Thông tin tóm tắt về những đóng góp mới của luận văn thạc sĩ: Phân lập, xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)

Các kết quả của luận văn đã thực hiện đƣợc những mục tiêu đề ra là phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập đƣợc từ quả và thân Sa nhân tí[r]

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

Nguyễn Thị Thu Minh

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ LỒI

SA NHÂN TÍM (AMOMUM LONGILIGULARE T.L.WU)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

Nguyễn Thị Thu Minh

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI

SA NHÂN TÍM (AMOMUM LONGILIGULARE T.L.WU)

Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : Hƣớng dẫn : TS Nguyễn Hải Đăng

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây cơng trình nghiên cứu riêng dƣới hƣớng dẫn khoa học TS Nguyễn Hải Đăng Các kết thu đƣợc luận văn hồn tồn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tồn trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Lời cảm ơn

Luận văn đƣợc hoàn thiện Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Trong q trình nghiên cứu, tác giả nhận đƣợc nhiều giúp đỡ quý báu từ thầy cô, nhà khoa học nhƣ đồng nghiệp

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Hải Đăng ngƣời thầy hƣớng dẫn tận tình, chu đáo tạo điều kiện giúp đỡ thời gian thực luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán phòng Tổng hợp hữu - Viện Hóa sinh biển giúp đỡ tạo điều kiện hỗ trợ tơi suốt q trình làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ Học viện Khoa học Công nghệ, Ban lãnh đạo viện Hóa sinh biển tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn

Cuối cùng, xin cảm ơn đề tài nghiên cứu bản: Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng viêm, đánh giá tác dụng đích sinh

học phân tử số loài thuộc chi Amomum Mã số 104.01-2017.307

TS Nguyễn Hải Đăng làm chủ nhiệm, hỗ trợ để thực thành công luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả

Danh mục kí hiệu chữ viết tắt

Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải

13

C-NMR Carbon -13 nuclear magnetic resonance spectroscopy

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13

1

H-NMR Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton

CC Column chromatography Sắc ký cột CD3OD Tetradeuteromethanol (Methanol-d4)

CDCl3 Deuterochloroform (Chloroform-d) CH2Cl2 Dichloromethane

COSY 1H-1H- correlation spectroscopy 1Phổ tƣơng tác hai chiều H-1H

DEPT Distortionless enhancement by

polarization transfer Phổ DEPT EtOAc Ethyl acetate

HMBC Heteronuclear mutiple bond correlation Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

HSQC Heteronuclear single quantum Correlation

Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua liên kết

IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% IL Interleukin

iNOS Inducible nitric oxide synthase LPS Lipopolysaccharide

MeOH Methanol

MS Mass spectrometry Phổ khối lƣợng MTT

3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide NO Nitric oxide

NOESY Nuclear overhauser enhancement

spectroscopy Phổ NOESY TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u s: singlet d: doublet t: triplet m: multiplet brs: broad singlet

Danh mục bảng

Bảng 3.1 Số liệu phổ

H-NMR hợp chất AL1 chất tham khảo (*) [25] 30 Bảng 3.2 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR hợp chất AL2 chất tham khảo (*) [26] 31 Bảng 3.3 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR hợp chất AL4 chất tham khảo (*) [28] 33 Bảng 3.4 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR hợp chất AL3 chất tham khảo (*) [27] 34 Bảng 3.5 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR hợp chất AL5 chất tham khảo (*) [29] 36 Bảng 3.6 Số liệu phổ

H, 13C-NMR AL6 chất tham khảo (*) [30] 38 Hình 3.12 Cấu trúc hợp chất AL7 số tƣơng tác HMBC 38 Bảng 3.7 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR AL7 chất tham khảo [31] 40 Bảng 3.8 So sánh phổ

Danh mục hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1 Sa nhân tím (a - Thân quả, b – Cây non Sa nhân tím)

Hình 2.1 Cây Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) 16

Hình 3.1 Sơ đồ tạo cặn chiết thân Sa nhân tím 23

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ cặn dichloromethane thân Sa nhân tím 24

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ cặn ethyl acetate thân Sa nhân tím 25

Hình 3.4 Sơ đồ tạo cặn chiết Sa nhân tím 26

Hình 3.5 Sơ đồ phân lập chất từ cặn methanol Sa nhân tím 27

Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất AL1 29

Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất AL2 30

Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất AL3 31

Hình 3.9 Cấu trúc hợp chất AL4 32

Hình 3.10 Cấu trúc hợp chất AL5 số tƣơng tác phổ HMBC 35

Hình 3.11 Cấu trúc hợp chất AL6 tƣơng tác HMBC COSY 36

Hình 3.12 Cấu trúc hợp chất AL7 số tƣơng tác HMBC 38

Hình 3.13 Cấu trúc hợp chất AL8 41

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) 42 Hình 3.15 Kết đánh giá khả ức chế sản sinh NO gây độc tế bào hợp chất (%UC: % ức chế sản sinh NO, %CS: % sống sót tế bào) 44 Hình PL1 Phổ

H-NMR chất AL1 PL-2 Hình PL2 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL1 PL-2 Hình PL3 Phổ

H-NMR chất AL2 PL-3 Hình PL4 Phổ 13

C-NMR chất AL2 PL-3 Hình PL5 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL2 PL-3 Hình PL6 Phổ

H-NMR chất AL3 PL-4 Hình PL7 Phổ

H-NMR giãn chất AL3 PL-4 Hình PL8 Phổ 13

Hình PL9 Phổ DEPT chất AL3 PL-5 Hình PL10 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL3 PL-5 Hình PL11 Phổ

H-NMR chất AL4 PL-6 Hình PL12 Phổ

H-NMR giãn chất AL4 PL-6 Hình PL13 Phổ 13

C-NMR chất AL4 PL-7 Hình PL14 Phổ HSQC hợp chất AL4 PL-7 Hình PL15 Phổ HMBC hợp chất AL4 PL-8 Hình PL16 Phổ HMBC giãn hợp chất AL4 PL-8 Hình PL17 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL4 PL-8 Hình PL18 Phổ

H-NMR chất AL5 PL-9 Hình PL19 Phổ

H-NMR giãn chất AL5 PL-9 Hình PL20 Phổ 13

C-NMR chất AL5 PL-10 Hình PL21 Phổ HSQC chất AL5 PL-10 Hình PL22 Phổ HMBC chất AL5 PL-11 Hình PL23 Phổ HMBC giãn chất AL5 PL-11 Hình PL24 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL5 PL-12 Hình PL25 Phổ

H-NMR chất AL6 PL-12 Hình PL26 Phổ

H-NMR giãn chất AL6 PL-13 Hình PL27 Phổ

H-NMR giãn chất AL6 PL-13 Hình PL28 Phổ 13

Hình PL39 Phổ

H-NMR chất AL7 PL-19 Hình PL40 Phổ

H-NMR giãn chất AL7 PL-20 Hình PL41 Phổ 13

C-NMR chất AL7 PL-20 Hình PL42 Phổ DEPT chất AL7 PL-21 Hình PL43 Phổ HMBC chất AL7 PL-21 Hình PL44 Phổ HMBC giãn chất AL7 PL-22 Hình PL45 Phổ HMBC giãn chất AL7 PL-22 Hình PL46 Phổ HSQC chất AL7 PL-23 Hình PL47 Phổ HSQC giãn chất AL7 PL-23 Hình PL48 Phổ NOESY chất AL7 PL-24 Hình PL49 Phổ NOESY giãn chất AL7 PL-24 Hình PL50.Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL7 PL-25 Hình PL51 Phổ

H-NMR hợp chất AL8 PL-25 Hình PL52 Phổ

H-NMR giãn hợp chất AL8 PL-26 Hình PL53 Phổ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ LỒI SA NHÂN TÍM (Amomum longiligulare T.L.Wu)

1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố

1.1.2 Công dụng chủ trị

1.1.3 Các nghiên cứu nƣớc Sa nhân tím

1.1.3.1. Thành phần hóa học

1.1.3.2. Hoạt tính sinh học

1.1.4 Các nghiên cứu nƣớc Sa nhân tím 11

1.1.4.1. Nghiên cứu thành phần hóa học 11

1.1.4.2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học 12

1.2 GIỚI THIỆU VỀ KHÁNG VIÊM 13

1.2.1 Giới thiệu trình viêm 13

1.2.2 Các yếu tố tham gia vào trình viêm 15

CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 16

2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 16

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 17

2.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng phân lập xác định cấu trúc hợp chất 17

2.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng xác định hoạt tính kháng viêm 17

2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Phƣơng pháp phân lập hợp chất 18

2.2.1.1 Phương pháp chiết xuất 18

2.2.1.2 Phương pháp phân lập 18

2.2.2 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất 19

2.2.2.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 19

2.2.2.2 Phổ khối lượng MS 19

2.2.2.3 Độ quay cực [α] 20

CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 23

3.1.1 Chiết xuất phân lập hợp chất từ thân Sa nhân tím 23

3.1.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ Sa nhân tím 25

3.2 THƠNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC 28

3.2.1 Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid 28

3.2.2 Hợp chất AL2: Methyl ferulate 28

3.2.3 Hợp chất AL3: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one 28

3.2.4 Hợp chất AL4: 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propan-1-one 28

3.2.5 Hợp chất AL5: 4,4’-dihydroxy chalcone 28

3.2.6 Hợp chất AL6: Nootkatone 28

3.2.7 Hợp chất AL7: 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone 29

3.2.8 Hợp chất AL8: 7-epi-α-cyperone 29

3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 29

3.3.1 Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid 29

3.3.2 Hợp chất AL2: Methyl ferulate 30

3.3.3 Hợp chất AL3: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one 31

3.3.4.Hợp chất AL4: 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propan-1-one 32

3.3.5 Hợp chất AL5: 4,4’-dihydroxy chalcone 35

3.3.6 Hợp chất AL6: Nootkatone 36

3.3.7 Hợp chất AL7: 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone 38

3.3.8 Hợp chất AL8: 7-epi-α-cyperone 40

3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP ĐƢỢC 43

4.1 KẾT LUẬN 46

4.2 KIẾN NGHỊ 46

MỞ ĐẦU

Việt Nam nƣớc nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng phong phú Theo ƣớc tính, nƣớc ta có khoảng 13.000 lồi thực vật bậc cao có khoảng 4.000 lồi đƣợc sử dụng làm thuốc Do đa dạng thành phần chủng loại, nguồn dƣợc liệu Việt Nam đƣợc sử dụng rộng rãi y học cổ truyền để chữa trị nhiều bệnh, nhiều thuốc đƣợc khoa học đại chứng minh giá trị chữa bệnh chúng Xu hƣớng nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ dƣợc liệu, từ loài thực vật thu hút quan tâm nhà khoa học độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển hóa thể so với dƣợc phẩm tổng hợp

Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc chi Sa nhân

(Amomum), họ Gừng (Zingiberaceae) dƣợc liệu quý, có giá trị kinh tế

cao, đƣợc sử dụng làm thuốc chữa trị bệnh đƣờng ruột, hô hấp, xƣơng khớp Ngồi ra, Sa nhân tím cịn có tác dụng làm dịu đau nhức răng, chống viêm, kháng khuẩn, có tác dụng an thai chữa số bệnh phụ nữ Sa nhân tím đƣợc sử dụng làm thuốc, làm gia vị tinh dầu chiết xuất đƣợc ứng dụng lĩnh vực y học, dƣợc phẩm, công nghệ thực phẩm

Là dƣợc liệu quý có khả ứng dụng rộng rãi nên Sa nhân tím đƣợc nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Các nghiên cứu nƣớc thành phần hóa học hoạt tính sinh lồi Amomum longiligulare

cho thấy tiềm vô lớn phát triển dƣợc chất thiên nhiên có hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn,…Tuy nhiên, nghiên cứu nƣớc ta tập trung vào đánh giá thành phần tinh dầu, nghiên cứu nhóm hợp chất khác cịn Hơn nữa, đánh giá hoạt tính sinh học lồi Sa nhân tím chƣa đầy đủ, chƣa có nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng viêm gây độc tế bào lồi Do vậy, nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá hoạt động kháng viêm Sa nhân tím

Amomum longiligulare có ý nghĩa khoa học thực tiễn, nghiên cứu cung

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đề tài luận văn: “Phân lập, xác định cấu trúc đánh giá khả kháng viêm hoạt chất phân lập từ lồi sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)” đƣợc thực với mục tiêu cụ thể sau:

- Phân lập đƣợc số hợp chất từ lồi Sa nhân tím (Amomum

longiligulare T.L.Wu), xác định đƣợc cấu trúc hợp chất

CHƢƠNG TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ LỒI SA NHÂN TÍM (Amomum longiligulare

T.L.Wu)

Sa nhân tím hay cịn gọi Sa nhân lƣỡi dài, sa ngần, mề tré bà, tên khoa học (Amomum longiligulare T.L.Wu), thuộc chi Sa nhân (Amomum), họ Gừng (Zingiberaceae) [1]

1.1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố

Đặc điểm thực vật

Sa nhân tím loại thân thảo sống lâu năm, cao 1,5 – 2,5 m Thân rễ mọc bò lan mặt đất Lá mọc so le thành hai dãy, hình mác, dài 23 – 30 cm, rộng – cm, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt bóng, lƣỡi bẹ mỏng, xẻ đôi; cuống dài – 10 mm

Cụm hoa mọc từ thân rễ thành bơng, có – hoa màu trắng; bắc ngồi hình bầu dục, màu nâu, bắc dạng ống; dài 1,5 cm, có nhọn; tràng hình ống dài 1,3 – 1,5 cm, chia thùy, mặt ngồi có lơng thƣa, thùy hình trứng ngƣợc, hai thùy bên hẹp; cánh mơi gần trịn, đƣờng kính – 2,6 cm, lõm, mép màu vàng, có sọc đỏ, đầu cánh môi xẻ hai thùy nhỏ gập phía sau, khơng có nhị lép, nhị dài bao phấn; bầu hình trụ trịn, phình giữa, có lơng trắng

Quả hình cầu, màu tím, đƣờng kính 1,3 – cm, mặt ngồi có gai ngắn, chia ô Hạt màu nâu sẫm, cứng Khối lƣợng hạt tƣơng đối nhỏ, có – 24, hạt có áo, đƣờng kính – mm [1], [2], [3]

a [3] b [3]

Phân bố

Sa nhân tím có vùng phân bố từ đảo Hải Nam (Trung Quốc), đến vùng Trung Lào Việt Nam Ở Việt Nam, Sa nhân tím phân bố tập trung tỉnh Tây Nguyên Những điểm có nhiều Sa nhân tím huyện M′Đrắc (Đăk Lăk), An Khê K′Bang (Gia Lai), Vĩnh Thạch (Bình Định), Sơng Hinh (Phú Yên), Ba Tơ (Quãng Ngãi)…Ở Sa nhân tím mọc tƣơng đối tập trung xen lẫn với loài Sa nhân trắng diện tích rừng lớn Ở tỉnh phía Bắc nhƣ Phú Thọ, Thái Bình, Hịa Bình, Hải Dƣơng, Sa nhân tím mọc với trữ lƣợng trạng thái mọc hoang trồng vƣờn [1]

Thu hoạch

Sa nhân tím có hoa gần nhƣ quanh năm, sinh gốc sau năm tuổi Ở vụ chính, hoa tháng 3, già vào khoảng tháng – Vụ phụ bắt đầu khoảng tháng 7, già vào tháng 11 Thời điểm thu hoạch tốt vỏ chuyển sang màu vàng nhƣng rắn Lúc này, hạt dễ tách, màu vàng có chấm đen nâu, vị chua, cay nồng [1]

1.1.2 Công dụng chủ trị

Quả Sa nhân tím có vị cay, tính ấm, mùi thơm vào kinh tỳ, vị, thận Có tác dụng hành khí, tán hàn, tán thấp, khai vị, tiêu thực, kích thích tiêu hóa Quả Sa nhân tím đƣợc dùng trị bụng trƣớng đau, đầy bụng, ăn không tiêu; tả, lỵ lạnh; nôn mửa, nghẹn nấc, chống viêm, có tác dụng an thai…Trong thực phẩm, Sa nhân tím đƣợc dùng làm gia vị, chế rƣợu mùi [1], [4]

Hạt Sa nhân tím phơi khơ, giã thành bột, chấm vào chỗ đau, ngâm rƣợu cho đặc ngậm có tác dụng chữa đau nhức [1]

1.1.3 Các nghiên cứu nƣớc Sa nhân tím

1.1.3.1. Thành phần hóa học

Thành phần tinh dầu

Thành phần tinh dầu hạt Sa nhân tím (1,7-3%) chứa borneol (9) 19%, D-camphor 33%, bornyl acetate 26,5%, D-limonene 7%, α-phellandrene (10) 2,3%, α-pinene 1,8%, linalool (11) [3]

Thành phần tinh dầu Sa nhân tím bao gồm α-pinene (1), β-pinene (2), 1,8-cineole (3), p-cymene (4), limonene (5), camphene (6), bornyl acetate (7) camphor (8) [8]

Nhóm hợp chất flavonoid

Nhóm nghiên cứu Hao Ying cộng xác định 17 hợp chất Sa nhân tím kỹ thuật sắc ký cao tốc ngƣợc dòng sắc ký lỏng cao áp Các hợp chất đƣợc phát chủ yếu thuộc nhóm flavonoid diarylheptanoid [6] Các hợp chất flavonoid đƣợc xác định bao gồm: 3,5-dihydroxy-7,4′-dimethoxyflavone (12), 3,5,3′-trihydroxy-7,4′-dimethoxyflavone (13), 3,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavone (14),

Nhóm hợp chất diarylheptanoid

Nhóm nghiên cứu Hao Ying cộng xác định hợp chất diarylheptanoid Sa nhân tím kỹ thuật sắc ký cao tốc ngƣợc dòng sắc ký lỏng cao áp, bao gồm: 3-hydroxy-7-(4′′-hydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl) heptane (19), 1,5-epoxy-7-(3′′,4′′-di3-hydroxy-7-(4′′-hydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl)-1-(4′- 1,5-epoxy-7-(3′′,4′′-dihydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl) heptane (20), 3,5-dihydroxy-7-(4′′-hydroxy-3′′-methoxyphenyl)-1-(3′,4′-dihydroxyphenyl) heptane (21), 7-(4′′-hydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl)-5-hepten-3-one (22), 7-(4′′-hydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl)-3-heptanone (23), 3,5-dihydroxy-7-(4′′-hydroxyphenyl)-1-(3′,4′-dihydroxyphenyl) heptane (24), 7-(3″,4′′-dihydroxyphenyl)-1-(4′-hydroxyphenyl)-5-hepten-3-one (25), 3,5-diacetoxy-7-(3′′,4′′-dihydroxyphenyl)-1-(3′,4′-dihydroxyphenyl) heptane (26) Trong đó, hợp chất 20, 22 25 hợp chất diarylheptanoid Sa nhân tím [6]

Các hợp chất khác

4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone (30), 4-methoxybenzoic acid (31), sitosterol (33) đƣợc Liu Jin Peng cộng phân lập từ Sa nhân tím [7]

30

32

31

1.1.3.2. Hoạt tính sinh học

Hoạt tính kháng khuẩn

Sa nhân tím có hoạt tính chống oxy hóa [5], [7] Lin Dong cộng đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cặn chiết từ Sa nhân tím thơng qua hoạt động thu dọn gốc tự DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) OH Các cặn chiết ethanol, dichloromethane, ethyl acetate Sa nhân tím thể tính hoạt tính thu dọn gốc tự DPPH với giá trị IC50 lần lƣợt 58,53; 51,69 43,49 µg/mL mạnh so với cặn chiết ete dầu hỏa (IC50 = 259,05 µg/mL) cặn chiết n-butanol (IC50 = 2463,68 µg/mL) [7] Cặn chiết ethyl acetate, dichloromethane thể hoạt tính quét gốc tự OH● với giá trị IC50 0,79 0,75 mg/mL [5]

Nghiên cứu Liu Jin Peng cộng đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập đƣợc từ lồi Sa nhân tím Trong đó, hợp chất flavonoid (11-13) hợp chất diphenylheptane (20), (21), (24), (25), (27-30) thể hoạt tính chống oxy hóa [7]

Hoạt tính tăng cường hoạt động hooc môn ostrogen

Theo nghiên cứu Hao Ying cộng sự, hợp chất diarylheptanoid đƣợc phân lập từ Sa nhân tím đóng vai trị quan trọng hoạt động tăng cƣờng hoocmon kiểm soát sinh sản phát triển ngƣời [6]

Tác dụng chống viêm, giảm đau

Các thành phần tinh dầu Sa nhân tím thể hoạt tính kháng viêm, giảm đau, tiềm điều trị bệnh tiêu hóa [5], [9]

α-pinene, β-pinene, 1,8-cineole, p-cymene, limonene, camphene, bornyl acetate camphor thành phần tinh dầu Sa nhân tím [8] Wu X cộng đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm bornyl actetate chuột thí nghiệm Kết nghiên cứu cho thấy bornyl actetate có tác dụng giảm đau, kháng viêm, làm giảm phản ứng quằn quại acetic acid gây giảm đau mô hình gây đau nóng chuột, giảm sƣng tai dimethylbenzene chuột [10]

α-pinene đƣợc báo cáo cho thấy có vai trị tiềm kiểm soát đau viêm đau nguyên nhân thần kinh gây ra; 1,8-cineole limonene có hoạt tính kháng viêm [11] Đánh giá tác dụng kháng viêm

1,8-cineole liều 100, 200 400 mg/kg cho thấy tác dụng giảm phù chân mức 26%, 26% 46% [11] Juergens cộng nghiên cứu hiệu chống viêm 1,8-cineole việc ức chế sản sinh cytokine Ở nồng độ 0,15 μg/mL, 1,8-cineole ức chế đáng kể trình sản sinh TNF-α (77%), IL-1β (61%) bạch cầu đơn nhân Nghiên cứu khẳng định 1,8-cineole chất ức chế mạnh TNF-α IL-1β, đƣợc đề nghị điều trị lâu dài bệnh hen suyễn, viêm xoang bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính [11]

Nghiên cứu Yuchen Xiao cộng chiết xuất từ Sa nhân tím giảm tổn thƣơng niêm mạc dày chuột chế liên quan đến cải thiện biểu TFF1 mức độ protein RNA (có chức bảo vệ niêm mạc khỏi chấn thƣơng, ổn định lớp chất nhầy) [12]

1.1.4 Các nghiên cứu nƣớc Sa nhân tím

1.1.4.1. Nghiên cứu thành phần hóa học

Thành phần tinh dầu

Trần Đình Thắng cộng nghiên cứu thành phần tinh dầu loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare) cho thấy thành phần tinh dầu chủ yếu đƣợc phát từ lá, thân rễ (46, 45 39 hợp chất đƣợc phát lần lƣợt lá, thân rễ) Thành phần tinh dầu tinh dầu từ sa nhân tím β-caryophyllene (26,6%), α-pinene (15,6%), humulene epoxide II (14,8%) α-humulene (12,5%) Các hợp chất tinh dầu chiết xuất từ thân β-caryophyllene (37,4%), α-humulene (16,5%) hexahydrofarmesyl acetone (10,0%) Camphene (15,7%), hexadecanoic acid (10,0%), octadecanoic acid (8,6%) bornyl acetate (7,8%) thành phần tinh dầu từ rễ lồi Sa nhân tím [13]

limonen (9,4%); tinh dầu rễ chủ yếu bornyl acetate (14,6%) α-terpineol (5,2%) [14]

Thành phần hóa học khác

Nghiên cứu thành phần hóa học khác ngồi tinh dầu có nghiên cứu Đỗ Thị Hoa Viên cộng Nghiên cứu phân lập đƣợc ba hợp chất có phần khơng bay hạt Sa nhân tím hai hợp chất thuộc nhóm flavonoid epicatechin (33) quercitrin (quercetin-3-O-

α-L-rhamnopyranoside) (34), hợp chất monoterpene glycoside (+)-angelicoidenol-2-O-β-D-glucopyranoside (35) Ngoài ra, nghiên cứu xác định đƣợc hạt Sa nhân tím có chứa saponin-steroid với hàm lƣợng 0,63%, tanin; 15 nguyên tố đa lƣợng vi lƣợng, đáng kể nguyên tố sắt, kẽm, mangan, kali, canxi, natri, photpho magie [15]

1.1.4.2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Tinh dầu Sa nhân tím có tác dụng kháng khuẩn [1], [3], [6], [11] Tinh dầu Sa nhân tím có khả kháng khuẩn tƣơng tự sa nhân trắng: ức chế hoạt động loại vi khuẩn theo thứ tự hoạt tính giảm Bacillus subtillis, Bacillus mycoides, Dipcoccus pneumoniae, Mycobacterrium tuberculosis, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi có tác dụng diệt amip Entamoeba moshkowskii [1]

aureus Khả kháng khuẩn kháng nấm tinh dầu Sa nhân tím mạnh so với chất đối chứng [6]

Phân đoạn bay hạt Sa nhân tím (chiết dung mơi dichloromethane) có hoạt tính chống oxy hóa có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chủng: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Candida stellatoides, Candida albicans Cladosporium curcumerinum

Phân đoạn không bay (đƣợc chiết với methanol sau chiết với dichloromethane) có tác dụng chống oxy hóa tác dụng kháng nấm hai chủng vi khuẩn Escherichia coli Staphylococcus aureus [6]

Hợp chất (+)-angelicoidenol-2-O-β-D-glucopyranoside (34) đƣợc phân

lập từ Sa nhân tím có tác dụng kháng nấm hai chủng Cladosporium

cucumerinum Candida albicans [6]

Hoạt tính chống oxy hóa

Nghiên cứu Đỗ Thị Hoa Viên phân đoạn bay hạt Sa nhân tím (chiết dung mơi dichloromethane) có hoạt tính chống oxy hóa [6]

Nhƣ vậy, nghiên cứu Sa nhân tím (Amomum longiligulare

T.L.Wu) chƣa nhiều Các nghiên cứu nƣớc ta chủ yếu tập trung vào thành phần tinh dầu, nghiên cứu thành phần khác Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học Sa nhân tím cịn ít, chƣa có nghiên cứu hoạt động kháng viêm

Thực đánh giá sơ hoạt tính kháng viêm dịch chiết từ Sa nhân tím cho kết dịch chiết Sa nhân tím thể hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO tƣơng đối mạnh (ức chế 75% 93% nồng độ thử 30 µg/mL 100 µg/mL) Do vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng viêm lồi Sa nhân tím (Amomum longiligulare

T.L.Wu) cần thiết, mở khả phát hoạt chất tiềm

Viêm đƣợc coi chế phòng vệ sinh lý chủ yếu, giúp thể chống lại nhiễm trùng, bỏng, hóa chất độc hại, chất gây dị ứng kích thích độc hại khác Q trình gây viêm thƣờng kèm theo triệu chứng sƣng, nóng đỏ đau mạch máu giãn nở, đƣa nhiều máu tế bào bạch cầu đến nơi tổn thƣơng Viêm khơng kiểm sốt đƣợc nhƣ yếu tố dẫn đến bệnh mãn tính Hiện nay, thuốc kháng viêm giảm đau thuốc thuộc dòng nacotics, thuốc khơng thuộc dịng steroid corticosteroid Hầu nhƣ tất loại thuốc có tác dụng phụ

Trong trình viêm, tế bào đƣợc kích hoạt (bạch cầu trung tính, bạch cầu toan, thực bào đơn nhân đại thực bào) tiết lƣợng lớn nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) cytokine tiền viêm nhƣ IL-1β, IL-6, TNF-α để giúp tiêu diệt gây ức chế tăng trƣởng vi sinh vật xâm nhập mô ung thƣ Lipopolysaccharide thành phần màng tế bào vi khuẩn Gram âm Nó kích hoạt đại thực bào tiết cytokine tiền viêm chất trung gian gây viêm nhƣ NO Sự sản sinh NO đƣợc điều khiển nitric oxide synthase (NOS), bao gồm nitric oxide synthases cảm ứng (iNOS), nitric oxide synthases nội bào (eNOS) nitric oxide synthases thần kinh (nNOS) NO đƣợc sinh từ trình chuyển hóa L-Arginine thành L-citruline, xúc tác iNOS Tuy nhiên việc sản sinh nhiều hợp chất không gây tổn thƣơng mô tế bào, mà nguyên nhân quan trọng gây bệnh thấp khớp viêm gan mãn tính [16]

iNOS COX-2 phƣơng tiện quan trọng để đánh giá hiệu hoạt chất kháng viêm

1.2.2 Các yếu tố tham gia vào trình viêm

Đại thực bào: tế bào bạch cầu có vai trị quan trọng hệ miễn dịch không đặc hiệu nhƣ hệ miễn dịch đặc hiệu động vật có xƣơng sống Khi đại thực bào đƣợc hoạt hóa diện tác nhân gây bệnh nhƣ vi khuẩn, endotoxin, leukotrien… giải phóng loạt cytokine Đại thực bào sản xuất loại cytokine 1, 6, 12, IL-18 TNF-α

Nitric oxide: trung gian tiền viêm, phân tử tín hiệu đóng vai

trị quan trọng q trình sinh bệnh viêm NO liên quan đến đáp ứng miễn dịch đại thực bào kích hoạt cytokine NO nồng độ cao gây chứng viêm mức tình bất thƣờng Do đó, ức chế sản sinh NO yếu tố quan trọng việc điều trị bệnh viêm

Yếu tố nhân kappa B (NF-κB): NF-κB yếu tố mã thiết yếu

kiểm sốt q trình biểu gan mã hóa cytokine tiền viêm trình sinh lý bệnh viêm NF-κB tác động lên gen quy định cytokine, lên chemokine có lợi cho q trình viêm, lên gen quy định thụ thể miễn dịch Trong bệnh lý viêm, Tα kích hoạt yếu tố κB NF-κB thể nhƣ nhân tố điều hòa gen quan trọng gen liên quan đến viêm, nhiễm trùng, đáp ứng miễn dịch bao gồm iNOS, IL-1B, IL-6 TNF-α

Các cytokine: Các cytokine protein tham gia vào phản ứng

CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Mẫu thân Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) đƣợc thu hái Yên Bái vào tháng 10/2018 Mẫu đƣợc định danh TS Nguyễn Thế Cƣờng, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Mẫu tiêu kí hiệu AM-02 đƣợc lƣu giữ Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1 Cây Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) Mô tả đặc điểm thực vật:

Cây thân thảo, cao 1,5 – 2,5 m Thân rễ mọc bò lan mặt đất Lá mọc so le thành hai dãy, hình mác, dài 23 – 30 cm, rộng – cm, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt bóng, lƣỡi bẹ mỏng, xẻ đơi; cuống dài – 10 mm

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu

2.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng phân lập xác định cấu trúc hợp chất

- Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck)

- Silica gel pha thƣờng với kích thƣớc hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh); hạt Diaion HP-20; Sephadex LH-20)

- Thiết bị đo phổ NMR: Phổ 1H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) đƣợc đo máy Brucker Avance 500 MHz (chất chuẩn nội Tetrametyl Silan - TMS) Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

- Thiết bị đo độ quay cực: Máy JASCO P-2000 polarimeter, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

- Thiết bị đo phổ khối lƣợng: Hệ thống LC/MS Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems (Agilent, Mỹ) Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam

- Dụng cụ, thiết bị tách chiết, phân lập: bể rung siêu âm (Daihan Scientific), hệ thống cất quay chân không (Buchi R300), hệ thống hứng mẫu tự động (EYELA fraction collector DC-1200), đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm 365 nm, cột sắc ký, bình triển khai sắc kí dụng cụ thí nghiệm khác

- Hóa chất: dung mơi methanol, n-hexane, ethyl acetate, dichloromethane, acetone, thuốc thử ceri sulphate,

2.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng xác định hoạt tính kháng viêm

Thiết bị, dụng cụ:

- Máy đọc phiến 96 giếng (Bio-Rad Laboratories, Mỹ), bể ổn nhiệt thiết lập nhiệt độ 37oC, buồng đếm hemocytometer, máy đếm tế bào (improved Neubauer), tủ ủ CO2 (MMM Group, Đức), nồi hấp khử trùng, tủ sấy

Hóa chất:

- DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium), RPMI 1640, PBS (phosphate bufferred saline), FBS (Fetal bovine serum, huyết phơi bị), penicillin, streptomycin (Gibco, Mỹ), MTT (Duchefa biochemie, Hà Lan), LPS (Sigma, Mỹ), sulfanilamide (BDH Chemical, Anh), N-alpha-naphthyl-ethylenediamine (BDH Chemical, Anh)

- Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Merck), nƣớc cất lần (máy lọc MilliQ, Merck, Đức), methanol, isopropanol (Merck)

- Chất đối chứng dƣơng Cardamonin đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO

2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phƣơng pháp phân lập hợp chất

2.2.1.1 Phương pháp chiết xuất

Mẫu sau thu hái đƣợc xử lý loại tạp, thái nhỏ phơi khô sấy khô nhiệt độ 50-60ºC đến khơ Sau mẫu đƣợc xay nhỏ thành bột, đƣợc ngâm chiết với dung môi thích hợp để thu cao chiết tổng sau chiết phân bố dung mơi có độ phân cực khác để thu cao chiết phân đoạn bột mẫu đƣợc chiết lần lƣợt dung môi có độ phân cực tăng dần để thu cao chiết phân đoạn

2.2.1.2 Phương pháp phân lập

Sắc ký cột

Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp phụ silica gel pha thƣờng pha đảo, diaion…Chất hấp phụ đƣợc nhồi lên cột (phổ biến cột thủy tinh) Trong sắc ký cột, tỷ lệ quãng đƣờng chất cần tách so với quãng đƣờng đƣợc dung mơi đƣợc gọi Rf, chất có giá trị Rf khác Chính nhờ khác mà ngƣời ta tách đƣợc chất riêng biệt khỏi hỗn hợp

Sắc ký lớp mỏng

dùng thuốc thử dung dịch H2SO4 10%, dung dịch ceri sulphate đƣợc phun lên mỏng, sấy khơ hơ nóng đến màu

Sắc ký lớp mỏng điều chế

Phƣơng pháp dùng để điều chế, thu chất trực tiếp Quá trình thực tƣơng tự sắc ký lớp mỏng sau triển khai xong, soi đèn UV để xác định vết cạo lấy lớp silica gel chứa chất cần điều chế, tiến hành rửa giải để thu chất

2.2.2 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất

Cấu trúc hóa học hợp chất đƣợc xác định dựa sở sử dụng phép xác định thông số vật lý phƣơng pháp đo phổ thiết bị đại đồng thời kết hợp với phân tích tra cứu tài liệu tham khảo Các phƣơng pháp đo đƣợc sử dụng gồm có:

- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR - Phổ khối lƣợng (MS)

- Độ quay cực

2.2.2.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đƣợc đo máy Brucker Avance 500 MHz (chất chuẩn nội Tetrametyl Silan - TMS) Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam

Các kỹ thuật phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đƣợc sử dụng bao gồm:

- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13

C-NMR DEPT

- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY NOESY

2.2.2.2 Phổ khối lượng MS

2.2.2.3 Độ quay cực [α]

Độ quay cực đƣợc đo máy JASCO P-2000 polarimeter Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam

2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm Nguyên tắc đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO:

Hoạt tính kháng viêm đƣợc đánh giá qua tác dụng ức chế sản sinh gốc tự nitric oxide (•NO) Gốc tự •NO đƣợc sản sinh nhiều loại tế bào khác Dạng •NO xuất tiết có mặt tế bào nhƣ đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thƣờng đƣợc sản sinh với lƣợng lớn xuất đáp ứng viêm [22]

Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để xác định gián tiếp •NO đo màu thành phần sản phẩm (nitrte nitrite) Phản ứng đòi hỏi nitrate (NO3

-) đƣợc chuyển thành nitrite (NO2

-) Nitrite đƣợc phát phân tích thơng qua phản ứng tạo phức màu hồng đỏ mẫu thử có chứa NO2

- với thuốc thử Griess (sulfanilamide N-alpha-naphthyl-ethylenediamine môi trƣờng axit) Phƣơng pháp đƣợc thực dòng tế bào đại thực bào RAW264.7

Cách tiến hành:

- Nuôi tế bào: Tế bào RAW264.7 nuôi cấy 37oC môi trƣờng DMEM có bổ sung huyết phơi bị 10% (FBS), 100 U/mL penicillin 100 µg/mL streptomycin tủ nuôi cấy CO2 5% 24

- Sau chúng đƣợc ni cấy giếng phiến 96 với thể tích 200 µL, mật độ x 104

tế bào/giếng Ủ 30 phút 37oC, 5% CO2

- Tế bào đƣợc kích thích với µL LPS (0,1 mg/mL) 24 với có mặt hợp chất thử nhiều nồng độ khác nhau, đƣợc pha sẵn DMSO Ủ 37oC, 5% CO2

- Giếng không đƣợc ủ mẫu mà sử dụng dung dịch pha mẫu, không cho LPS đƣợc coi đối chứng âm Đối chứng dƣơng đƣợc sử dụng Cardamonin

- Phần tế bào lại sau sử dụng để đánh giá khả gây độc tế bào phƣơng pháp MTT

Nguyên tắc đánh giá gây độc tế bào:

Khả gây độc tế bào đƣợc suy từ việc đánh giá khả sống sót tế bào RAW264.7 sử dụng phƣơng pháp MTT Đây phƣơng pháp so màu, đo độ suy giảm màu vàng MTT để đánh giá khả sống sót tế bào Ở tế bào sống, MTT tham gia phản ứng oxi hóa khử với ty thể tế bào tạo thành formazan dạng tinh thể Lƣợng formazan tạo thành đƣợc hồ tan dung mơi hữu (DMSO, isopropanol) đo độ hấp thụ bƣớc sóng 570 mm Khả gây độc tế bào đƣợc suy từ việc đánh giá khả sống sót tế bào [24]

MTT (màu vàng) Formaran (màu tím)

Cách tiến hành:

Phần tế bào lại sau sử dụng để đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO đƣợc bổ sung 20 µL dung dịch MTT (0,5 mg/mL pha PBS), ủ 37oC 5% CO2 Sau hút bỏ hết mơi trƣờng bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan isopropanol Độ hấp thụ đƣợc đo 570 nm

Khả sống sót tế bào CS% (% Cell Survival) đƣợc tính theo công thức:

[

Giá trị CS: khả sống sót tế bào nồng độ ban đầu mẫu thử

OD: giá trị mật độ quang

σ: độ lệch tiêu chuẩn, đƣợc tính theo cơng thức: √ ∑ ̅

Trong đó: xi : giá trị OD giếng i

̅: giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại

Hàm lƣợng nitrite mẫu thí nghiệm đƣợc xác định nhờ vào đƣờng cong NaNO2 đƣợc so sánh % với mẫu đối chứng âm (LPS)

Khả ức chế sản sinh NO đƣợc xác định theo công thức: % Ức chế =

x 100%

Phƣơng pháp xử lý số liệu:

CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

3.1.1 Chiết xuất phân lập hợp chất từ thân Sa nhân tím Thân Sa nhân tím đƣợc sấy khơ, xay nhỏ (1 kg), sau chiết siêu âm với 5L methanol/lần x lần 40o

C, giờ, cất loại dung môi thu đƣợc cặn chiết methanol (30 g) Cặn chiết methanol đƣợc hòa tan nƣớc cất chiết lần lƣợt với dung môi n-hexane (5 lần x 500 mL), dichloromethane (5 lần x 500 mL) ethyl acetate (5 lần x 500 mL) Cất loại dung môi thu đƣợc cặn chiết n-hexane (HAL 3,91 g), cặn chiết dichloromethane (DAL 5,76 g) cặn chiết ethyl acetate (EAL 2,22 g)

Hình 3.1 Sơ đồ tạo cặn chiết thân Sa nhân tím

+ 500 mL ethyl acetate x lần Bột thân Sa nhân tím

(1 kg)

- Chiết siêu âm với 5L methanol 40oC, x lần Cất loại dung môi

Cặn methanol (30 g)

+ 500 mL nƣớc

+ 500 mL n-hexane x lần

Dịch nƣớc Cặn n-hexane

HAL (3,91 g)

+ 500 mL dichloromethane x lần

Cặn dichloromethane DAL (5,76 g)

Cặn ethyl acetate EAL (2,22 g)

Dịch nƣớc

Dịch nƣớc Cất loại dung môi

Cất loại dung môi

Cặn chiết dichloromethane (DAL 5,76 g) đƣợc phân tách cột sắc ký silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAC gradient (100:0 → 0:100, v/v) thu đƣợc phân đoạn nhỏ kí hiệu từ F1 đến F7 Phân đoạn F2 (0,85 g) kết tinh thu đƣợc tinh thể hình kim màu trắng kí hiệu AL1 (420 mg), phần dịch sau kết tinh đƣợc tinh chế tiếp cột Sephadex với hệ dung môi MeOH:CH2Cl2 9:1 thu đƣợc phân đoạn F2.1 đến F2.5 Tiến hành phân tách phân đoạn F2.5 (0,10 g) cột sắc kí silica gel với hệ dung mơi MeOH:CH2Cl2:EtOAC tỉ lệ 50:47:3 (v/v/v) thu đƣợc chất AL2 (11 mg)

Phân đoạn F6 (2,28g) tiến hành phân tách cột Sephadex với dung mơi MeOH sau tinh chế tiếp cột sắc ký silica gel với hệ dung môi n -hexane:CH2Cl2:EtOAC (60:37:3, v/v/v) thu đƣợc chất kí hiệu AL3 (5 mg) AL4 (6 mg)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ cặn dichloromethane thân Sa nhân tím

1, CC, Sephadex LH-20 MeOH

2, CC, Silica gel H:D:E (60:37:3, v/v/v) F1 0,86 g F2 0,85 g F3 0,73 g F5 0,18 g F4 0,23 g F6 2,28 g AL3 (5 mg) Cặn dichloromethane

DAL (5,76 g)

CC, Silica gel

H:E gradient, 100:0 → 0:100, v/v

F7 0,41 g Kết tinh AL1 (420 mg) AL4 (6 mg) CC, Sephadex LH-20

(M:D 9:1 v/v)

F2.1–F2.4 F2.5 (0,10 g)

AL2 (11 mg)

CC, Silica gel

(M:D:E 50:47:3, v/v/v) D: Dichloromethane

Cặn chiết ethyl acetate (EAL 2,22 g) đƣợc tiến hành phân lập sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:acetone gradient từ 100:00:100 (v/v) thu đƣợc 12 phân đoạn, kí hiệu từ F1 đến F12 Phân đoạn F9 (8,5 mg) tinh chế sắc kí lớp mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexane:acetone 9:1 (v/v) thu đƣợc chất AL5 (3 mg)

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ cặn ethyl acetate thân Sa nhân tím 3.1.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ Sa nhân tím Mẫu Sa nhân tím đƣợc sấy khơ, xay nhỏ (1,2 kg), sau chiết siêu âm 40o

C, giời (5L dung môi x3 lần), lần lƣợt với dung môi n -hexane, ethyl acetate, methanol, cất loại dung môi thu đƣợc cặn chiết n -hexane (ALH 5,5 g), cặn chiết ethyl acetate (ALE 8,84 g) cặn chiết methanol (ALM 18,47 g)

F1F8 F9 8,5 mg

Cặn ethyl acetate EAL (2,22 g)

CC, Silica gel

H:A gradient, 100:0 → 0:100, v/v F10F12

TLC điều chế H:A (9:1, v/v) AL5

(3 mg)

H: n-Hexane A: Acetone CC: Sắc ký cột

Hình 3.4 Sơ đồ tạo cặn chiết Sa nhân tím

Cặn chiết methanol đƣợc tiến hành phân lập sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH gradient (100:0→0:100, v/v) thu đƣợc phân đoạn F1 đến F8

Phân đoạn F2 (0,57 g) đƣợc tiến hành sắc kí cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH:CH2Cl2 (9:1, v/v) thu đƣợc phân đoạn F2.1 đến F2.5 Phân đoạn F2.3 tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n -hexane:CH2Cl2 (2:1, v/v), sau chạy mỏng điều chế với hệ dung môi n -hexane:CH2Cl2 (2:1, v/v) thu đƣợc chất AL6 (20 mg)

Tiến hành sắc ký cột silica gel phân đoạn F3 (0,32 g) với hệ dung môi

n-hexane:EtOAc (4:1, v/v) thu đƣợc phân đoạn F3.1 đến F3.6 Phân đoạn Bột Sa nhân tím

(1,2 kg)

Chiết siêu âm với n-hexane 5L/lần 40oC, giờx lần Cất loại dung môi

Cặn n-Hexane ALH (5,5 g)

Bã

Chiết siêu âm với ethyl acetate 5L/lần 40oC, x lần Cất loại dung môi

Cặn ethyl acetate ALE (8,84 g)

Bã

Chiết siêu âm với methanol 5L/lần 40oC, x lần Cất loại dung môi

Cặn methanol ALM (18,47 g)

F3.4 đƣợc tinh chế mỏng điều chế với hệ dung môi n -hexane:CH2Cl2:aceton (60:37:3, v/v/v) thu đƣợc chất AL7 (8 mg)

Phân đoạn F6 (0,23 g) đƣợc tinh chế trên cột sephadex LH-20 với dung môi methanol thu đƣợc phân đoạn F6.1 đến F6.4 Phân đoạn F6.2 (141 mg) đƣợc phân lập cột silica gel với hệ dung môi n -hexane:CH2Cl2:acetone (37:60:3, v/v/v) thu đƣợc chất AL8 (4,2 mg)

Hình 3.5 Sơ đồ phân lập chất từ cặn methanol Sa nhân tím Cặn methanol ALM

(18,3 g)

CC, Silica gel

D:M gradient, 100:0 → 0:100, v/v

F1

0,73 g 0,57 gF2

F4 0,29 g

F5

0,30 g 0,32 gF3 0,47 gF7 0,86 gF8

F6 0,23 g CC, Sephadex LH-20

D:M (9:1, v/v)

F2.1, F2.2 F2.4, F2.5

F2.3 0,20 g CC, Silica gel H:D (2:1, v/v) TLC điều chế H:D (2:1, v/v)

AL6 20 mg

CC, Silica gel H:E (4:1, v/v)

F3.4 18 mg F3.1-F3.3

F3.5, F3.6 F3.3

TLC điều chế H:D:A (60:37:3, v/v/v)

AL7 mg CC: sắc ký cột

TLC: sắc ký lớp mỏng D: Dichloromethane E: Ethyl acetate H: n-Hexane M: Methanol A: Acetone

CC, SephadexLH-20 MeOH

F6.1, F6.3, F6.4 F6.2

141 mg

CC, Silica gel H:D:A

(37:60:3, v/v/v) AL8

3.2 THÔNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC

3.2.1 Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid

Chất rắn màu trắng, công thức phân tử: C10H10O3, M= 178,18 Phổ ESI-MS: m/z 179 [M+H]+

Số liệu phổ

H-NMR xem bảng 3.1 3.2.2 Hợp chất AL2: Methyl ferulate

Chất rắn màu trắng, công thức phân tử: C11H12O4, M = 208,21 Phổ ESI-MS: m/z 209 [M+H]+

Số liệu phổ

H-NMR 13C-NMR xem bảng 3.2

3.2.3 Hợp chất AL3: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one

Chất bột màu vàng, công thức phân tử: C19H16O3, M= 292,33 Phổ ESI-MS: m/z 293 [M+H]+

Số liệu phổ

H-NMR 13C-NMR xem bảng 3.3

3.2.4 Hợp chất AL4: 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propan-1-one

Chất rắn màu trắng, công thức phân tử: C10H12O4, M = 196,07 Phổ ESI-MS: m/z 197 [M+H]+

Số liệu phổ

H-NMR 13C-NMR xem bảng 3.4 3.2.5 Hợp chất AL5: 4,4’-dihydroxy chalcone Chất rắn vơ định hình màu trắng

Công thức phân tử: C15H12O3, M = 240,08 Phổ ESI-MS: m/z 241 [M+H]+

Số liệu phổ

H-NMR 13C-NMR xem bảng 3.5 3.2.6 Hợp chất AL6: Nootkatone

Phổ ESI-MS: m/z 219 [M+H]+ Số liệu phổ

H-NMR 13C-NMR xem bảng 3.6 3.2.7 Hợp chất AL7: 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone Chất dạng dầu không màu, []25D = + 49,6 (CHCl3, c 0,28) Công thức phân tử: C15H22O2, M = 234,34

Phổ ESI-MS: m/z 235 [M+H]+ Số liệu phổ

H-NMR 13C-NMR xem bảng 3.7 3.2.8 Hợp chất AL8: 7-epi-α-cyperone

Chất dạng dầu màu vàng nhạt, []25D = - 175,0 (CHCl3, c 0,6) Công thức phân tử: C15H22O, M = 218,34

Phổ ESI-MS: m/z 219 [M+H]+ Số liệu phổ

H-NMR xem bảng 3.8

3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 3.3.1 Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid

Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất AL1

Bảng 3.1 Số liệu phổ

H-NMR hợp chất AL1 chất tham khảo (*) [25] Vị trí (ppm) (125 MHz, CDCl3) *H (ppm) (100 MHz, CDCl3)

1

2 7,41 (2H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz) 7,43 (2H, d, J = 8,6 Hz) 6,85 (2H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz) 6,87 (2H, d, J = 8,6 Hz)

5 6,85 (2H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz) 6,87 (2H, d, J = 8,6 Hz) 7,41 (2H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz) 7,43 (2H, dd, J = 8,6Hz) 1՛ 7,64 (1H, d, J = 16,0 Hz) 7,66 (1H, d, J = 15,9 Hz) 2՛ 6,30 (1H, d, J = 16,0 Hz) 6,25 (1H, d, J = 15,9 Hz) OCH3 3,81 (3H, s) 3,80 (3H, s)

3.3.2 Hợp chất AL2: Methyl ferulate

Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất AL2

Chất AL2 đƣợc phân lập dƣới dạng chất rắn màu trắng Phổ ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z 209 [M+H]+ Trên phổ 1H-NMR hợp chất AL2 xuất tín hiệu proton vòng thơm hệ ABX δH 7,07 (1H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-6); 7,03 (1H, br.d, J = 2,0 Hz; H-2); 6,92 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); nhóm methoxy δH (ppm) 3,93 (3H, s, OCH3-3); 3,80 (3H, s, OCH3 -3′) Ngồi ra, có tín hiệu doublet proton olefin ở δH 7,62 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-1′), 6,29 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2′), hai proton có số tƣơng tác lớn J = 16,0 Hz chứng tỏ vị trí trans

Trên phổ 13

(bảng 3.2) kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định AL2 methyl ferulate [26]

Bảng 3.2 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR hợp chất AL2 chất tham khảo (*) [26]

Vị trí

AL2

*

C (ppm)

125 MHz,CDCl3 (ppm)

500 MHz, CDCl3

(ppm) 125 MHz, CDCl3

1 127,0 126,9

2 7,03 (1H, d, J = 2,0 Hz) 109,4 109,4

3 148,0 148,0

4 146,8 146,8

5 6,92 (1H, d, J = 8,0 Hz) 114,8 114,8 7,07 (2H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz) 123,1 123,0 1՛ 7,62 (1H, d, J = 16,0 Hz) 145,0 144,9 2՛ 6,29 (1H, d, J = 16,0 Hz) 115,3 115,1

3՛ (C=O) 167,7 167,7

3-OCH3 3,93 (3H, s) 56,0 55,9 3՛-OCH3 3,80 (3H, s) 51,6 51,6

OH 5,84 (1H,s)

3.3.3 Hợp chất AL3: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one

Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất AL3

Trên phổ

H-NMR xuất tín hiệu proton vòng thơm hai hệ A2B2 δH 7,58 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz; H-2′; H-6′); 6,85 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz; H-3′; H-5′); 6,82 (2H, dd, J = 6,5; 2,0 Hz; H-3′′; H-5′′); 7,44 (2H, dd, J = 6,5; 2,0 Hz; H-2′′; H-6′′) Ngoài có tín hiệu proton olefine sp2 có cấu hình trans δH (ppm) 7,68 (1H, d, J = 16,0 Hz; H-1); 7,02 (1H, d, J = 16,0 Hz; H-2); 6,68 (1H, d, J = 15,0 Hz; H-4); 7,57 (1H, dd, J = 15,0; 10,5 Hz; H-5); 7,05 (1H, d, J = 15,5 Hz; H-7)

Trên phổ 13

C-NMR kết hợp với phổ DEPT thấy tín hiệu 19 nguyên tử cacbon 14 nhóm methine sp2, cacbon không liên kết trực tiếp với hydro nhóm cacbonyl phía trƣờng thấp δC (ppm) 191,8 (C-3) Dựa vào liệu phổ NMR (bảng 3.3) kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất AL3 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one [27]

3.3.4.Hợp chất AL4: 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propan-1-one

Hình 3.9 Cấu trúc hợp chất AL4

Hợp chất AL4 đƣợc phân lập dƣới dạng chất rắn màu trắng Phổ ESI-MS cho pic ion giả phân tử proton hóa m/z 197 [M+H]+

Trên phổ 1H-NMR thấy xuất tín hiệu proton vòng thơm hệ ABX δH 7,60 (1H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz; H-6); 7,57 (1H, d, J = 2,0 Hz; H-2); 6,88 (1H, d, J =

8,5 Hz; H-5); tín hiệu singlet nhóm methoxy δH 3,93 (OCH3-3); tín hiệu triplet hai nhóm methylene δH 3,96 (2H, t, J = 6,0 Hz; H-3′); 3,18 (2H, t, J = 6,0 Hz; H-2′)

carbon không liên kết trực tiếp với hydro δC 130,7 (C-1); 149,1 (C-3); 153,4 (C-4) nhóm carbonyl δC 199,8 (C-1)

Phổ HMBC cho thấy tƣơng tác proton vòng thơm δH 7,57 (1H, d, J = 2,0 Hz; H-2) với nhóm carbonyl (δC 199,8), C-3, C-6, C-4; tƣơng tác proton vòng thơm δH 7,60 (1H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz; H-6) với nhóm carbonyl (δC 199,8), C-5, C-4; proton hai nhóm methylene vị trí C-2′, C-3′ có tƣơng tác với nhóm carbonyl (δC 199,8) chứng tỏ nhóm carbonyl gắn trực tiếp vào vị trí C-1՛ Ngồi ra, phổ HSQC cho thấy có tƣơng tác proton nhóm methoxy δC 56,4 (OCH3-3) với carbon không liên kết trực tiếp với hydro δH 149,1 (C-3), chứng tỏ nhóm methoxy gắn trực tiếp vào C-3 Kết hợp liệu phổ nêu so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất AL4 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propan-1-one [28]

Bảng 3.3 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR hợp chất AL4 chất tham khảo (*) [28]

Vị trí

AL4 (ppm)

125 MHz, CD3OD (ppm)

500 MHz, CD3OD

(ppm) 125 MHz, CD3OD

1 130,7 128,6

2 7,57 (1H, d, J = 2,0 Hz) 112,0 110,8

3 149,1 147,2

4 153,4 151,4

5 6,88 (1H, d, J = 8,5 Hz) 115,8 114,6 7,60 (1H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz) 124,7 122,8

1՛ 199,8 196,9

Bảng 3.4 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR hợp chất AL3 chất tham khảo (*) [27]

Vị trí

AL3 *

C (ppm)

100 MHz, acetone- (ppm)

500 MHz, CD3OD

(ppm) 125 MHz, CD3OD

1 7,68 (1H, d, J = 16,0 Hz) 145,1 143,2 7,02 (1H, d, J = 16,0 Hz) 123,3 123,0

3 191,8 189,0

4 6,68 (1H, d, J = 16,0 Hz) 125,4 123,9 7,57 (1H, dd, J = 16,0; 10,5 Hz) 146,0 144,3 6,95 (1H, dd, J = 16,0; 10,5 Hz) 128,5 125,7 7,05 (1H, d, J = 16,0 Hz) 143,7 142,3

1՛ 129,4 128,0

2՛ 7,58 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 130,2 131,5 3՛ 6,85 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 117,0 116,8

4՛ 161,6 160,9

5՛ 6,85 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 117,0 116,8 6՛ 7,44 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 130,2 131,5

1՛՛ 127,7 128,0

2՛՛ 7,44 (2H, dd, J = 6,5; 2,0 Hz) 131,6 130,2 3՛՛ 6,82 (2H, dd, J = 6,5; 2,0 Hz) 116,8 116,4

4՛՛ 160,2 159,9

3.3.5 Hợp chất AL5: 4,4’-dihydroxy chalcone

Hình 3.10 Cấu trúc hợp chất AL5 số tƣơng tác phổ HMBC Hợp chất AL5 thu đƣợc dƣới dạng chất rắn màu trắng Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 241 [M+H]+

Phổ 1H-NMR hợp chất thấy xuất tín hiệu hai cặp proton vịng thơm hệ A2B2 có độ dịch chuyển hóa học δH 7,63 (2H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz; H-2, H-6); 6,90 (2H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz; H-3, H-5); 8,01 (2H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz; H-2', H-6'); 6,86 (2H, dd, J =

2,0; 8,5 Hz; H-3′, H-5′) hai tín hiệu cặp proton olefine 7,73 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-β); 7,59 (1H, d, J = 15,5 Hz; H-α)

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho tín hiệu 15 nguyên tử cacbon có 10 nhóm methine sp2

, cacbon không liên kết trực tiếp với hydro có nhóm cacbonyl phía trƣờng thấp δC 191,1

Bảng 3.5 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR hợp chất AL5 chất tham khảo (*) [29]

Vị trí

AL5 *

C (ppm)

75 MHz, CD3OD (ppm)

500 MHz, CD3OD

(ppm) 125 MHz, CD3OD

1 130,9 129,9

2 7,63 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 131,7 130,3 6,90 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 116,6 115,1

4 161,6 159,9

5 6,90 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 116,6 115,1 7,63 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 131,7 130,3

1՛ 127,9 126,5

2՛ 8,01 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 132,3 130,9 3՛ 6,86 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 117,0 115,6

4՛ 164,3 162,3

5՛ 6,86 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 117,0 115,6 6՛ 8,01 (2H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz) 132,3 130,9

C=O 191,0 189,8

α 7,59 (1H, d, J = 15,5 Hz) 119,6 118,3 β 7,73 (1H, d, J = 15,5 Hz) 145,7 144,4

3.3.6 Hợp chất AL6: Nootkatone

Hình 3.11 Cấu trúc hợp chất AL6 tƣơng tác HMBC COSY

Hợp chất AL6 đƣợc phân lập dƣới dạng chất dầu màu vàng nhạt Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 219 [M+H]+ Trên phổ 1H-NMR thấy xuất tín hiệu proton olefin sp2

(1H, d, J = 1,5 Hz, H-12a); 4,72 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-12b) Ngoài ra, phổ

H-NMR vùng trƣờng cao thấy xuất tín hiệu nhóm methyl

δH 1,74 (3H, s, H-13); 1,11 (3H, s, H-15); 0,96 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-14) proton nhóm -CH2, -CH nằm khoảng δH 1,13-2,53

Phổ 13C-NMR DEPT cho tín hiệu 15 nguyên tử carbon có nhóm methyl δC 14,9 (C-14); 16,9 (C-15); 20,8 (C-13); nhóm methylen sp3 δC 31,7 (C-8); 33,0 (C-6); 42,1 (C-3); 44,0 (C-9); nhóm methylen sp2 δC 109,3 (C-12); nhóm methin sp3 δC 40,4 7); 40,49 (C-4); nhóm methin sp2

δC 124,7 (C-1); carbon không liên kết trực tiếp với hydro δC 39,3 (C-5);149,1 (C-11); 170,5 (C-10) nhóm carbonyl δC 199,6 (C-2)

Phổ COSY chất AL6 thấy có tƣơng tác hệ spin-spin: H-3/H-4 H-6/H-7/H-8/H-9 cho phép xác định chuỗi liên kết từ đến từ C-6 đến C-9 Phổ HMBC cho thấy tƣơng tác xa H-1 với C-3, C-5, C-9; tƣơng tác H-3 với 1, 2, 4, 14; tƣơng tác H-4 với 14, C-15 cho phép xác định đƣợc vòng A Vòng B đƣợc xác định gắn với vòng A vị trí C-5 C-10 dựa vào tƣơng tác HMBC H-9 với C-1, C-8, C-10; tƣơng tác H-8 với C-7, C-9; tƣơng tác H-6 với C-5, C-7, C-8, C-15; tƣơng tác H-7 với C-5 Tƣơng tác proton nhóm methyl CH3-14 với C-3, C-4 C-5 tƣơng tác proton nhóm methyl CH3-15 với C-4, C-5, C-6, C-10 cho phép xác định nhóm methyl CH3-14 gắn vị trí C-4 nhóm methyl CH3-15 gắn vị trí C-5 Tƣơng tác proton nhóm methylen olefin H-12 với C-7, C-13 tƣơng tác proton nhóm methyl CH3-13 với C-7, C-11, C-12 cho phép xác định nhóm isopropenyl gắn với carbon C-7 Hình 3.11 biểu diễn tƣơng tác HMBC COSY hợp chất AL6

Bảng 3.6 Số liệu phổ

H, 13C-NMR AL6 chất tham khảo (*) [30] Vị trí (ppm)

(500 MHz, CD3OD)

(ppm) (125 MHz,CD3OD)

*

C (ppm)

(67,8 MHz,CDCl3) 5,76 (1H, s) 124,7 124,7

2 199,6 199,6

3 2,26 (2H, m) 42,1 42,1

4 2,01 (1H, m) 40,5 40,3

5 39,3 39,3

6a 1,98 (1H, m) 33,0 33,0

6b 1,13 (1H, t, J = 12,5 Hz)

7 2,32 (1H, m) 40,4 40,4

8a 1,92 (1H, m) 31,7 31,6

8b 1,36 (1H, m)

9a 2,53 (1H, m) 44,0 43,9

9b 2,39 (1H, m)

10 170,5 170,5

11 149,1 149,1

12a 4,74 (1H, d, J = 1,5 Hz) 109,3 109,2 12b 4,72 (1H, d, J = 1,5 Hz)

13 1,74 (3H, s) 20,8 20,8

14 0,96 (3H, d, J = 7,0 Hz) 14,9 14,9

15 1,11 (3H, s) 16,9 16,8

3.3.7 Hợp chất AL7: 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone

Hợp chất AL7 đƣợc phân lập dƣới dạng dầu không màu Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 235 [M+H]+

Trên phổ

H-NMR thấy xuất tín hiệu nhóm methyl δH 1,40 (3H, s, H-15), 1,76 (3H, s, H-13); 1,90 (3H, s, H-14) Ở vùng trƣờng thấp thấy xuất tín hiệu nhóm oxymethin δH 4,92 (1H, d, J= 1,5 Hz, H-6), tín hiệu proton thuộc nhóm methylen olefin δH 4,84 (1H, s, Ha-12); 4,40 (1H, s, Hb-12) proton nhóm -CH2, -CH nằm khoảng δH 1,38-2,65

Trên phổ 13

C-NMR DEPT thấy xuất tín hiệu 15 nguyên tử carbon có nhóm methyl δC 10,4 (C-14); 25,8 (C-15); 22,9 (C-13), nhóm methylen sp3 ở δ

C 35,1 (C-9); 18,6 (C-8); 34,2 (C-2); 38,9 (C-1), nhóm methylen sp2 ở δ

C 111,5 (C-12), nhóm methin sp ở δ

C 69,6 (C-6); 47,7 (C-7), carbon không liên kết với hydro nhóm carbonyl δC 198,1 (C-3) Độ chuyển dịch hóa học C-6 (δC 69,6) cho phép dự kiến carbon C-6 gắn trực tiếp với nguyên tử oxy

Phổ HMBC cho phép kết nối mảnh cấu trúc phân tử (Hình 3.12) Trên phổ HMBC cho thấy tƣơng tác proton thuộc nhóm methyl CH3-15 với C-1, C-5, C-9, C-10; tƣơng tác proton thuộc nhóm methyl CH3-14 với C-4 , C-5, C-3 cho phép xác định vị trí nối đơi C-4/C-5 nhóm methyl lần lƣợt gắn vị trí C-4 C-10 Tƣơng tác HMBC proton nhóm methyl CH3-13 với C-7, C-11, C-12, tƣơng tác proton olefinic H-12 với C-7, C-13 chứng tỏ nhóm isopren gắn với C-7

Bảng 3.7 Số liệu phổ

H-NMR, 13C-NMR AL7 chất tham khảo [31]

Vị trí a

H (ppm) 

b

C (ppm) C *,b

(ppm) 1a 1,85 (1H, ddd, J = 15,0; 13,5; 5,0 Hz)

38,9 39,3 1b 1,65 (1H, ddd, J = 13,5; 5,5; 2,0 Hz

2a 2,65 (1H, ddd, J = 15,0; 12,5; 4,5 Hz)

34,2 34,6 2b 2,45 (1H, ddd, J = 15,0; 4,5; 2,0 Hz)

3 198,1 200,5

4 132,2 132,5

5 159,9 160,6

6 4,92 (1H, d, J = 1,5 Hz) 69,6 70,0

7 2,56 (1H, m) 47,7 48,2

8a 2,22 (1H, m)

18,6 19,1 8b 1,55 (1H, m)

9a 1,51 (1H, ddd, J = 5,4; 13,5; 14,0 Hz)

35,1 35,6 9b 1,39 (1H, m)

10 35,0 35,6

11 145,3 145,8

12a 4,84 (1H, s)

111,5 111,9 12b 4,40 (1H, s)

13 1,76 (3H, s) 22,9 23,5

14 1,90 (3H, s) 10,4 10,9

15 1,40 (3H, s) 25,8 26,2

a: 500 MHz, CD3OD; b: 125 MHz, CD3OD, *: chất tham khảo theo TLTK [31]

Hình 3.13 Cấu trúc hợp chất AL8

Hợp chất AL8 đƣợc phân lập dƣới dạng chất dầu màu vàng nhạt Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 219 [M+H]+

Bảng 3.8 So sánh phổ

H-NMR (500MHz, CDCl3) hợp chất AL7, AL8 7-epi-α-cyperone theo tài liệu tham khảo [32]

Vị trí AL7 AL8 7-epi-α-cyperone

1a 1,85 (1H, ddd, J =

15,0; 13,5; 5,0 Hz) 1,85 (1H, m) 1,86 (1H, m) 1b 1,65 (1H, ddd, J =

13,5; 5,5; 2,0 Hz 1,64 (1H, m) 1,66 (1H, m) 2a 2,65 (1H, ddd, J =

15,0; 12,5; 4,5 Hz) 2,54 (1H, m) 2,55 (1H, m) 2b 2,45 (1H, ddd, J =

15,0; 4,5; 2,0 Hz) 2,44 (1H, m)

2,42 (1H, ddd, J = 17,0; 5,0; 2,3 Hz)

6a

4,92 (1H, d, J = 1,5 Hz)

2,36 (1H, m) 2,37 (1H, dd, J = 16,5; 5,0 Hz)

6b 2,90 (1H, brd, J = 16,0 Hz)

2,90 (1H, brd, J = 16,5 Hz)

7 2,56 (1H, m) 2,59 (1H, m, H-7) 2,58 (1H, m, 1H) 8a 2,22 (1H, m) 1,97 (1H, m) 1,92 (1H, dddd, J =

13,6; 13,6; 5,0; 5,0 Hz) 8b 1,55 (1H, m) 1,67 (1H, m) 1,68 (1H, m) 9a 1,51 (1H, ddd, J =

5,4; 13,5; 14,0 Hz) 1,50 (1H, m)

1,52 (1H, ddd, J = 13,6; 13,6; 3,6 Hz) 9b 1,39 (1H, m) 1,34 (1H, m) 1,34 (1H, ddd, J = 13,6;

Phổ

H-NMR hợp chất AL8 đƣợc so sánh với phổ hợp chất AL7 theo bảng 3.8 Theo đó, hợp chất AL8 xuất thêm nhóm methylene đồng thời proton oxymethin so với hợp chất AL7 Dựa vào liệu phổ MS,

H-NMR kết hợp với so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất AL8 7-epi-α-cyperone [32]

Nhƣ vậy, từ phần thân Sa nhân tím, phân lập đƣợc tám hợp chất bao gồm năm hợp chất phenolic ba hợp chất sesquiterpenoid nhƣ hình 3.16

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ Sa nhân tím

3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT SẠCH PHÂN LẬP ĐƢỢC

Các chất đƣợc phân lập từ Sa nhân tím đƣợc khảo sát hoạt tính kháng viêm theo chế ức chế sản sinh NO tế bào đại thực bào chuột RAW264.7 Kết đánh giá sàng lọc hoạt động kháng viêm đƣợc thể bảng 3.9, hình 3.15

Bảng 3.9 Kết thử hoạt tính kháng viêm chất phân lập từ Sa nhân tím dịng tế bào RAW264.7

Tên mẫu Nồng độ (µM) % Ức chế Sai số % Tế bào sống Sai số

Control 100 0,25 100 0,92

LPS 0,42 94,97 0,32

AL1 30 50,0 0,78 87,37 1,46

100 83,8 0,32 84,40 3,67

AL2 30 16,7 1,66 94,13 4,75 100 42,34 0,28 96,57 4,99

AL3 30 82,1 0,12 92,17 1,58

100 91,5 0,20 90,56 1,03

AL4 30 23,3 0,32 93,74 1,00 100 37,6 0,40 91,54 1,45

AL5 30 56,0 0,29 102,06 0,34

100 79,1 0,23 99,93 2,12

Hình 3.15 Kết đánh giá khả ức chế sản sinh NO gây độc tế bào hợp chất (%UC: % ức chế sản sinh NO, %CS: % sống sót tế bào)

Kết đánh giá sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO hợp chất phân lập từ Sa nhân tím cho thấy:

- Ở nồng độ thử nghiệm 30µM:

+ Ba hợp chất AL1 AL5 thể hoạt động ức chế sản sinh NO mức độ trung bình với giá trị % ức chế lần lƣợt 50,0 ± 0,78% 56,0 ± 0,29% Ở nồng độ này, hợp chất AL1, AL5 không gây ảnh hƣởng đến tăng sinh tế bào RAW264.7

+ Hợp chất AL3 thể hoạt động kháng viêm mạnh với giá trị % ức chế 81,2 ± 0,12%, đồng thời không gây độc tế bào nồng độ thử 30 µM

+ Các hợp chất AL2, AL4, AL6, AL7, AL8 hoạt động ức chế sản sinh NO với giá trị % ức chế < 50% không ảnh hƣởng đến phát triển bình thƣờng tế bào RAW264.7

- Ở nồng độ thử 100 µM:

+ Các hợp chất AL1, AL3 AL5 thể hiệu kháng viêm tốt với giá trị % ức chế sản sinh NO lần lƣợt 83,8 ± 0,32%; 91,5 ± 0,02% 79,1 ± 0,23% Tại nồng độ thử này, hợp chất không ảnh hƣởng đến tăng sinh tế bào thử nghiệm

+ Các hợp chất AL6 AL7 không cho hiệu ức chế sản sinh NO rõ rệt với % ức chế lần lƣợt 45,5 ± 0,50% 41,2 ± 0,21% Hai hợp chất không gây độc tế bào thử nghiệm nồng độ thử 100 µM

-10 10 30 50 70 90 110 30 µM 100 µM 30 µM 100 µM 30 µM 100 µM 30 µM 100 µM 30 µM 100 µM 30 µM 100 µM 30 µM 100 µM 30 µM 100 µM

AL1 AL2 AL3 AL4 AL5 AL6 AL7 AL8

+ Hai hợp chất AL2, AL4, AL8 khơng có hoạt tính ức chế sản sinh NO không gây độc tế bào RAW264.7 nồng độ thử nghiệm

Nhƣ vậy, hợp chất AL1, AL3, AL5 thể hoạt tính ức chế sản sinh NO tƣơng đối tốt hai nồng độ thử nghiệm 30 µM 100 µM, đồng thời khơng gây độc tế bào RAW264.7 Các hợp chất AL2, AL4, AL6, AL7 AL8 khơng có hoạt tính kháng viêm, không gây độc tế bào hai nồng độ thử 30 µM 100 µM Các hợp chất AL1, AL3 AL5 đƣợc tiếp tục đánh giá hiệu kháng viêm nồng độ khác để xác định giá trị IC50 Kết đánh giá hoạt tính kháng viêm theo chế ức chế sản sinh NO đƣợc thể bảng 3.10

Bảng 3.10 Giá trị IC50 hoạt tính kháng viêm theo chế ức chế sản sinh NO mẫu có hoạt tính

Hợp chất IC50 (µM)

AL1 61,66 ± 0,51 AL3 8,51 ± 0,34 AL5 134,90 ± 0,76 Cardamonin* 1,41 ± 0,05

* Cardamonin đƣợc sử dụng làm chất đối chứng

CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN

Các kết luận văn thực đƣợc mục tiêu đề phân lập, xác định cấu trúc đánh giá hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập đƣợc từ thân Sa nhân tím, cụ thể:

1 Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất gồm hợp chất đƣợc phân lập từ thân Sa nhân tím AL1, AL2, AL3, AL4, AL5 hợp chất AL6, AL7, AL8 đƣợc phân lập từ lồi Sa nhân tím, hợp chất lần phân lập đƣợc từ lồi Sa nhân tím, cụ thể:

- hợp chất thuộc nhóm phenolic: 4-methoxycinnamic acid (AL1) (420 mg), methyl ferulate (AL2) (11 mg), 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one (AL3) (5 mg), 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propan-1-one (AL4) (6 mg), 4,4’-dihydroxy chalcone (AL5) (3 mg)

- Ba hợp chất sesquiterpen: nootkatone (AL6) (20 mg) 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone (AL7) (8 mg) 7-epi-α-cyperone (AL8) (4,2 mg)

2 Đã nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập đƣợc từ thân Sa nhân tím Kết đánh giá hoạt tính kháng viêm chế ức chế sản sinh NO cho thấy, hợp chất AL5, AL1 AL3 thể hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 với giá trị IC50 lần lƣợt 134,90 ± 0,76 µM, 61,66 ± 0,51 µM 8,51 ± 0,34 µM Các hợp chất AL2, AL4, AL6, AL7 AL8 khơng có hoạt tính kháng viêm khơng gây độc tế bào thử nghiệm

4.2 KIẾN NGHỊ

Từ kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Sa nhân tím nhận thấy:

thử nghiệm đánh giá chế kháng viêm hợp chất để làm rõ chất nhƣ làm sở định hƣớng cho nghiên cứu

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Đỗ Huy Bích, 2006, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ Thuật, tập 2, 643-645

2 Bộ Y tế, 2009, Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, 872-873

3 T.K Lim, 2013, Amomum longiligulare, Edible Medicial and

Non-Medicinal Plants: Volume 5, Fruits, Springer, 801-803

4 Lê Thị Hƣơng, Trần Thế Bách, Nguyễn Quốc Bình, 2015, Giá trị sử dụng Chi Riềng (Alpinia) Sa nhân (Amomum) thuộc Họ Gừng (Zingiberaceae) Bắc Trung Bộ, Hội nghị Khoa học toàn quốc Sinh

thái tài nguyên sinh vật lần thứ 6, 1150-1154

5 Lin D., Yong W., Na W., Xiao PZ., Yin FT., Jun JZ., You BL., Yong HL., 2017, Antioxidant activities of different extracts from Amomum

longiligulare Fruits, Journal of Hainan Medical University, 23(6), 1-4

6 Hao Y., Jinpeng L., Qizhen D., 2014, Analysis and determination of oestrogen-active compounds in frutus amoni by the combination of high-speed counter-current chromatography and high performance liquid chromatography, Journal of Chromatography B, 954, 36-42

7 Liu JP., Du ZZ., Ye Y., 2013, Separation and Antioxidant Activity of the Chemical Constituents from Eupatorium Fortuneiturcz and Amomum

Longiligulare T.L.Wu, Food Science and Engineering, Zhejiang

Technology and Business University

8 Yanze L., Zhimin W., Jungzeng Z., 2015, Dietary Chinese Herbs, Springer, 293-300

9 Hui A., Jing W., Lu C., Shengmao L., Chunmei D., 2019, Comparison of Volatile Oil between the Fruits of Amomum villosum Lour And

Amomum villosum Lour var xanthioides T L Wu et Senjen Based on

GC-MS and Chemometric Techniques, Molecules, 24, 1663, 1-12

11 Rita de Cássia da Silveira e Sá, Luciana Nalone Andrade, Damião Pergentino de Sousa, 2013, A Review on anti-Inflammatory Activity of Monoterpens, Molecules, 18, 1227-1254

12 Xiao Y., Olatunde OZ., Yong J., Lu C., 2020, Progress of chemical components and biological activities of Fructus Amoni, Archives of

Biotechnology and Biomedicine, 5, 1-4

13 Le T M Chau, Tran D Thang, Le T Huong, Isiaka A Ogunwande, 2015, Constituents of essential oils from Amomun longiligulare from VietNam, Chemistry of Natural Compounds, 51(6), 1181-1183

14 Đào Lan Phƣơng, 1995, Nghiên cứu số loài mang tên sa nhân

miền Bắc Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Y dƣợc, Đại học Dƣợc

Hà Nội

15 Đỗ Thị Hoa Viên, 2001, Nghiên cứu số thành phần hóa học không bay vi chất Sa nhân Việt Nam (Amomun longiligulare

T.L.Wu), Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Đại học Bách khoa Hà Nội

16 Van JR., Mitchell JA., Appleton I., Tomlinson A., Bishop-Bailey D., Croxtall J., Willoughby D.A., 1994, Inducible isoforms of cyclooxygenase and nitric-oxide synthase in inflammation, Proceedings

of the National Academy of Sciences of USA, 91, 2046-2050

17 Murakami A., Ohigashi H., 2007, Target NOX, INOS and COX-2 in inflammatory cells: Chemoprevention using food phytochemicals,

International Journal of Cancer, 121, 2357-2363

18 W Robert, M.D Schrier, M.D Wei Wang, 2004, Acute renal failure and sepsis,The New England Journal of Medicine, 351, 159-169

19 S Jürgen, C Athena, S.A Dirk, R.J Stefan, 2011, Review: The pro- and antiinflammatory properties of the cytokine interleukin-6, Biochimica et

Biophysica Acta, 1813, 878-888

20 D Malaben, P Kalipada, 2009, IL-12 p40 homodimer, but not IL-12 p70, induces the expression of IL-16 in microglia and macrophages,

21 Giuseppe S A Longo-Sorbello, Guray S., Debabrata B., Joseph R B., 2006, Cytotoxicity and cell growth assay In Julio E., eds Cells Biology,

Elsevier Academic Press, 315-320

22 Nathan, C., 1992, Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells, The Faseb Journal, 6(12), 3051-3064

23 Hatziieremia, S., et al., 2006, The effects of cardamonin on lipopolysaccharide-induced inflammatory protein production and MAP kinase and NFκB signalling pathways in monocytes/macrophages,

British Journal of Pharmacology, 149(2), 188-198

24 Dirsch, V.M., H Stuppner, and A.M Vollmar, 1998, The Griess assay: suitable for a bio-guided fractionation of anti-inflammatory plant extracts, Planta Med, 64(5), 423-426

25 Nilay K., Aparna D., Alok K M., 2002, Microwave-Assisted Condensation Reactions Exploiting Hexamethylenetetramine as a Catalyst under Solvent-Free Conditions, Journal of Chemical Research, 180-183

26 Marco A Obregón-Mendoza, M Mirian Estévez-Carmona, Yair A R., William M M., Carolina E M., Manuel S G., Raúl G E., 2018, Crystal Structure, Synthesis and Biological Activity of Ether and Ester Trans-Ferulic Acid Derivatives, International Journal of Organic

Chemistry, 8(4), 359-377

27 Wei L., Shisheng W., Jiatao F., Yuansheng X., Xingya X., Hui Z., Yaqin W., Xinmiao L., 2009, Structure elucidation and NMR assignments for curcuminoids from the rhizomes of Curcuma longa, Magnetic

Resonance in Chemistry, 47(10), 902-908

28 Maarit K., Mari H., Riina N., Karel D K., Jyrki L., Vladimir V O., Eeva M., Kalevi P., 2004, Phenolic extractives from the Bark of Pinus

sylvestris L and their effects on inflammatory mediators nitric oxide and

prostaglandin E2, Journal of Agricultural and food chemistry, 52, 7532-7540

synthetic sulfonylamino chalcone, European Journal of Medicinal

Chemistry, 45(5), 2010–2017

30 Mitsuo M., Yuji N., and Yukio I., 2000, Insecticidal Sesquiterpene from

Alpinia oxyphylla against Drosophila melanogaster, Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 48, 3639−3641

31 Javier A., Francisco M Guerra, F Javier Moreno-Dorado, Jesu´s M B., Zacarı´as D J., Guillermo M M., 2001, Enantioselective synthesis of (+)-decipienin A, Tetrahedron, 57, 2171–2178

DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL1 4-methoxycinnamic acid

Hình PL1 Phổ

H-NMR chất AL1

PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL2 - methyl ferulate

Hình PL3 Phổ

H-NMR chất AL2

Hình PL4 Phổ 13

C-NMR chất AL2

PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL3 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one

Hình PL6 Phổ

H-NMR chất AL3

Hình PL7 Phổ

Hình PL8 Phổ 13

C-NMR chất AL3

Hình PL9 Phổ DEPT chất AL3

PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL4

3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propan-1-one

Hình PL11 Phổ

H-NMR chất AL4

Hình PL12 Phổ

Hình PL13 Phổ 13

C-NMR chất AL4

Hình PL15 Phổ HMBC hợp chất AL4

Hình PL16 Phổ HMBC giãn hợp chất AL4

PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL5 4,4’-dihydroxy chalcone

Hình PL18 Phổ

H-NMR chất AL5

Hình PL19 Phổ

Hình PL20 Phổ 13

C-NMR chất AL5

Hình PL22 Phổ HMBC chất AL5

Hình PL24 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL5 PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL6

Nootkatone

Hình PL25 Phổ

Hình PL26 Phổ

H-NMR giãn chất AL6

Hình PL28 Phổ 13

C-NMR chất AL6

Hình PL30 Phổ COSY chất AL6

Hình PL32 Phổ NOESY chất AL6

Hình PL34 Phổ HMBC chất AL6

Hình PL36 Phổ HSQC chất AL6

Hình PL38 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL6 PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL7

6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone

Hình PL39 Phổ

Hình PL40 Phổ 1H-NMR giãn chất AL7

Hình PL41 Phổ 13

Hình PL42 Phổ DEPT chất AL7

Hình PL44 Phổ HMBC giãn chất AL7

Hình PL46 Phổ HSQC chất AL7

Hình PL48 Phổ NOESY chất AL7

Hình PL50 Phổ khối ESI-MS mode positive chất AL7 PHỤ LỤC PHỔ HỢP CHẤT AL8

7-epi-α-cyperone

Hình PL51 Phổ

Hình PL52 Phổ

H-NMR giãn hợp chất AL8

Hình PL53 Phổ

H-NMR giãn hợp chất AL8

Marco A Obregón-Mendoza, M Mirian Estévez-Carmona, Yair A R., William M M., Carolina E Manuel S Raúl G E., Crystal Structure, Synthesis and Biological Activity of Ether and Ester , Wei L., Shisheng W., Jiatao F., Yuansheng X., Xingya X., Hui Z., Yaqin W., Xinmiao L.,