Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người

Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********** HOÀNG THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP ĐỂ CHẨN ĐỐN XÁC ĐỊNH NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ Clonorchis sinensis TRÊN NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********** HOÀNG THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP ĐỂ CHẨN ĐỐN XÁC ĐỊNH NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ Clonorchis sinensis TRÊN NGƢỜI Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trương Văn Hạnh TS Đỗ Thị Phúc H Nội– Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nhận giúp đỡ tận tâm thầy, cô, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trương Văn Hạnh, Khoa Sinh học Phân tử, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương, người hướng dẫn trực tiếp, tận tình bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu, thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Đỗ Thị Phúc, Bộ mộn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, thầy đồng hướng dẫn, ln ln nhiệt tình giúp đỡ, bảo động viên trình thực nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn: Chủ nhiệm đề tài KC.10.16/16-20 PGS.TS Trần Thanh Dương thành viên tham gia nghiên cứu đề tài giúp đỡ tham gia thực nghiên cứu quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán gan nhỏ Clonorchis sinensis người Các anh chị em đồng nghiệp khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung Ương hỗ trợ tơi q trình tham gia học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng cảm ơn chân thành đến tập thể Giáo sư, Tiến sĩ Hội đồng khoa học chấm Luận văn Tôi vô biết ơn gia đình người bạn thân thiết đãđộng viên, chia sẻ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn Hoàng Thị Hạnh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh sán gan nhỏ 1.1.1 Các triệu chứng lâm sàng .3 1.1.2 Các phƣơng pháp chẩn đoán[1] .3 1.2 Đặc điểm phân loại, hình thái sán gan nhỏ Clonorchis sinensis 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Hình thái sán gan nhỏ Clonorchis sinensis .4 1.3 Chu kỳ phát triển sán gan nhỏ .5 1.4 Một số đặc điểm di truyền phân tử sán gan nhỏ sử dụng giám định loài 1.4.1.DNA ribosome(rDNA)trong hệ gen nhân 1.4.2 Hệ gen ty thể mtDNA 1.5 Thực trạng nhiễm sán gan nhỏ giới Việt Nam 1.5.1 Thực trạng nhiễm sán gan nhỏ giới .8 1.5.2 Thực trạng nhiễm sán gan nhỏ Việt Nam 10 1.6 Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sán gan nhỏ 10 1.6.1 Xét nghiệm tìm trứng sán gan nhỏ phân dịch tá tràng 10 1.6.2 Các xét nghiệm miễn dịch 11 1.6.3 Chẩn đoán kỹ thuật sinh học phân tử 11 1.7 Kỹ thuật LAMP 12 1.7.1 Nguyên lý kỹ thuật LAMP 12 1.7.2 Đánh giá kết LAMP 15 1.8 Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP chẩn đoán C.sinensis năm gần 17 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng, thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu 19 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.1.2 Thời gian nghiên cứu: 19 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu .19 2.1.4 Hóa chất, vật tƣ tiêu hao, thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .22 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu .22 2.2.1.1 Thu thập mẫu phân, mẫu sán gan nhỏ trƣởng thành 23 2.2.1.2 Tách ADN tổng số 23 2.2.3 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 25 2.3 Các số nghiên cứu 29 2.4 Thu thập số liệu, xử lý số liệu 30 2.5 Đạo đức nghiên cứu .31 CHƢƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1.Kết nghiên cứu thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán gan nhỏ C sinensistrên ngƣời .32 3.1.1 Kết thiết kế mồi cho phản ứng LAMP xác định C sinensis 32 3.1.2 Kết tối ƣu điều kiện phản ứng LAMP xác định C sinensis 38 3.2 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán gan nhỏ C Sinensis ngƣời 48 3.2.1 Kết điều tra thu thập mẫu phân, mẫu sán gan nhỏ trƣởng thành48 3.2.2 Kết thiết lập mẫu sử dụng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán gan nhỏ C sinensis 49 3.2.3 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật LAMP phát C sinensis ngƣời 51 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thể, cấu tạo sán gan nhỏ C sinensistrưởng thành Hình 1.2 Sán gan nhỏ trứng sán gan nhỏ Hình 1.3 Chu kỳ phát triển sán gan nhỏ Hình 1.4 Minh họa rTU eukaryote Hình 1.5 Bộ gen ty thể sán gan nhỏ Hình 1.6 Sơ đồ mơ tả q trình phản ứng LAMP 14 Hình 1.7 Đánh giá kết LAMP 15 Hình 1.8 Sơ đồ quy trình thực kỹ thuật LAMP .16 Hình 3.1.Kết tìm kiếm trình tự gen nad1 C sinensis NCBI 32 Hình 3.2 Ảnh phân tích gióng hàng 24 trình tự gen nad1 C sinensis phần mềm Bioedit v.2.6.7 33 Hình 3.3 Ảnh điện di kết thử nghiệm mồi LAMP thiết kế dựa khả tổng hợp ADN 35 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F3/B3 C sinensis .36 Hình 3.5 Ảnh giản đồ trình tự ADN đoạn gen nad1 nhân với cặp mồi CS-Nad1-F3/B3 với mẫu C sinnensis Ninh Bình .36 Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CS-Nad1-F3/B3 mẫu thử nghiệm ADN số loài giun, sán 37 Hình 3.7 Ảnh điện di kết khảo sát nhiệt độ ủ phản ứng LAMP 38 L: Ladder 100 bp .38 Hình 3.8.Kết khảo sát thời gian phản ứng LAMP .39 Hình 3.9.Kết khảo sát tối ưu nồng độ Mg2+cho phản ứng LAMP .40 Hình 3.10.Kết khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng LAMP .41 Hình 3.11.Kết khảo sát nồng độ dNTP mix cho phản ứng LAMP 42 Hình 3.12 Kết khảo sát thể tích ADN khn đưa vào phản ứng LAMP 43 Hình 3.13.Kết khảo sát nồng độ HNB sử dụng cho phản ứng LAMP .44 Hình 3.14.Kết khảo sát ngưỡng phát LAMP xác định C sinensis 46 Hình 3.15 Kết khảo sát ngưỡng phát phản ứng LAMP xác định C sinensis sử dụng chất thị màu HNB 47 Hình 3.16.Kết khảo sát khả lai chéo kỹ thuật LAMP với loài giun, sán gây bệnh người 52 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các hóa chất, chất chuẩn sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng cho LAMP, real time PCR 20 Bảng 2.3 Danh mục vật tư tiêu hao sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.4 Danh mục máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.5 Bảng tính độ nhạy độ đặc hiệu 30 Bảng 3.1 Trình tự mồi LAMP thiết kế để khuếch đại gen nad1 .34 Bảng 3.2 Kết phát sản phẩm LAMP sử dụng HNB mắt thường 45 Bảng 3.3 Kết xét nghiệm phân kỹ thuật Kato-Katz 49 ảng 3.4 ết tẩy, đãi thu sán gan nhỏ C sinensis 49 Bảng 3.5 Kết thiết lập mẫu để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật LAMP 51 Bảng 3.6 Kết xác định độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán gan nhỏ C sinensis phịng thí nghiệm 51 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Basic Local Alignment Cơng cụ tìm kiếm, đối chiếu nội Search Tool NICB bp Base pairs Cặp bazơ Ct Threshold Cycle Chu kỳ ngưỡng DNA Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleotide Deoxynucleotide Triphosphate BLAST Triphosphate IDT Integrated DNA Cơng nghệ DNA tích hợp Technologies LAMP nad1 Loop – Mediated Isothermal Khuếch đại đẳng nhiệt tạo cấu Amplification trúc vòng NADH dehydrogenase NADH dehydrogenase subunit subunit NCBI National Center for Trung tâm thông tin công nghệ Biotechnology Information sinh học quốc gia Mỹ PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp rTU Ribosomal transcriptome Đơn vị phiên mã Ribosome unit RNA Ribonucleic Acid Axit Ribonucleic UTRs Untranslated Regions Vùng không dịch mã Ultra violet Tia cực tím World Health Organization Tổ chức Y tế giới UV WHO MỞ ĐẦU Cá ăn giàu lượng ưa thích chứa nhiều nguy mầm bệnh tiềm tàng chưa nấu chín Nhiều thống kê có khoảng 50 loại giun sán ký sinh chủ yếu tìm thấy loại hải sản, phổ biến loại cá nước Nhiễm sán gan nhỏ bệnh gắn liền với tập quán ăn gỏi cá từ lâu đời nhiều vùng nước như: Ninh ình, Nam Định, Hịa ình, Phú Yên, ình Định… Theo ước tính giới số người mắc sán gan nhỏ khoảng 45 triệu người, số người có nguy mắc khoảng 600 triệu [13] Tại Việt Nam phát hai loài sán gan nhỏ Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini với hai vùng dịch tễ rõ rệt Loài C.sinensis lưu hành cao vùng đồng Bắc Nam Định, Hồ Bình, Ninh Bình 20-30% Trong lồi sán gan nhỏ O viverrini lưu hành chủ yếu tỉnh phía Nam Phú Yên có tỷ lệ nhiễm 36,9%, ình Định 11,9%, Đăk Lăk 7,6%, Đà Nẵng 0,3%, Quảng Nam 4,6%, Khánh Hoà 1,4% [9] Sán gan nhỏ ký sinh gây tổn thương gan, lách, tụy Nhiễm sán gan nhỏ gây tăng sinh tổ chức xơ gan, ống mật dày lên có gấp 2-3 lần bình thường; ống tụy dày; lách có sưng to xơ hóa; đặc biệt nhiễm sán gan nhỏ kéo dài ảnh hưởng đến chức gan, dẫn đến xơ gan, gây ung thư đường mật gây tử vong [2], [13] Tuy nhiên, từ nhiễm sán gan nhỏ đến xuất triệu chứng bệnh lý khoảng thời gian dài khơng có triệu chứng lâm sàng triệu chứng không đặc hiệu Do không biểu rầm rộ bệnh khác nên dễ bị lãng quên, quan tâm Thậm trí triệu chứng tổn thương gan rõ, nhiều bác sĩ lâm sàng không nghĩ đến nguyên nhân sán gan nhỏ Vì vậy, việc chẩn đốn xác định bệnh sán gan nhỏ cần dựa vào xét nghiệm cận lâm sàng [19], [46] Xét nghiệm tìm thấy trứng sán phân dịch tá tràng phương pháp Kato- atz WHO (1994) đưa tiêu chuẩn vàng chẩn đoán xác định Mặc dù vậy, tùy vào giai đoạn nhiễm mức độ đào thải trứng qua phân mà xét nghiệm trứng phân bỏ sót, khơng phát được, độ nhạy khơng cao (chỉ khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm kỹ thuật viên, dễ nhầm lẫn trứng loài sán gan nhỏ với trứng sán ruột nhỏ [46] Chẩn đoán sinh học phân tử sử dụng gen đích ITS1, ITS2 DNA ty thể với kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán gan nhỏ O viverrini hay C sinensis cho độ nhạy độ đặc hiệu cao [18], [20], [24] Tuy chưa áp dụng rộng rãi giá thành cao kỹ thuật phức tạp, hạn chế thực phòng xét nghiệm trang bị nghèo nàn [11] Gần đây, với đời số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic, việc ứng dụng phát triển kỹ thuật đẳng nhiệt phát nhanh ký sinh trùng gây bệnh đơn giản hóa thêm bước Trong kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng (LAMP-Loop-Mediated Isothermal Amplification) sử dụng phổ biến Hơn nữa, với khả phát trực tiếp sản phẩm phản ứng LAMP, không cần điện di ưu điểm trội phương pháp này, giúp đơn giản hóa rút ngắn thời gian phân tích [4],[19], [37] Ở Việt Nam, đến chủ yếu sử dụng phương pháp xét nghiệm Kato- atz để phát nhiễm sán gan nhỏ, chưa có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP phát sán gan nhỏ Clonorchis sinensis người Do vậy, thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác định nhiễm sán gan nhỏ Clonorchis sinensis người” với mục tiêu: Thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP để phát nhiễm sán gan nhỏ Clonorchis sinensis người Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán gan nhỏ Clonorchis sinensis mẫu phân thu thập từ người bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt ộ Y tế, (2004), Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh sán gan nhỏ, sán phổi, sán dây bệnh ấu trùng sán lợn Nguyễn Văn Đề, P.V.T (2012), Ký sinh trùng Y học Giáo trình đào tạo ác sỹ đa khoa, NX Y học, Hà Nội Lê Quang Huấn Hoàng Phú Hiệp (2011), " ỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) hướng việc tạo it phát nhanh bệnh truyền nhiễm", Tạp chí khoa học công nghệ, 90 (02), tr 43-48 Lê Quang Huấn Hoàng Phú Hiệp (2011), " ỹ thuật LAMP (Loopmediated isothermal amplification) cho việc phát nhanh xác vi khuẩn Escherichia coli O157:H7", Tạp chí sinh học 34 (03), tr 343346 Hồng TT, V.L (2006), "Điều tra nhiễm Strongyloides stercoralis phương pháp cấy nghiệm phân cải tiến xã Phú Hịa Đơng, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 7/2006 đến tháng 12/2006",Y học TP Hồ Chí Minh,tr 39-41 Huỳnh Hồng Quang, (2018),"Nghiên cứu ứng dụng quan kỹ thuật LAMP chẩn đoán phát tác nhân gây bệnh truyền nhiễm", http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn Đặng Thị Cẩm Thạch, Đ.T.D (2008), "Tình hình nhiễm sán người xã Nghĩa Phú Nghĩa Lạc, huyện Nghĩa Hưng , tỉnh Nam Định, 2007",Tạp chí Phịng chống bệnh Sốt rét bệnh Ký sinh trùng, 1,tr 47-53 Phạm Văn Trọng, ed P.V.D.H laus rickeberg, Nguyễn Văn Sơn (2014), Dịch tễ học chìa khóa dự phịng,NX Y học, Hà Nội Viện Sốt rét –Ký sinh trùng- Côn trùng trung ương (2013), “Cẩm nang xét nghiệm chẩn đoán giun sán”NXB Y học, Hà Nội 10 Viện sốt rét - Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương (2015), áo cáo tổng kết cơng tác phịng chống sốt rét, ký sinh trùng-côn trùng năm 2015 triển khai kế hoạch năm 2016 Tiếng Anh 11 Apt W, A.X., Vega F, Miranda C, Zulantay I, Perez C, Gabor M, Apt P (1995), "Treatment of human chronic fascioliasis with triclabendazole: 56 drug efficacy and serologic response",The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 52(6), pp 532-535 12 Bena G, J.M., Olivieri I I, Lejeune B (1998), "Ribosomal External and Internal Transcribed Spacers: Combined Use in the Phylogenetic Analysis of Medicago (Leguminosae)",Journal of Molecular Evolution, 46(3), pp 299-306 13 Bouvard V, B.R., Straif K, Grosse Y, Secretan B, El Ghissassi F, Benbrahim-Tallaa L, Guha N, Freeman C, Galichet L, Cogliano V; WHO International Agency for Research on Cancer Monograph Working Group (2009), "A review of human carcinogens Part B: biological agents",The Lancet Oncology, 10(4), pp 321–322 14 Cai XQ, X.M., Wang YH, Qiu DY, Liu GX, Lin A, Tang JD, Zhang RL, Zhu XQ (2010), "Sensitive and rapid detection of Clonorchis sinensis infection in fish by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)",Parasitology Research, 106(6), pp 1379-1383 15 Cai XQ, L.G., Song HQ, Wu CY, Zou FC, Yan HK, Yuan ZG, Lin RQ, Zhu XQ (2012), "Sequences and gene organization of the mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis (Trematoda)",Parasitology Research, 110(1), pp 235-243 16 Cai XQ, Y.H., Bai JS, Tang JD, Hu XC, Chen DH, Zhang RL, Chen MX, Ai L, Zhu XQ (2012), "Development of a TaqMan based real-time PCR assay for detection of Clonorchis sinensis DNA in human stool samples and fishes",International Journal for Parasitology, 61(1), pp 183-186 17 Chen MX, A.L., Zhang RL, Xia JJ, Wang K, Chen SH, Zhang YN, Xu MJ, Li X, Zhu XQ, Chen JX (2011), "Sensitive and rapid detection of Paragonimus westermani infection in humans and animals by loopmediated isothermal amplification (LAMP)",Parasitology Research, 108(5), pp 1193-1198 18 Chen Y, W.T., Lai DH, Wen YZ, Wu ZD, Yang TB, Yu XB, Hide G, Lun ZR (2013), "Development and evaluation of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of Clonorchis sinensis from its first intermediate hosts, freshwater snails",Parasitology, 140(11), pp 1377-1383 57 19 Craw P, B.W (2012), "Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review",Lab on a Chip, 12(14): pp 2469-2486 20 DR, H (1992), "Homing in on helminths",The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 46(6), pp 626-634 21 Gab-Man Park, T.-S.Y., Kyung-il Im, Kyu-Je Lee (2000), "Isozyme electrophoresis patterns of the liver fluke, Clonorchis sinensis from Kimhae, Korea and from Shenyang, China",The Korean Journal of Parasitology, 38(1), pp 45-48 22 Goto M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K (2009), "Colorimetric detection of loopmediated mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue", BioTechniques 46(3), pp 167-172 23 H, Y (1965), "The life cycle of Clonorchis sinensis: a comment on the presentation in the seventh edition of Craig and Faust's Clinical Parasitology",Journal of Parasitology, 51(6): pp 961-966 24 Halliday KE, O.G., Turner EL, Njagi K, Mcharo C, Kengo J, Allen E, Dubeck MM, Jukes MC, Brooker SJ (2014), " Impact of intermittent screening and treatment for malaria among school children in Kenya: a cluster randomised trial",PLOS Medicine, 11(1): pp e1001594 25 Hassan MM, S.M., Hegab MH, Metwally S (2001), "Evaluation of circulating Fasciola antigens in specific diagnosis of fascioliasis",Journal of the Egyptian Society of Parasitology, 31(1), pp 271-279 26 Hong ST, F.Y (2012), "Clonorchis sinensis and clonorchiasis, an update",International Journal for Parasitology, 61(1), pp 17-24 27 Huang SY, T.J., Song HQ, Fu BQ, Xu MJ, Hu XC, Zhang H, Weng YB, Lin RQ, Zhu XQ (2012), "A specific PCR assay for the diagnosis of Clonorchis sinensis infection in humans, cats and fishes",Parasitology International, 61(1), pp 187-190 28 Jitra Waikagul, U.T (2014), Approaches to Research on the Systematics of Fish-Borne Trematodes Academic Press 29 Johnston, D.A., et al (1993), "Small subunit (18S) ribosomal RNA gene divergence in the genus Schistosoma",Parasitology, 107 ( Pt 2): pp 14756 58 30 Komiya, Y (1976), Clonorchis and Clonorchiasis Advances in Parasitology, ed B Dawes Vol London: Academic Press 31 Le TH, N.N., Truong NH, De NV (2012), "Development of mitochondrial loop-mediated isothermal amplification for detection of the small liver fluke Opisthorchis viverrini (Opisthorchiidae; Trematoda; Platyhelminthes)",Journal of Clinical Microbiology, 50(4), pp 11781184 32 Lesage B, V.A., Emiliani S, Debaisieux L, Englert Y, Liesnard C (2006), "Development and evaluation of a qualitative reverse-transcriptase nested polymerase chain reaction protocol for same-day viral validation of human immunodeficiency virus type ribonucleic acid in processed semen",Fertility and Sterility, 86(1), pp 121-128 33 Lun ZR, G.R., Lai DH, Li AX, Zhu XQ, Yu XB, Fang YY (2005), "Clonorchiasis: a key foodborne zoonosis in China",The Lancet Infectious Diseases, 5(1): pp 31-41 34 Mori Y, N.K., Tomita N, Notomi T (2001), "Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation",Biochemical and Biophysical Research Communications, 289(1), pp 150-154 35 Müller B, S.J., Mehlhorn H (2007), "Sensitive and species-specific detection of Clonorchis sinensis by PCR in infected snails and fishes",Parasitology Research, 100(4), pp 911-914 36 Nolan MJ, C.T (2005), "The use and implications of ribosomal DNA sequencing for the discrimination of digenean species",Advances in Parasitology, 60, pp 101-163 37 Notomi T, O.H., Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000), "Loop-mediated isothermal amplification of DNA",Nucleic Acids Research, 28(12), pp E63 38 Parvathi, A., et al (2007), "Clonorchis sinensis: development and evaluation of a nested polymerase chain reaction (PCR) assay",Exp Parasitol, 115(3), pp 291-5 39 Rahman SMM, S.H., Jin Y, Oh JK, Lim MK, Hong ST, Choi MH (2017), "Application of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay 59 targeting cox1 gene for the detection of Clonorchis sinensis in human fecal samples",PLOS Neglected Tropical Diseases, 11(10), pp e0005995 40 Rim Hl, L.S., Seo BS (1973), "Studies on the epidemiology and clinical aspects on clonorchiasis in Korea",Mew Med J (Seoul) 16, pp 81-91 41 Shekhovtsov SV, K.A., Romanov KV, Besprozvannykh VV, Fedorov KP, Yurlova NI, Serbina EA, Sithithaworn P, Kolchanov NA, Mordvinov VA (2009), "A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, and Clonorchis sinensis (Opisthorchiidae, Trematoda)",Parasitology Research, 106(1), pp 293297 42 Tomita N, M.Y., Kanda H, Notomi T (2008), "Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products",Nature Protocols, 3(5), pp 877-882 43 Torres-Machorro, A.L., et al "Ribosomal RNA genes in eukaryotic microorganisms: witnesses of phylogeny?",FEMS Microbiol Rev, 34(1), pp 59-86 44 Ui-Wook Hwang, W.K (1999), "General properties and phylogenetic utilities of nuclear ribosomal DNA and mitochondrial DNA commonly used in molecular systematics",The Korean Journal of Parasitology, 37(4), pp 215-228 45 VA Mordvinov, А.M., NV Ravin, SV Shekhovtsov, SА Demakov, АV Katokhin, NA Kolchanov, KG Skryabin (2009), "Complete Sequencing of the Mitochondrial Genome of Opisthorchis felineus, Causative Agent of Opisthorchiasis",Acta Naturae, 1(1): pp 99-104 46 WHO (1994) “Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites” World Health Organization, Geneva Switzerland 47 Wongratanacheewin S, P.W., Sermswan RW, Pipitgool V, Maleewong W (2002), "Detection of Opisthorchis viverrini in human stool specimens by PCR",Journal of Clinical Microbiology, 40(10), pp 3879-3880 60 PHỤ LỤC QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) XÁC ĐỊNH NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ Clonorchis sinensis TRÊN NGƢỜI MỤC ĐÍCH Quy trình hướng dẫn thực xét nghiệm chẩn đoán xác định nhiễm sán gan nhỏ C sinensis người kỹ thuật LAMP PHẠM VI ÁP DỤNG Mẫu phân người nghi ngờ nhiễm trứng sán gan nhỏ, mẫu sán gan nhỏ trưởng thành Tại Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương NGUYÊN TẮC Kỹ thuật LAMP sử dụng mồi thiết kế để nhận biết vùng đặc hiệu gen ty thể nad1 sán gan nhỏ C sinensis với xúc tác enzym Bst DNA polymerase thành phần khác cần thiết cho phản ứng ADN tổng số sử dụng làm khuôn cho phản ứng LAMP tách chiết từ phân người nghi ngờ nhiễm trứng sán gan nhỏ từ sán gan nhỏ trưởng thành…Phản ứng LAMP ủ điều kiện đẳng nhiệt 630C thời gian 60 phút Kết kỹ thuật LAMP đọc mắt thường với chất thị màu HN thêm vào trước phản ứng LAMP 4.1 CHUẨN BỊ Nhân lực Cán đào tạo, thành thạo kỹ thuật LAMP: tối thiểu 01 người 4.2 - Trang phục bảo hộ Trang phục bảo hộ y tế: 05 bộ; Khẩu trang y tế: 05 chiếc; Dép phủ kín mũi chân: 05 đôi; Găng tay không bột talc: 10 đôi 4.3 Hóa chất, vật tƣ - Qiagen DNA Stool mini Kit - PBS 1X - Chelex 100-10% - Proteinase K 10X ThermoPol Buffers (chứa 2mM MgSO4) MgSO4 (100 mM) - dNTP Mix (10 mM) Mồi CS-nad1-F3/B3 (2 µM) Mồi CS-nad1-FIP/BIP (16 µM) - Bst DNA polymerase (320 U/ml) HNB (2,5 mM) - Nước khử ion 4.4 - Thiết bị Máy lắc vortex có tốc độ tối đa 3000 vịng/phút: 01 chiếc; Máy li tâm mini spin, đĩa li tâm sử dụng ống 2ml tốc độ tối đa 10.000 vòng/phút: 01 chiếc; - Máy ủ nhiệt cài đặt chu trình nhiệt độ 630C thời gian 60 phút, 800C thời gian 05 phút: 01 4.5 - Dụng cụ Bộ micropipette thể tích từ 0,1-2,5l; 0,1-10l; 0,5- 20l; 10-100l; 20200l; 100-1000l; - Giá đựng mẫu chứa ống 1,5 ml, ống 0,2 ml; Ống nhựa 1,5 ml (sạch, không chứa DNase RNase); Ống nhựa ml (sạch, không chứa DNase RNase); Ống PCR 0,2 0,5ml (sạch, không chứa DNase RNase); Đầu tip thể tích khác (sạch khơng chứa DNase Rnase); út đánh dấu; - Găng tay không bột talc; hay đựng đá bào 4.6 - Mẫu phân tích Mẫu phân nghi ngờ nhiễm sán gan nhỏ Mẫu sán gan nhỏ trưởng thành Chứng dương: ADN tái tổ hợp 10-9 ng/µl Chứng âm: Nước khử ion 5.1 CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH Tách ADN 5.1.1 Tách ADN tổng số từ mẫu phân - Xử lý mẫu: Các mẫu phân thu từ người dân bảo quản -200 lấy để tan đá Cân khoảng 180 - 220 mg phân vào ống nhựa mL rửa lần mL dung - dịch PBS 1X với tốc độ li tâm mẫu 8.000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch nổi, thu phần cặn lắng sử dụng để tách ADN Tách ADN: Sử dụng kít QIAamp DNA Stool Mini it theo hướng dẫn nhà sản xuất 5.1.2 Tách ADN tổng số từ sán trưởng thành - Xử lý mẫu: Lấy 01 sán gan nhỏ bảo quản cồn 70% -200C vào ống Eppendorf 1,5 mL Rửa sán lần mL dung dịch PBS 1X tốc độ li tâm 10.000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch thêm vào 20µL nước cất khử ion vào mẫu, dùng chầy nhựa nghiền mẫu đến thành hỗn - dịch đồng Tách ADN: + Thêm 20 µL proteinase K vào ống mẫu, trộn mẫu máy lắc vortex, ủ mẫu máy lắc ủ nhiệt khơ 560C, tốc độ lắc 900 vịng/phút 60 phút + Thêm mL dung dịch PBS pha 1% saponin, trộn mẫu máy lắc vortex, để ống mẫu nhiệt độ phòng 20 phút Ly tâm ống mẫu với tốc độ 13.000 vòng/phút phút, loại bỏ dịch + Hút mL dung dịch PBS cho vào ống mẫu, trộn mẫu máy lắc vortex, ly tâm ống mẫu với tốc độ 13.000 vịng/phút phút Loại bỏ hồn tồn dịch hút dịch sang ống + Thêm vào 100 µL dung dịch chelex-100 10% Ủ mẫu máy lắc nhiệt 990C, tốc độ lắc 900 vòng/phút/10 phút Ly tâm ống mẫu với tốc độ 10.000 vòng/phút phút Hút dịch vào ống Eppendorf 1,5 mL sạch, bảo quản -20 độ để sử dụng cho PCR LAMP 5.2 - Thực phản ứng LAMP Trộn hỗn hợp phản ứng LAMP + Làm tan đá ống hóa chất (ngoại trừ enzym Bst DNA Polymerase), trộn ly tâm nhanh Giữ ống hóa chất khay đá bào khay giữ lạnh + Lấy số ống nhựa 0,2 ml tương ứng với số mẫu cần phân tích, cộng thêm 01 ống cho mẫu chứng âm, 01 ống cho mẫu chứng dương + Trộn hỗn hợp phản ứng LAMP với thể tích tương ứng bảng Bảng Thành phần hóa chất có phản ứng LAMP tổng thể tích 25 µl Th nh phần STT Thể tích cho phản ứng (µl) 10X ThermoPol Buffers (chứa 2mM MgSO4) 2,5 MgSO4 (100 mM) 1,5 dNTP Mix (10 mM) 3,5 Mồi CS-nad1-F3/B3 (2 µM) 2,5 Mồi CS-nad1-FIP/BIP (16 µM) 2,5 Bst DNA polymerase (320 U/ml) HNB (2,5 mM) Nước khử ion 6,5 Tổng 21 + Thêm µl nước khử ion vào ống chứng âm, µl ADN tách chiết vào ống mẫu có ký hiệu tương ứng, µl ADN chứng dương vào ống chứng dương - Chạy phản ứng LAMP máy ủ nhiệt Điều kiện nhiệt độ phản ứng: 650C 60 phút, 800C phút ĐỌC VÀ GHI CHÉP KẾT QUẢ Kết phản ứng LAMP ghi nhận khi: Mẫu chứng âm: Dung dịch ống phản ứng có màu xanh tím than Mẫu chứng dương: Dung dịch phản ứng có màu xanh da trời - Mẫu phân tích có kết dương tính: Dung dịch phản ứng có màu xanh da trời - Mẫu phân tích có kết âm tính: Dung dịch phản ứng có màu xanh tím - than Ghi chép kết vào biểu mẫu phân tích XỬ LÝ TÌNH HUỐNG TT Tình Xử lý - Có thể bị tạp nhiễm, loại bỏ kết Dung dịch ống chứng âm có màu xanh da trời xét nghiệm - Thực lại xét nghiệm, kiểm tra bước tiến hành để xác định nguồn gốc tạp nhiễm - Không ghi nhận kết xét nghiệm - Kiểm tra chương trình nhiệt cài đặt Dung dịch ống chứng dương máy, điều kiện bảo quản hóa chất, khơng có màu xanh da trời, hạn sử dụng, lặp lại xét nghiệm có màu khác thường - Có thể có chất ức chế phản ứng LAMP: tinh lại ADN để loại bỏ chất ức chế, thực lại phản ứng LAMP - QUẢN LÝ CHẤT LƢỢNG Đảm bảo tuân thủ đầy đủ quy định xử lý khu vực bàn thí nghiệm trước sau xét nghiệm Ghi chép đầy đủ trình thực xét nghiệm vào biểu mẫu Nếu xảy các tượng bất thường báo cho quản lý kỹ thuật quản lý chất lượng đơn vị để xử lý ĐIỀU KIỆN AN TOÀN Đảm bảo đầy đủ sử dụng bảo hộ lao động q trình thực thí nghiệm Khi bị cố đổ vỡ hóa chất bắn vào người xử lý theo quy định an tồn sinh học phịng thí nghiệm 10 - THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid deoxyribonucleic - dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphase - HNB: Hydroxyl Naphthol Blue LAMP: Loop-Mediated Isothermal Amplification PBS: Phosphate buffer Saline 11 TÀI LIỆU THAM KHAO Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N & Hase, T (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic acids research, 28(12), pp e63–e63 Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N & Kanda, H (2015) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects Journal of Microbiology, 53(1), pp 1–5 QIAgen (2014) QIAamp DNA Stool Mini Kit Handbook Phụ lục Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kit LAMP chẩn đoán sán gan nhỏ Clornorchis sinensis KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM MẪU PHÂN BẰNG KỸ THUẬT KATO-KATZ, Real time PCR VÀ LAMP TT Mã số Tuổi Giới Địa 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0008 0009 0011 0014.1 0014.2 0014.3 0014.4 0020 0023 0024 0037 0038 0039.1 0039.2 0039.3 0039.4 0042 0059 0062.1 0062.2 0062.3 0062.4 0069 0072 0085 0087 0088 0095 29 58 38 60 60 60 60 45 38 51 49 40 40 40 40 40 44 55 31 31 31 31 31 45 56 60 57 36 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm 12 xóm xóm xóm xóm Cƣờng Kato-Katz độ nhiễm (số trứng) /gram phân 48 40 72 55 1.328 55 1.328 55 1.328 55 1.328 72 64 40 144 40 91 2.176 91 2.176 91 2.176 91 2.176 72 72 88 2.104 88 2.104 88 2.104 88 2.104 64 10 240 11 272 136 32 104 Real time PCR LAMP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 0098 0107 0122 0126 0129 0138 0140 0145 0146.1 0146.2 0146.3 0147 0149.1 0149.2 0149.3 0149.4 0152 0157 0167 0173 0188 0189 0192 0199 0203 0207 0217 0227 0233 0236 0238 0239 0241 0243 0245 0251 55 35 41 58 29 60 56 37 52 52 52 43 36 36 36 36 44 41 41 49 37 45 47 30 58 59 48 35 37 18 34 54 30 56 58 58 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 xóm xóm 13 xóm xóm xóm xóm 10 xóm 10 xóm 10 xóm 10 xóm 10 xóm 10 xóm 10 xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm 11 xóm 12 xóm xóm xóm xom 12 xóm xóm xom 12 xóm xom 13 xóm 12 xóm 12 xóm xóm 10 12 46 46 46 102 102 102 102 4 12 13 2 5 5 128 240 128 296 112 40 96 168 1.104 1.104 1.104 48 2.448 2.448 2.448 2.448 96 32 56 72 16 96 296 168 48 144 304 48 40 40 112 120 120 128 88 80 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 0253 0255 0291 0300 0301 0301 0301 0301 0302 0016 0058 0060 0061 0063 0064 0065 0066 0068 0071 0073 0074 0075 0076 0077 0078 0079 0081 0083 0084 0086 0089 0091 0092 0093 0094 0096 49 34 33 39 35 35 35 35 60 60 60 55 60 54 57 30 53 51 36 50 41 50 18 59 36 41 27 36 51 55 47 56 48 40 39 60 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm 12 xóm 12 xóm 12 xóm xóm xóm xóm xóm 12 xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm xóm 41 11 48 48 48 48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 104 976 144 264 1.160 1.160 1.160 1.160 160 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 ... để phát nhiễm sán gan nhỏ, chưa có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP phát sán gan nhỏ Clonorchis sinensis người Do vậy, thực đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để chẩn đoán xác. .. định nhiễm sán gan nhỏ Clonorchis sinensis người? ?? với mục tiêu: Thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP để phát nhiễm sán gan nhỏ Clonorchis sinensis người Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu quy trình kỹ. .. KHOA HỌC TỰ NHIÊN ********** HOÀNG THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP ĐỂ CHẨN ĐỐN XÁC ĐỊNH NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ Clonorchis sinensis TRÊN NGƢỜI Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm