các giống cacao

các giống cacao

Phần 3Vật liệu và phương pháp nghiên cứu3.1.Vật liệu3.1.1.Các giống cacao thí nghiệmCác dòng cacao thí nghiệm bao gồm:• 13 dòng cacao thương mại (được liệt kê ở bảng 3.1) được trồng tại vườn sưu tập giống cacao, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.• 8 dòng cacao CT bao gồm: CT1, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8 và CT9 được trồng tại 2 vườn giống cacao ở tỉnh Cần Thơ.Ngoài ra còn có ba giống cacao: trồng tại vườn sưu tập giống cacao, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, được chọn để so sánh kết quả phân tích với Ngân hàng cacao thế giới.Cách thức lấy mẫu như sau:• Giống ở gần phòng thí nghiệm (13 dòng cacao thương mại và 3 giống AMAZ15/15, NA33 và PA107): chúng tôi lấy mẫu lá tại vườn và đem về phòng thí nghiệm để ly trích DNA ngay. Vì chúng tôi quan sát thấy lá cacao nếu lưu trữ lâu quá 24 giờ, cho dù trong tủ -20oC, sẽ xuất hiện nhiều đốm nâu trên bề mặt lá làm ảnh hưởng đến chất lượng DNA ly trích.• Giống ở xa phòng thí nghiệm (8 dòng cacao CT): mẫu lá sau khi lấy được giữ lạnh và chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ để ly trích DNA ngay.Trên mỗi cây, chúng tôi chọn các lá tươi, có màu xanh thẫm nhưng không quá già, cũng không chọn những lá non vì chúng chứa nhiều nhựa rất khó li trích, ngoài ra lá phải không có dấu hiệu bị sâu bệnh hay côn trùng tấn công. Các mẫu lá được trữ trong tủ -20oC cho đến khi tiến hành ly trích.Những cây chọn để lấy mẫu lá (mỗi giống chọn 2 cây) được cột dây nylon màu để đánh dấu. 35 Bảng 3.1: Các dòng cacao thương mại khảo sát.Sồ thứ tự Tên thương mại Tên dòng Nguồn gốc12345678910111213TD1TD2TD3TD5TD6TD7TD8TD9TD10TD11TD12TD13TD14BAL209BAL244 BR25 KKM 225 PBC123 PBC154 PBC157 PBC159 PBC230 PBC236 QH1213 QH22 QH441 MalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysiaMalaysia36 3.1.2.Hóa chất thí nghiệm3.1.2.1.PrimerTổng hợp kết quả nghiên cứu về 15 cặp primer microsatellite để kiểm tra tính đồng nhất di truyền của cacao do tổ chức USDA và Đại Học Pennsylvania State, Mỹ, thực hiện (xem phần 2.6.1 và 2.6.2), chúng tôi chọn ra 5 cặp primer để phát hiện các trình tự microsatellite nằm trên 5 nhiễm sắc thể (NST) khác nhau trên genome của cacao (Ingenic Newsletter No.9, 2004).Năm cặp primer này cho các đoạn khuếch đại có tính đa hình cao giữa các giống cacao (xem bảng 2.1) do đó có thể cho kết quả phân biệt rõ giữa các dòng cacao khảo sát.Các primer có chiều dài từ 18-20bp, primer forward ở mỗi primer được đánh dấu bằng màu huỳnh quang ở đầu 5’, do công ty Applied-Biosystem, Mỹ, tổng hợp. Bảng 3.2: Các primer microsatellite dùng trong thí nghiệmTên Màu hùynh quangTrình tự microsatellite Vị trí trênTa (oC)Trình tự khuếch đạiHình 3.1: Lấy mẫu lá cacao tại vườn Hình 3.2: Đánh dấu cây được chọn37 NSTmTcCIR7 mTcCIR8 mTcCIR11mTcCIR15 mTcCIR18Xanh dươngXanh lá câyVàngĐỏXanh dương5’-6FAMATGCGAATGACAACTGGT-3’ GCTTTCAGTCCTTTGCTT 5’-VICCTAGTTTCCCATTTACCA-3’ TCCTCAGCATTTTCTTTC5’-NEDTTTGGTGATTATTAGCAG-3’ GATTCGATTTGATGTGAG5’-PETCAGCCGCCTCTTGTTAG-3’ TATTTGGGATTCTTGATG5’-6FAMGATAGCTAAGGGGATTGAGGA-3’ GGTAATTCAATCATTTGAGGATA792145146464651(GA)11(TC)5 TT(TC)17TTT(CT)4(TC)13(TC)19(GA)123.1.2.2.Các hóa chất dùng trong ly trích DNA• Dịch trích DNA (extraction buffer EB), 100mL EB bao gồm of 2g CTAB, 28mL 5M NaCl, 20mL 0.5M Tris-HCl, 4mL 0.5M EDTA, 1mL Mercapto ethanol, nước cất 2 lần khử ion đã hấp khử trùng. • TE buffer, bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1mM EDTA (pH 8.0).• CIA, bao gồm 24V chloroform: 1V isoamylalcohol.• Isopropanol.• Sodium acetate.• Ethanol 70% and 96%.• RNase.• Low-salt TE (10 mM Tris-HCl , 1mM EDTA [pH 8.0]).3.1.2.3.Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR• 10X PCR buffer (do công ty BioRad cung cấp).• 25mM MgCl2 (do công ty BioRad cung cấp).• 10mM dNTP’s (do công ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp).• Taq DNA polymerase (do công ty BioRad cung cấp)38 • Primer (do công ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp).• DNA mẫu (ly trích từ lá cacao).• H2O cất 2 lần, siêu lọc, hấp khử trùng.3.1.2.4.Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự• Sản phẩm PCR.• Chất làm biến tính DNA: Hidi Formamide• Chất chuẩn để xác định kích thước của các peak (size standard). • Polymer pop 6-ABI.• Buffer.3.1.3.Trang thiết bị thí nghiệm• Chén sứ và chày giã (Đức)• Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ)• Cân phân tích 4 số (Ohaus - Mỹ)• Máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc).• Pipet các loại (Nichiryo –Nhật).• Đầu típ các loại (Đức)• Máy ly tâm lạnh (Hettich –Đức).• Máy luân nhiệt (Biorad –Thụy Điển).• Máy điện di (Cosmo Bio Co. –Nhật).• Máy chụp ảnh DNA (Biorad –Mỹ).• Lò Viba (Electrolux –Thụy Điển).• Máy định ôn (Memmert –Đức).• Tủ lạnh các loại (Sanyo –Nhật).• Máy giải trình tự ABI 3100 (Applied Biosystem-Mỹ)• Mao quản 36cm (Applied Biosystem-Mỹ)39 3.2.Phương pháp3.2.1.Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là DNA được ly trích từ lá của 21 dòng cacao khảo sát. Từ DNA tổng số thu được, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu các al có chứa các trình tự microsatellite đặc trưng cho từng dòng.3.2.2.Bố trí thí nghiệm Đề tài được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. Thời gian từ tháng 3/20005 đến tháng 8/2005 gồm 4 giai đoạn chính như sau:• Giai đoạn 1: Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao dựa trên 5 cặp primer microsatellite mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 và mTcCIR18. Phương pháp nhận diện gồm 4 bước: 1- Lấy mẫu lá của 21 dòng cacao. 2- Tiến hành li trích DNA3- Thực hiện phản ứng PCR với 5 primer. 4- Phân tích sản phẩm PCR thu được trên máy giải trình tự DNA. Dùng phần mềm Gene Mapper để đọc kết quả phân tích các đoạn microsatellite của mỗi dòng. Ghi nhận dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao với 5 primer.• Giai đoạn 2: Kiểm tra độ chính xác và tính ổn định của phương pháp nhận diện.qua 2 bước: 1. Thu nhận mẫu lá của 13 dòng cacao thương mại cũng từ vườn giống cacao tại Đại Học Nông Lâm, 13 dòng này đã được người lấy mẫu mã hoá tên giống dưới dạng: A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14 (các mã số này được giữ kín cho đến khi thu được kết quả cụ thể). Tiến hành các bước phân tích như ở giai đoạn 40 1 thu nhn d liu Microsatellite ca 13 dũng ó mó hoỏ. Nhn din cỏc ging mó húa bng cỏch dựng phn mm Cervus kim tra mc ng nht.2. Chn ti vn ging cacao i Hc Nụng Lõm mt s ging cacao truyn thng ó cú d liu Microsatellite lu tr trong ngõn hng cacao th gii ICGD. Tin hnh phõn tớch cỏc ging truyn thng ny v so sỏnh d liu Microsatellite ca chỳng vi d liu tng ng trờn ngõn hng d liu cacao th gii ICGD. Giai on 3: Ti u húa phng phỏp.Thc hin phn ng multiuplex PCR vi 3 cp primer cú cựng nhit bt cp 46oC v c ỏnh du mu hunh quang khỏc nhau: mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15. Chỳng tụi chn th nghim vi mt s mu cú d liu microsatellite ging nhau trờn 1 cp primer. Giai on 4: Phõn tớch tớnh a dng di truyn ca 21 dũng cacao bng phn mm Genetix da trờn d liu microsatellite vi 5 cp primer.3.2.3.K thut ly trớch DNADNA ca lỏ cacao c ly trớch theo qui trỡnh trong lun vn tt nghip ca Hong Th Liu, 2004, nhng cú thay i tc v thi gian ly tõm cho phự hp vi iu kin mỏy li tõm ti phũng thớ nghim vi tc ti a cho phộp l 12000 vũng/phỳt. 1- Cõn 0.2g lỏ ó ra sch. Cho 1.2ml dch trớch EB vo eppendorf, nghin lỏ vi dung dch ny. Vortex k. 65oC trong 45 phỳt.2- Thờm 500àl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), vortex 10 phỳt, li tõm 7 phỳt 12000 vũng 4oC.3- Chuyn ly dch trong, lp li bc 2.4- Chuyn ly dch trong, thờm vo 0.5 àl RNase, 370C trong 1 gi.5- Thờm vo 250àl Isopropanol lnh. ta -200C khong 30 phỳt (nờn qua ờm).6- Li tõm 7 phỳt 12000 vũng 4oC. b dch trong.7- Cho vo 300àl TE 1X, 370C trong 1 gi.41 8- Thêm 20µl muối Sodium acetate 3M và 640µl Ethanol 96%, trộn đều và để -200C trong 30 phút.9- Ly tâm 12 phút 12000 vòng ở 4oC, đổ bỏ dịch trong.10- Rửa cặn với 400µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 3 phút 12000 vòng ở 4oC, đổ bò dịch trong.11- Lặp lại bước 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 200µl TE 1X, ủ ở 370C trong 45 phút.12- Bảo quản mẫu ở 4oC. Hình 3.3: Giai đoạn nghiền mẫu Hình 3.4: DNA tiếp tục được tinh sạch3.2.4.Kiểm tra định lượng và định tính DNA3.2.4.1. Định tính DNA bằng phương pháp điện diĐể kiểm tra kết quả li trích có thu được DNA hay không, chúng tôi tiến hành điện di các mẫu DNA đã li trích trên gel agarose 1.4%, nấu agarose trong lò viba trong 2.5 phút, 500W . Trộn 4 µl sản phẩm li trích với 2µl loading dye (BioRad). Vận hành máy điện di ở 100V, 250A trong 20 phút. Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 20 phút. Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại (UV). Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.3.2.4.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kếCác mẫu DNA li trích sau khi đã định tính được kiểm tra độ tinh sạch và ước lượng hàm lượng DNA bằng cách đo mật độ quang OD (optical density) với bước sóng 42 260nm và 280nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Hàm lượng DNA được tính theo công thức:DNA (ng/µl) = [(62.9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100DNA được xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.7 đến 2.2.3.2.5.Qui trình phản ứng Microsatellite 3.2.5.1.Phản ứng PCR với 1 cặp primerHiện nay có rất nhiều qui trình PCR microsatellite cho cacao, nhưng chúng tôi chỉ chọn áp dụng qui trình cũng như thành phần hóa chất của Đại Học Reading (Anh Quốc) vì nó phù hợp với trình tự primer tổng hợp.Thứ tự pha trộn mẫu trong phản ứng PCR tuân theo thứ tự được liệt kê ở bảng bên dưới để đảm bảo hiệu quả phản ứng. Sau khi cho Taq polymerase vào phản ứng PCR sẽ bắt đầu xảy ra, do vậy phải nhanh chóng cho vào máy PCR để bắt đầu qui trình phản ứng. Tổng thể tích cho 1 phản ứng PCR là 20µl với thành phần phản ứng như sau: Bảng 3.3: Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCRThành phần Dung dịch gốc Thể tích sử dụng H2O cất hai lầnPCR bufferMgCl2dNTPPrimer mixDNA mẫuTaq polymerase10X25mM1.5mM1pmol/µl50ng/µl5U/µl5.8µl2.0µl1.8µl4.0µl4.0µl2.0µl0.4µlDo các primer sử dụng có nhiệt độ bắt cặp khác nhau, chuyên biệt cho từng loại primer, nên trong mỗi qui trình PCR cần phải điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho từng primer. 43 Bảng 3.4: Qui trình phản ứng PCRChu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian0 94 2 phút1 đến 3594 30 giây51 hoặc 46 30 giây72 2 phút 15 giây36 72 5 phút37 10 1 phút38 4 15 phút3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primerMultiplex PCR rất cần thiết trong nghiên cứu về microsatellite vì nó có thể nghiên cứu nhiều al, nhiều locus có kích thước khác nhau cùng một lúc. Ngày nay với sự phát triển của các chất nhuộm màu huỳnh quang cho phép nghiên cứu cùng lúc những al có kích thước bằng nhau và được gắn các màu huỳnh quang khác nhau.Để phản ứng multiplex PCR cho kết quả tốt, tất cả các locus phản ánh đúng, chính xác thì các primer phải có nhiệt độ bắt cặp gần nhau.Dựa trên thành phần phản ứng PCR với 1 cặp primer, chúng tôi thay thành phần nước bằng thể tích của 2 cặp primer. Do đó tổng thể tích cho 1 phản ứng multiplex PCR là 22.2µl với thành phần phản ứng như sau: Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng multiplex PCRThành phần Dung dịch gốc Thể tích sử dụng PCR bufferMgCl2dNTPPrimer mix 1Primer mix 2Primer mix 4DNA mẫuTaq polymerase10X25mM1.5mM1pmol/µl1pmol/µl1pmol/µl50ng/µl5U/µl2.0µl1.8µl4.0µl4.0µl4.0µl4.0µl2.0µl0.4µl Chúng tôi áp dụng qui trình PCR trên cho phản ứng multiplex PCR với 3 primer mTcCIR8, mTcCIR11 và mTcCIR15có cùng nhiệt độ Ta = 46oC. Ba primer này 44 [...]... mối quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các quần thể và giữa các cá thể trong quần thể dựa trên biểu đồ 3D (3 chiều) Khoảng cách về chiều dài của các al microsatellite chứa thông tin về khoảng cách di truyền giữa các quần thể Hai quần thể càng tách biệt nhau về mặt di truyền thì tần số các al khác nhau càng rõ rệt Những tính toán về khoảng cách di truyền giữa các quần thể có sự giao phối ngẫu nhiên... Cockerham,1984) thông qua giá trị thống kê F Giá trị này xác định mối quan hệ giữa các al của các cá thể và nó liên quan đến hệ số cận huyết Hệ số này có thể đánh giá mối quan hệ không ngẫu nhiên giữa các al trong quần thể, nó cũng đánh giá sự giao phối thân cận giữa các đơn vị dưới quần thể và quần thể Từ 21 dòng cacao khảo sát, căn cứ vào tên giống, chúng tôi có 6 quần thể với dữ liệu microsatellite tương ứng với... 292 290 302 286 305 290 302 305 290 302 305 288 288 48 Chọn các chỉ tiêu phân tích để tìm ra các cá thể có sự đồng nhất di truyền bằng công cụ “Identity Check” trong phần mềm Cervus Dựa trên các chỉ tiêu phân tích này, Cervus sẽ tiến hành kiểm tra tất cả các cá thể và đưa ra dữ liệu của những cặp cá thể có sự đồng nhất về mặt di truyền thỏa mãn các chỉ tiêu đề ra Có 3 chỉ tiêu chính sau:  Số lượng loci... để kiểm tra sự đồng nhất di truyền của các cá thể và tìm ra đời bố mẹ của cá thể dựa trên các chỉ tiêu được lựa chọn Cervus phân tích tần số al dựa trên dữ liệu về kiểu gen của các codominant- loci Dữ liệu đưa vào phân tích ở dạng bảng trong Excel và kết quả phân tích sẽ được xuất ra dưới dạng file text Chúng tôi đưa vào dữ liệu di truyền microsatellite 13 dòng cacao thương mại và 13 mẫu mã hoá (từ... microsatellite 13 dòng cacao thương mại và 13 mẫu mã hoá (từ A2 đến A14) với 3 primer mTcCIR15, mTcCIR18 và mTcCIR8 để tiến hành phân tích sự đồng nhất của các cá thể dựa trên sự trùng khớp giữa các loci của chúng (matching loci), từ đó chúng tôi sẽ định danh được các mẫu mã hoá Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả dựa trên dữ liệu microsatellite của 3 loci đã loại trừ những allele dropping (xem trang 57) Mỗi... Có 3 chỉ tiêu chính sau:  Số lượng loci phân tích  Số lượng loci đồng nhất tối thiểu  Số loci sai khác cho phép Chúng tôi dựa trên kết quả kiểm tra và nhận diện các cặp cá thể có sự đồng nhất di truyền do Cevus phân tích để định danh các mẫu mã hóa Do đó việc định danh sẽ chính xác và khách quan 3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm Genetix Genetix là một phần mềm tiếng... phân tích kích thước al chứa trình tự microsatellite Máy sẽ tiến hành điện di và phân tách các sản phẩm PCR bên trong mao quản Kết quả được phân tích tự động dựa trên số liệu trong bin set do công ty Master Food cung cấp Bin set là một tập tin dạng text, chứa đầy đủ thông tin về kích thước và độ tin cậy của các al tương ứng với mỗi loại primer, 5 bin set của 5 loại primer sau khi được thiết lập trong... 2.5 phút, 500W Trộn 2 µl sản phẩm PCR với 2µl loading dye (BioRad) Vận hành máy điện di ở 100V, 250A trong 15 phút Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút Các mẫu khác nhau nhưng được khuếch đại bởi cùng loại primer có băng điện di rất giống nhau nên không thể phân biệt được trên gel điện di agarose, cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự DNA 3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng... microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix 49 Biểu đồ 3.1: 6 quần thể với số lượng cá thể Biểu đồ 3.2:5 primer với số lượng al tương ứng tương ứng Bảng 3.9: Kích thước các al phân tích với mỗi loại primer 50 Bảng 3.10: Số lượng các al phân tích của mỗi quần thể với từng loại primer ... nhất) Hình 3.5: Đĩa bơm mẫu Hình 3.6: Lắp cappilary vào máy  Một số sản phẩm PCR được tinh sạch để so sánh hiệu quả phân tích giữa 2 nghiệm thức: tinh sạch và không tinh sạch Qui trình tinh sạch gồm các bước sau: - Bước 1: Hút 2.5µl EDTA 125mM và 60µl Ethanol 100% Đảo nhẹ ống và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút - Bước 2: Li tâm 12000 vòng trong 30 phút ở 4oC - Bước 3: Hút bỏ dịch trong - Bước 4: . liệu3.1.1 .Các giống cacao thí nghiệmCác dòng cacao thí nghiệm bao gồm:• 13 dòng cacao thương mại (được liệt kê ở bảng 3.1) được trồng tại vườn sưu tập giống cacao, . Minh.• 8 dòng cacao CT bao gồm: CT1, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8 và CT9 được trồng tại 2 vườn giống cacao ở tỉnh Cần Thơ.Ngoài ra còn có ba giống cacao: trồng