thu xử lý phần mềm Microsoft Excel® 2010 phần mềm SPSS 20.0 với phép thử Duncan mức α = 0,05 [13] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng BA, Kin TDZ lên khả tái sinh chồi từ tTCL Cytokinin chất điều hịa sinh trưởng thực vật tham gia vào việc điều khiển sinh trưởng phát triển chồi bất định chúng cho thấy hiệu việc cảm ứng phát sinh quan chi Passiflora [14] Vì vậy, nghiên cứu BA, Kin TDZ sử dụng nhằm khảo sát ảnh hưởng chúng lên khả tái sinh chồi từ tTCL Kết sau tuần nuôi cấy cho thấy, BA tỏ hiệu so với TDZ, Kin việc cảm ứng tái sinh chồi từ tTCL lá; tất nồng độ BA sử dụng thí nghiệm cho tỷ lệ tái sinh chồi cao (lớn 50%) tỷ lệ tái sinh chồi đạt cao (100%) nồng độ 1,0 mg/l BA Ngoài ra, số chồi/mẫu (4,00 chồi) chiều cao chồi (1,53 cm) thu cao nồng độ (Bảng Hình 1a) Kết nghiên cứu tương tự nghiên cứu Ragavendran cộng (2012); Otoni cộng (2013), nhóm tác giả cho thấy so với TDZ Kin BA cho hiệu việc tái sinh chồi từ nguồn mẫu khác giống chanh dây thuộc chi Passiflora [15, 16] Cũng nguồn mẫu (đĩa có đường kính mm) Passiflora cincinnata Mast., nồng độ 1,0 mg/l BA cho tỷ lệ tái sinh chồi (41,33%) số chồi/mẫu (2,32 chồi) [4] Trong đó, mẫu tTCL có kích thước (10 mm x 2,5 mm), cho tỷ lệ tái sinh chồi (100%) số chồi/mẫu (4,0 chồi) (Bảng 1) Ngoài mẫu lá, BA cho hiệu tái sinh chồi từ mẫu trụ mầm P setacea nuôi cấy điều kiện chiếu sáng 16 [14] 100 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số (2020) Bảng Ảnh hưởng BA, Kin TDZ môi trường MS lên khả tái sinh chồi từ tTCL sau tuần nuôi cấy BA (mg/l) 0,5 1,0 1,5 2,0 - Kin (mg/l) 0,5 1,0 1,5 2,0 - TDZ (mg/l) 0,25 0,5 0,75 1,0 Tỷ lệ tái sinh chồi (%) 0,00e* 73,33c 100,00a 81,67b 58,33d 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e Số chồi/mẫu 0,00e 2,67c 4,00a 3,33b 2,00d 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e Chiều cao chồi (cm) 0,00e 0,23c 1,53a 0,73b 0,13d 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e 0,00e *Những chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê α = 0,05 theo phép thử Duncan Chồi thu từ tái sinh chồi tTCL cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l Kin nhằm tăng sinh số chồi gia tăng chiều cao chồi Sau tuần nuôi cấy, chồi có kích thước khoảng cm (Hình 1b) sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm rễ 3.2 Sự rễ in vitro Loại nồng độ auxin có ảnh hưởng đáng kể đến hình thành rễ Auxin khơng cần thiết cho giai đoạn sớm hình thành rễ mà cịn có hiệu cho phát triển rễ [17] Vì vậy, giai đoạn rễ, auxin thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy Trong nghiên cứu này, NAA đóng vai trị quan trọng cho hình thành rễ in vitro chồi chanh dây tím nuôi cấy hệ thống GB Kết bảng cho thấy, NAA nồng độ 2,5 mg/l cho tỷ lệ rễ (67,67%), số rễ/chồi (4,33 rễ) cao Khi tăng nồng độ NAA (lớn 2,5 mg/l) tỷ lệ rễ giảm Isutsa cộng (2004) nghiên cứu rễ chồi (có nguồn gốc từ chồi đỉnh) chanh dây tím cho thấy, tỷ lệ rễ (47%), số rễ/chồi (1 rễ) quan sát nồng độ 4,0 mg/l NAA [7] Trong đó, Mukasa cộng (2016) cho rằng, rễ chồi (có nguồn gốc từ mẫu đốt thân) thu số rễ/chồi (2,5 rễ) nồng độ 3,0 mg/l NAA [18] Như vậy, kết nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu khác trước đây, NAA (nồng độ thích hợp khác nhau) có tác dụng hiệu lên trình rễ in vitro chồi có nguồn gốc từ nguồn mẫu khác chanh dây tím Hơn nữa, quan sát in vitro hệ thống cho thấy, khối mơ sẹo hình thành phần 101 Cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím … gốc (Hình 1c) Hiện tượng quan sát nghiên cứu Jafari cộng (2017) đối tượng Passiflora caerulea L IBA bổ sung nồng độ cao [19] Bảng Ảnh hưởng NAA lên khả rễ in vitro hệ thống GB sau tuần nuôi cấy NAA (mg/l) Tỷ lệ rễ (%) Số rễ/ chồi 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0,00g* 25,00f 30,00e 38,33d 50,00c 66,67a 58,33b 0,00e 1,00d 2,33c 3,33b 3,00bc 4,33a 2,33c Chiều dài rễ (cm) Chiều cao chồi (cm) 0,00f 0,33e 0,47e 0,83d 1,93c 2,83b 3,12a 2,00f 2,57e 2,63e 2,93d 3,50c 3,80b 4,67a Số lá/chồi Chiều dài (cm) Chiều rộng SPAD (cm) 3,33d 4,00cd 4,33c 4,67c 6,00b 6,33b 7,33a 2,07e 2,13de 2,17de 2,27d 2,53c 2,97b 3,43a 0,93f 1,07ef 1,27d 1,10e 1,47c 2,03b 2,40a 31,70b 26,50d 24,80e 23,07f 14,83g 35,57a 29,73c *Những chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê α = 0,05 theo phép thử Duncan Trong thí nghiệm này, ngồi việc sử dụng hệ thống GB để nghiên cứu rễ hệ thống RPB tiến hành nhằm đánh giá khả rễ chồi in vitro Kết sau tuần cho thấy, chồi nuôi cấy hệ thống RPB với 20 ml môi trường MSM cho tỷ lệ rễ (88,33%), số rễ/chồi (5,33 rễ), chiều dài rễ (3,40 cm), chiều cao chồi (4,17 cm), số lá/chồi (7,33 lá), chiều dài (2,87 cm), chiều rộng (1,63 cm) số SPAD (37,03) cao (Bảng Hình 1d, e) Khi tăng thể tích mơi trường ni cấy tỷ lệ rễ giảm Thể tích mơi trường lớn (60 ml) làm cho giá thể trở nên khơng thống khí, dẫn đến giảm khả hơ hấp, trao đổi khí chồi với môi trường nuôi cấy, tác động tiêu cực đến hình thành rễ chồi; đó, với thể tích mơi trường (20 ml), giá thể trở nên thống khí hơn, điều làm tăng cường khả hơ hấp, trao đổi khí chồi với mơi trường ni cấy, kích thích hình thành rễ Yu cộng (2000) cho rằng, thoáng khí mơi trường rễ yếu tố quan trọng hình thành rễ thống khí mơi trường khơng tốt lý làm giảm khả cảm ứng hình thành rễ, giảm chất lượng rễ chức rễ [20] 102 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số (2020) Bảng Ra rễ in vitro hệ thống RPB với thể tích mơi trường MSM khác sau tuần ni cấy Thể tích môi trƣờng (ml) Tỷ lệ rễ (%) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) 20 40 60 88,33a* 53,33b 18,33c 5,33a 1,67b 1,33b 3,40a 2,90b 0,23c Chiều cao chồi (cm) 4,17a 2,83b 2,67b Số lá/chồi Chiều dài (cm) 7,33a 4,67b 2,33c 2,87a 1,73b 1,53b Chiều rộng (cm) 1,63a 0,63b 0,43c SPAD 37,03a 34,70b 12,70c *Những chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê α = 0,05 theo phép thử Duncan Khi so sánh hình thành rễ chồi in vitro hệ thống với thể tích 60 ml mơi trường MSM khơng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, kết cho thấy chồi ni cấy hệ thống GB khơng hình thành rễ; hệ thống RPB, chồi lại hình thành rễ (Bảng 2, 3) Đặc biệt, quan sát cảm ứng hình thành rễ chồi hệ thống RPB cho thấy không xuất khối mô sẹo (Hình 1e) Như vậy, kết nghiên cứu chứng minh cảm ứng rễ khác bị tác động giá thể khác (agar xơ dừa) Theo nghiên cứu Gabriel cộng (2002), chồi Pyrus ‘Bartlett’ ‘OH x F97’ không tạo rễ thứ cấp nuôi cấy giá thể agar hai loài hình thành rễ giá thể vermiculite với tần số 31,07% 53,61% [21] Zimmerman Broome (1989) báo cáo rằng, hiệu rễ in vitro cao chồi nuôi cấy giá thể vermiculite hỗn hợp vermiculite perlite so với giá thể agar giống táo khác [22] Tương tự, Hutchinson (1984), thu tỷ lệ rễ cao đáng kể giống táo ‘Northern Spy’ chồi nuôi cấy giá thể cát thô perlite [23] Thống khí thường vấn đề rễ ni cấy mơi trường có bổ sung agar [24] Các hạt mịn agar môi trường ni cấy có xu hướng làm giảm khả thống khí mơi trường có tác động tiêu cực đến trình tạo rễ in vitro [25] Vì vậy, để tăng cường cảm ứng rễ chồi in vitro, cần sử dụng giá thể thống khí thích hợp cho trình hình thành rễ Kirdmanee cộng (1995; 1999) cho rằng, thống khí giá thể vermiculite cao giá thể agar gelrite nên chồi bạch đàn cho số lượng rễ nhiều nuôi cấy giá thể vermiculite so với giá thể agar gelrite [26, 27] Những phát nghiên cứu trước kết nghiên cứu cho thấy rằng, việc lựa chọn giá thể vermiculite; hỗn hợp vermiculite perlite; giá thể xơ dừa có khả thống khí tốt điều cần thiết cho hình thành rễ in vitro Kết nghiên cứu giai đoạn rễ in vitro cho thấy, chồi nuôi cấy hệ thống RPB với 20 ml môi trường MSM cho hiệu rễ cao so với chồi 103 Cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím … ni cấy hệ thống GB với 60 ml môi trường MSM, bổ sung NAA chất lượng rễ cải thiện tốt rễ khơng hình thành mơ sẹo Mặt khác, sử dụng xơ dừa làm giá thể (trong hệ thống RPB) thay cho agar (trong hệ thống GB) giai đoạn rễ in vitro giảm chi phí sản xuất giảm 2/3 thể tích mơi trường nuôi cấy không sử dụng NAA giá thành xơ dừa (8.000 đồng/1 kg) thấp nhiều so với giá agar (450.000 đồng/1 kg, Việt Nam) 3.3 Thích nghi ngồi vƣờn ƣơm Mục tiêu cuối vi nhân giống trồng thu số lượng lớn khoảng thời gian ngắn với tỷ lệ sống sót cao ngồi vườn ươm Vì vậy, nghiên cứu tất hệ thống trồng vườn ươm nhằm đánh giá khả thích nghi sống sót chúng Trước chuyển trực tiếp ngồi vườn ươm, phủ kín màng nhựa polyethylen tuần (Hình 1f) nhằm giảm nước sau trồng chậu nhựa chứa hỗn hợp xơ dừa:đất (1:1) Sau tuần trồng vườn ươm kết cho thấy, hệ thống RPB với 20 ml môi trường MSM cho tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm đạt cao (100%) Đồng thời, sinh trưởng tốt khỏe mạnh thông qua tiêu chiều cao (17,50 cm), số lá/cây (15,33 lá) chiều rộng (3,73 cm) (Bảng Hình 1g) Trong đó, hệ thống GB có bổ sung NAA nồng độ khác cho tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm khơng cao cao đạt 66,67% nghiệm thức bổ sung 2,5 mg/l NAA (Bảng 4) Như vậy, kết nghiên cứu cho thấy hình thành mơ sẹo phần gốc làm giảm khả sống sót trồng giai đoạn vườn ươm (do giảm kết nối mạch dẫn rễ chồi, ngăn chặn hấp thụ nước chất dinh dưỡng môi trường) điều phù hợp với nghiên cứu Kollemeier cộng (2000) rễ kéo dài rễ ngô [28] Bảng Khả thích nghi sinh trưởng hệ thống điều kiện vườn ươm sau tuần Nghiệm thức Thể tích NAA mơi (mg/l) trƣờng (ml) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 - Tỷ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Số lá/cây Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) 0,00g* 26,67f 36,67e 50,00d 56,67d 66,67c 53,33d 0,00g 5,00f 5,43f 7,33e 9,33d 14,12b 13,17c 0,00e 5,67d 6,33d 6,67d 8,33d 11,67b 10,33c 0,00f 5,17e 5,23e 6,30d 7,37c 8,73a 8,17b 0,00f 2,33de 2,43de 2,37de 2,87bc 3,16b 3,07b 104 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế - 20 40 60 100,00a 80,00b 36,67e 17,50a 12,67c 5,33f 15,33a 11,67b 5,67d Tập 15, Số (2020) 7,67c 6,40d 4,97e 3,73a 2,57cd 2,13e *Những chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa thống kê α = 0,05 theo phép thử Duncan Hình Vi nhân giống chanh dây tím có nguồn gốc từ nuôi cấy tTCL a Chồi tái sinh từ tTCL môi trường MS bổ sung mg/l BA sau tuần; b Nhân nhanh chồi môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l Kin sau tuần; c Rễ hình thành hệ thống GB có bổ sung 2,5 mg/l NAA sau tuần; d, e Rễ hình thành hệ thống RPB với 20ml môi trường MSM sau tuần; 105 Cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím … f Cây hệ thống phủ kín màng nhựa polyethylen để giữ ẩm tuần; g Cây thích nghi ngồi vườn ươm sau tuần (bên trái: hệ thống RPB với 20ml môi trường MSM; bên phải: hệ thống GB có bổ sung 2,5 mg/l NAA) KẾT LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy, tTCL nuôi cấy môi trường MS chứa 30 g/l sucrose, g/l agar mg/l BA, cho hiệu tái sinh chồi cao so với tTCL nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung Kin TDZ Sử dụng hệ thống nuôi cấy RPB với 20 ml mơi trường MSM thích hợp cho việc cảm ứng hình thành rễ chồi có nguồn gốc từ tTCL so với hệ thống GB có bổ sung NAA; khắc phục tượng hình thành khối mơ sẹo rễ; tăng khả thích nghi, cải thiện tỷ lệ sống sót sinh trưởng mạnh điều kiện vườn ươm LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu hỗ trợ Phòng Sinh học Phân tử Chọn tạo Giống trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] H Li, P Zhou, Q Yang, Y Shen, J Deng, L Li, D Zhao (2011) Comparative studies on anxiolytic activities and flavonoid compositions of Passiflora edulis ‘edulis’ and Passiflora edulis ‘flavicarpa’, Journal of Ethnopharmacology, 133(3), pp 1085-1090 [2] Y S Huh, J K Lee, S Y Nam (2017) Effect of plant growth regulators and antioxidants on in vitro plant regeneration and callus induction from leaf explants of purple passion fruit (Passiflora edulis Sims.), Journal of Plant Biotechnology, 44(3), pp 335-342 [3] E F George, P C Debergh (2008) Micropropagation: uses and methods In: E F George, M A Hall, G J De Klerk (eds) Plant propagation by tissue culture, Springer, Dordrecht, The Netherlands, pp 29-64 [4] S P Lombardi, I R da Silva Passos, M C S Nogueira, B A da Glória (2007) In vitro shoot regeneration from roots and leaf discs of Passiflora cincinnata Mast., Brazilian Archives of Biology and Technology, 50(2), pp 239-247 [5] S Prammanee, S Thumjamras, P Chiemsombat, N Pipattanawong (2011) Efficient shoot regeneration from direct apical meristem tissue to produce virus-free purple passion fruit plants, Crop Protection, 30(11), pp 1425-1429 106 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số (2020) [6] D I Rocha, L M Vieira, F A O Tanaka, L C da Silva, W C Otoni (2012) Anatomical and ultrastructural analyses of in vitro organogenesis from root explants of commercial passion fruit (Passiflora edulis Sims.), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 111(1), pp 69-78 [7] D K Isutsa, (2004) Rapid micropropagation of passion fruit (Passiflora edulis Sims.) varieties, Scientia Horticulturae, 99(3-4), pp 395-400 [8] J A T da Silva (2003) Thin cell layer technology in ornamental plant micropropagation and biotechnology, African Journal of Biotechnology, 2(12), pp 683-691 [9] D T Nhut, T J A da Silva, V L Bui, K Tran Thanh Van (2003) Thin cell layer technology in fruit crop regeneration In: D T Nhut, V L Bui, K Tran Than Van, T Thorpe (eds) Thin cell layer culture system regeneration and transformation applications, Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, pp 451-472 [10] A C B de A Monteiro, E N Higashi, A N Goncalves, A P M Rodriguez (2000) A novel approach for the definition of the inorganic medium components for micropropagation of yellow passion fruit (Passiflora edulis Sims f flavicarpa Deg.), In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant, 36(6), pp 527-531 [11] T Murashige, F Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, Physiologia Plantarum, 15, pp 473-497 [12] M S Shekhawat, N Kannan, M Manokari, C P Ravindran (2015) In vitro regeneration of shoots and ex vitro rooting of an important medicinal plant Passiflora foetida L through nodal segment cultures, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 13(2), pp 209-214 [13] D B Duncan (1955) Multiple range and multiple F test, Biometrics, 11, pp 1-42 [14] L M Vieira, D I Rocha, M F Taquetti, L C da Silva, J M S de Campos, L F Viccini, W C Otoni (2014) In vitro plant regeneration of Passiflora setacea D.C (Passifloraceae): the influence of explant type, growth regulators, and incubation conditions, In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant, 50(6), pp 738-745 [15] C Ragavendran, D Kamalanathan, G Reena, D Natarajan (2012) In vitro propagation of nodal and shoot tip explants of Passiflora foetida L An exotic medicinal plant, Asian Journal of Plant Science and Research, 2(6), pp 707-711 [16] W C Otoni, P D L Paim, D I Rocha, L M Vieira, L L C Dias, M L Silva, C V Silva, E R G Lani, L C Silva, F A O Tanaka (2013) Organogenesis and somatic embryogenesis in passion fruit (Passiflora sp.) In: J Aslam, O S Srivastava, M P Sharma (eds) Somatic embryogenesis and gene expression, Narosa Publishing House, New Delhi, pp 1-17 [17] J Dobránszki, T J A da Silva (2010) Micropropagation of an apple a review, Biotechnology Advances, 28(4), pp 462-488 [18] S B Mukasa, A Ssamula, P Asami, T A Holton (2016) In vitro propagation of three commercial passionfruit varieties in Uganda, African Crop Science Journal, 24(4), pp 397404 [19] M Jafari, M H Daneshvar, A Lotfi (2017) In vitro shoot proliferation of Passiflora caerulea L via cotyledonary node and shoot tip explants, Biotechnologia, 98(2), pp 113-119 [20] T A Yu, S D Yeh, Y H Cheng, J S Yang (2000) Efficient rooting for establishment of papaya plantlets by micropropagation, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 61(1), pp 29-35 107 Cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím … [21] B L Gabriel, L F Nelson, R D L F Gérson (2002) Use of vermiculite as a substrate and effect of light on in vitro rooting of pears cv Bartlett and clone OH x F97, Science and Agrotechnology, 26(5), pp 977-982 [22] T W Zimmerman, O C Broome (1989) Micropropagation of woody plant: post tissue cultures aspects, Acta Horticulturae, 22(1), pp 489-499 [23] J F Hutchinson (1984) Factors affecting shoot proliferation and root initiation in organ cultures of the apple ‘Northern Spy’, Scientia Horticulturae, 22(4), pp 347-358 [24] I Kataoka (1994) Influence of rooting substrates on the morphology of papaya root formed in vitro, Japanese Journal of Tropical Agriculture, 38(3), pp 251-257 [25] P Suksa-Ard, I Kataoka, Y Fujime, K Beppu, S Subhadrabandhu (1998) Development of rooting system for tissue cultured papaya shoots using rockwool blocks, Japanese Journal of Tropical Agriculture, 42(2), pp 119-121 [26] C Kirdmanee, Y Kitaya, T Kozai (1995) Effects of CO enrichment and supporting material on growth, photosynthesis and water potential of Eucalyptus shoots/plantlets cultured photoautotrophically in vitro, Environmental Control in Biology, 33(2), pp 133-141 [27] C Kirdmanee (1999) Environmental control in micropropagation: effects of CO2 enrichment and supporting material on growth and photosynthesis of eucalyptus shoots/plantlets cultured photoautotrophically in vitro, In: C Kirdmanee, A Altman, M Ziv, S Izhar (eds) Plant biotechnology and in vitro biology in the 21 st century, Springer, Dordrecht, The Netherlands, pp 651-654 [28] M Kollmeier, H H Mafelle, W J Horst (2000) Genotypical differences in aluminum resistance of maize are expressed in the distal part of the transition zone Is reduced basipetal auxin flow involved in inhibition of root elongation by aluminum, Plant Physiology, 122(3), pp 945-956 108 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 15, Số (2020) IMPROVED IN VITRO ROOTING AND SURVIVAL RATES OF PURPLE PASSION FRUIT (Passiflora edulis Sims.) PLANTLETS DERIVED FROM LEAF TRANSVERSE THIN CELL LAYER IN EX VITRO CONDITION Tran Hieu1, 2, 3, Hoang Thanh Tung1, Cao Dang Nguyen2, Duong Tan Nhut1* Tay Nguyen Institute for Scientific Research University of Sciences, Hue University Pedagogical College of Ninh Thuan *Email: duongtannhut@gmail.com ABSTRACT Improved in vitro rooting and enhanced survival rates in ex vitro condition of Passiflora edulis Sims plantlets derived from leaf transverse thin cell layer (tTCL) were established in this study Leaf-tTCL was cultured on Murashige and Skoog’s medium supplemented with 1.0 mg/L Benzyladenine, 30 g/L sucrose, and g/L agar gave the highest number of shoots (4 shoots/explant) after weeks The shoots were proliferated on MS medium containing 0.5 mg/L Benzyladenine and 0.5 mg/L Kinetin In rooting stage, the shoots were cultured in two different systems; (1) GB system and (2) RPB system After weeks of culture, the results showed in vitro rooting rate was enhanced and without callus formation in the RPB system as compared to that in the GB one In addition, the plantlets in the RPB system gave high survival rates (100%) as well as better growth and development than the ones in the GB system after weeks of acclimatization in greenhouse Keywords: Passiflora edulis Sims., rooting, shoot regeneration, survival, thin cell layer Trần Hiếu sinh ngày 12/03/1983 Ninh Thuận Ông tốt nghiệp cử nhân Sinh học năm 2006 Đại học Đà Lạt, thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm năm 2014 Đại học Đà lạt NCS chuyên ngành Sinh lý học Thực vật Đại học Khoa học, Đại học Huế Hiện nay, ông giảng viên trường Cao đẳng Sư phạm Ninh Thuận Lĩnh vực nghiên cứu: Công nghệ Sinh học Thực vật 109 Cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím … Hồng Thanh Tùng sinh ngày 26/03/1989 Quảng Bình Ông tốt nghiệp cử nhân ngành Sinh học, Ngôn ngữ Anh thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Đại học Đà Lạt Ông nhận học vị tiến sĩ chuyên ngành Sinh lý thực vật Đại học Khoa học, Đại học Huế Hiện nay, ông nghiên cứu viên, Phòng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Lĩnh vực nghiên cứu: Công Nghệ Sinh học Thực vật; Công nghệ thủy canh Cao Đăng Nguyên sinh năm 1956 Ông tốt nghiệp cử nhân năm 1981 Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tốt nghiệp thạc sĩ năm 1996 Đại học Huế nhận học vị tiến sĩ năm 2001 Đại học Quốc gia Hà Nội Năm 2004, ông nghiên cứu sau tiến sĩ (Dự án GDĐH) Đại học Goettingen, CHLB Đức Năm 2010, ông nhận học hàm phó giáo sư Hiện nay, ơng giảng viên khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Lĩnh vực nghiên cứu: Tách chiết, tinh khảo sát đặc tính Lectin Hoạt tính protein Dƣơng Tấn Nhựt sinh ngày 06/04/1967 Khánh Hịa Ơng tốt nghiệp cử nhân ngành Sinh học năm 1991 Đại học Đà Lạt; thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học Thực vật Đại học Kagawa (Nhật Bản) vào năm 1999; nhận học vị tiến sĩ năm 2002 Đại học Kagawa (Nhật Bản); nhận học hàm phó giáo sư năm 2009 giáo sư năm 2018 Ông giữ chức vụ Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên (VAST) Lĩnh vực nghiên cứu: Công nghệ sinh học thực vật 110 ... rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống vườn ươm; hiệu đạt thấp nghiên cứu Isutsa cộng (2004) chanh dây tím báo cáo tỷ lệ rễ đạt 47%, số rễ/ chồi tỷ lệ sống sót 32% [7] Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào. .. nghiên cứu cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím có nguồn gốc từ nuôi cấy tTCL thực VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Nguồn mẫu Lá thứ (tính từ chồi đỉnh... với chồi 103 Cải thiện khả rễ in vitro nâng cao tỷ lệ sống sót ngồi vườn ươm chanh dây tím … ni cấy hệ thống GB với 60 ml môi trường MSM, bổ sung NAA chất lượng rễ cải thiện tốt rễ khơng hình