Nghiên cứu tạo kháng thể igy kháng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây hội chứng EMS trên tôm chân trắng (litopenaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐÀO XUÂN PHÁT NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ IgY KHÁNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY HỘI CHỨNG EMS TRÊN TÔM CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐÀO XUÂN PHÁT NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ IgY KHÁNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY HỘI CHỨNG EMS TRÊN TÔM CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Quyết định giao đề tài: 562/QĐ-ĐHNT Quyết định thành lập HĐ: 1367/QĐ-ĐHNT Ngày bảo vệ: 01/12/2018 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Đặng Thúy Bình ThS Võ Đức Duy Chủ tịch Hội Đồng: PGS TS Nguyễn Văn Duy Khoa Sau Đại học KHÁNH HÒA – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng thể IgY kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng EMS tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei)” cơng trình nghiên cứu cá nhân tôi, khuôn khổ đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu tạo kháng thể IgY phòng trị bệnh Vibrio spp tôm chân trắng” Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Các số liệu luận án trung thực chƣa đƣợc công bố luận văn khác thời điểm Khánh Hòa, ngày 21 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận văn Đào Xuân Phát iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhận đƣợc giúp đỡ quý phòng ban trƣờng Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III, tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành chƣơng trình đào tạo Thạc sĩ Qua đây, tơi xin gửi lời cảm ơn đến giúp đỡ Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS Đặng Thúy Bình – Viện Cơng nghệ sinh học & Mơi trƣờng – Trƣờng Đại học Nha Trang ThS Võ Đức Duy – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu tạo kháng thể IgY phòng trị bệnh Vibrio spp tôm chân trắng” Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III chủ trì thực ThS Võ Đức Duy làm chủ nhiệm đề tài Đồng thời gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Thanh Thùy tồn cán Phịng Công nghệ sinh học Vắc-xin thủy sản – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III, hỗ trợ suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, 21 ngày tháng 12 năm 2018 Tác giả luận văn Đào Xuân Phát iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH VẼ ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xi LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1.1 TỔNG QUAN Tình hình ni tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) 1.1.1 Tình hình ni tơm thẻ chân trắng giới 1.1.2 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng Việt Nam 1.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm thẻ chân trắng 1.2 Các nghiên cứu hội chứng EMS tơm chân trắng biện pháp phịng trị 1.2.1 Nghiên cứu hội chứng EMS tôm chân trắng 1.2.2 Các biện pháp phòng trị hội chứng EMS 1.3 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 10 1.3.1 Đặc điểm phân loại hình thái 10 1.3.2 Đặc tính phân bố ni cấy 10 1.3.3 Đặc tính sinh hóa 11 1.3.4 Khả gây bệnh 12 1.4 Kháng thể IgY (Immunoglobulin Y) 13 1.4.1 Cấu trúc chức 13 1.4.2 Tính ƣu việt IgY 15 1.4.3 Ứng dụng kháng thể IgY phòng trị bệnh thủy sản 16 1.4.4 Tá chất chất kích thích miễn dịch 17 CHƢƠNG 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 Địa điểm, thời gian đối tƣợng nghiên cứu 20 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 20 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 20 2.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu nghiên cứu 20 2.2.1 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 20 2.2.2 Tá chất 20 v 2.2.3 Gà thí nghiệm 20 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Kiểm tra chủng giống 23 2.4.2 Ảnh hƣởng mật độ kháng nguyên đến hiệu tạo kháng thể IgY 24 2.4.3 Ảnh hƣởng tá chất đến hiệu tạo kháng thể IgY 26 2.4.4 Phƣơng pháp chăm sóc gà thí nghiệm 27 2.4.5 Các tiêu đánh giá 27 2.4.6 Xác định khả trung hòa V parahaemolyticus kháng thể IgY 29 2.4.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 30 CHƢƠNG 3.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 Kiểm tra chủng giống 31 3.1.1 Kiểm tra độ 31 3.1.2 Kiểm tra tiêu sinh hóa 32 3.1.3 Kiểm tra diện gen độc tố 33 3.2 Ảnh hƣởng mật độ kháng nguyên đến hiệu tạo kháng thể IgY 34 3.2.1 Ảnh hƣởng mật độ kháng nguyên đến suất đẻ trứng 34 3.2.2 Kiểm tra độ tinh dịch chiết IgY 35 3.2.3 Ảnh hƣởng mật độ kháng nguyên đến lƣợng kháng thể IgY trứng 35 3.2.4 Ảnh hƣởng mật độ kháng nguyên đến hiệu giá kháng thể 36 3.3 Ảnh hƣởng tá chất đến hiệu tạo kháng thể IgY 39 3.3.1 Ảnh hƣởng tá chất đến phản ứng vị trí tiêm 39 3.3.2 Ảnh hƣởng tá chất đến suất đẻ trứng 40 3.3.3 Ảnh hƣởng tá chất đến lƣợng kháng thể IgY trứng 41 3.3.4 Ảnh hƣởng tá chất đến hiệu giá kháng thể IgY 42 3.4 Xác định khả trung hòa V parahaemolyticus kháng thể IgY 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 Kết luận 46 Kiến nghị 46 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Tài liệu Tiếng Việt 48 Tài liệu Tiếng Anh 50 vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease BSA Bovine Serum Albumin ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EMS Early Mortality Syndrome FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA Food and Drug Administration IND INDole production NACA Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific ONPG Ortho NitroPhenyl-ß D-Galactopyranosidase PCR Polymerase Chain Reaction PL Post Larvae rRNA ribosomal RNA SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SPF Specific Pathogen Free SPR Specific Pathogen Resistant SSA Southern Shrimp Alliance TCBS Thiosulphate Citrate Bile Salt TDA Tryptophane DeAminase TDH Thermostable Direct Haemolysin TEMED Tetramethylethylenediamine TLH Thermolabile Haemolysin VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers VP Voges Proskauer WSSV White Spot Syndrome Virus vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin cặp mồi PCR sử dụng 23 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 3.1 Đặc điểm sinh hóa chủng giống (V parahaemolyticus 13-028/A3) 32 Bảng 3.2 Kết tách chiết DNA chủng giống (V parahaemolyticus 13-028/A3) .33 viii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 10 Hình 1.2 Cấu trúc kháng thể IgG IgY 13 Hình 1.3 Kháng thể Anti- E coli K88 IgY ngăn vi khuẩn E coli bám dính lên thành ruột ruột lợn 15 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 22 Hình 3.1 Kết ni cấy chủng giống (Vibrio parahaemolyticus 13-028/A3) môi trƣờng chọn lọc A (TCBS Agar) B (CHROMagar™ Vibrio) 31 Hình 3.2 Kết test API 20E chủng giống (V parahaemolyticus 13-028/A3) 32 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR cặp mồi AP3 .33 Hình 3.4 Năng suất đẻ trứng nhóm gà tiêm vắc-xin có mật độ kháng nguyên V parahaemolyticus khác 34 Hình 3.5 Kết điện di SDS-PAGE dịch chiết IgY 35 Hình 3.6 Lƣợng kháng thể IgY trứng nhóm gà tiêm vắc-xin có mật độ kháng nguyên V parahaemolyticus khác 36 Hình 3.7 Hiệu giá kháng thể IgY từ trứng nhóm gà tiêm vắc-xin có mật độ kháng nguyên V parahaemolyticus khác 37 Hình 3.8 Hiệu giá kháng thể IgY từ trứng nhóm gà tiêm vắc-xin có mật độ kháng nguyên V parahaemolyticus khác ngày thứ 42 38 Hình 3.9 Phản ứng vị trí tiêm gây miễn dịch cho gà Novo White vắc-xin phối trộn từ tá chất khác 39 Hình 3.10 Năng suất đẻ trứng nhóm gà đƣợc tiêm vắc-xin phối trộn từ tá chất khác .40 Hình 3.11 Lƣợng IgY trứng nhóm gà đƣợc tiêm vắc-xin phối trộn từ tá chất khác .41 Hình 3.12 Hiệu giá kháng thể IgY từ trứng nhóm gà đƣợc tiêm vắc-xin phối trộn từ tá chất khác 42 ix Hình 3.13 Hiệu giá kháng thể IgY từ trứng nhóm gà đƣợc tiêm vắcxin phối trộn từ tá chất khác ngày thứ 42 43 Hình 3.14 Khả trung hòa dịch chiết IgY phát triển V parahaemolyticus môi trƣờng TCBS 44 x PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các môi trƣờng nuôi cấy, dung dịch đệm  TCBS Agar (Sigma – Aldrich) Thành phần Hàm lƣợng Mixed peptone 10 g/L Yeast extract g/L Sucrose 20 g/L Sodium citrate 10 g/L Ferric citrate g/L Sodium chloride 10 g/L Sodium thiosulfate 10 g/L Ox-bile g/L Sodium cholate g/L Thymol blue 0,04 g/L Bromothymol blue 0,04 g/L Agar 14 g/L Tổng 88 g/L Final pH 8,6 ± 0,2 (at 25°C)  CHROMagar Vibrio (CHROMagar) Thành phần Hàm lƣợng Peptone & Yeast extract 8,0 g/L Salts 51,4 g/L Chromogenic mix 0,3 g/L Agar 15,0 g/L Tổng 74,7 g/L Final pH 9,0 ± 0,2  Marine Broth (Difco) Thành phần Hàm lƣợng Peptone 5,0 g/L Yeast extract 1,0 g/L Ferric citrate 0,1 g/L Sodium chloride 19,45 g/L Magnesium chloride 5,9 g/L Magnesium sulfate 3,24 g/L Calcium chloride 1,8 g/L Potassium chloride 0,55 g/L Sodium bicarbonate 0,16 g/L Potassium bromide 0,08 g/L Strontium chloride 34,0 g/L Boric acid 22,0 g/L Sodium silicate 4,0 g/L Sodium fluoride 2,4 g/L Ammonium nitrate 1,6 g/L Disodium phosphate 8,0 g/L Tổng 37,4 g/L Final pH 7,6 ± 0,2  Đệm Phosphate Buffered Saline Thành phần Hàm lƣợng Sodium chloride 8,0 g/L Potassium chloride 0,2 g/L Disodium phosphate 1,44 g/L Monopotassium phosphate 0,24 g/L Final pH 7,4 Phụ lục 2: Quy trình tách chiết tinh DNA tổng số vi khuẩn Gram âm kit Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Code: #K0721)  Chủng vi khuẩn đƣợc tăng sinh môi trƣờng Marine Broth, ni lắc 37˚C, tốc độ lắc 200 vịng/phút, 18h;  Thu sinh khối vi khuẩn vào eppendorf ml cách ly tâm dịch huyền phù 5000 × g, 4°C, 10 phút Loại bỏ dịch nổi;  Hịa tan sinh khối 180 µL dung dịch đệm phá tế bào Digestion Solution Sau đó, bổ sung thêm 20 µL dung dịch Proteinase K Solution, vortex đến đồng Ủ mẫu 56˚C 60 phút (kết hợp với vortex/lắc để phân giải hoàn toàn tế bào);  Bổ sung thêm 20 µL dung dịch RNase A Solution, vortex ủ nhiệt độ phòng, 10 phút;  Bổ sung thêm 200 μL đệm Lysis Solution, vortex 15 giây;  Bổ sung thêm 400 μL ethanol 50 %, vortex 10 giây;  Chuyển mẫu lên cột GeneJET Genomic DNA Purification Column, phía dƣới có gắn ống thu Collection tube ml Ly tâm cột 6.000 g, 4˚C phút Chuyển cột sang ống Collection tube mL mới;  Bổ sung thêm 500 μL đệm rửa Wash Buffer I (đã bổ sung ethanol) Ly tâm 8.000 g, 4˚C phút Loại bỏ dịch qua cột ống Collection tube;  Bổ sung thêm 500 μL đệm rửa Wash Buffer II (đã bổ sung ethanol) vào cột GeneJET Genomic DNA Purification Column Ly tâm 20.000 g, 4˚C, phút để loại bỏ hoàn toàn đệm Wash Buffer II Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 mL mới;  Bổ sung 200 μL đệm Elution Buffer vào cột để rửa giải DNA hệ gen Ủ mẫu nhiệt độ phòng phút ly tâm 8.000 g, 4˚C phút;  Loại bỏ cột, giữ lại phần dịch chứa DNA tinh sạch;  Đo nồng độ DNA máy NanoDrop Bảo quản mẫu DNA -30˚C Phụ lục 3: Quy trình tách chiết tinh kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà kit Pierce™ Chicken IgY Purification Kit hãng Thermo Scientific (Code: 44918)  Tách lòng đỏ khỏi lòng trắng trứng Thu dịch lòng đỏ trứng vào cốc thủy tinh Ghi lại thể tích (V1);  Thêm lần thể tích V1 dung dịch Delipidation Solution lạnh vào dịch lòng đỏ Vortex phút;  Bọc ủ cốc chứa dịch chiết 4ºC 24h;  Ly tâm 10000 × g, 4ºC, 15 phút;  Thu dịch Ghi lại thể tích (V2);  Bổ sung thêm thể tích V2 dung dịch IgY Precipitation lạnh Vortex phút;  Bọc ủ cốc chứa dịch chiết 4ºC 16h;  Ly tâm 10000 g, 4ºC, 15 phút;  Loại bỏ phần dịch, hòa tan kết tủa 10 mL PBS (pH 7,4) Bảo quản dịch chiết -30˚C Phụ lục 4: Quy trình nhuộm bạc gel SDS-PAGE Kyle et al (2002)  Ngâm gel 100 mL 7% acid acetic, phút;  Ngâm gel 100 mL 50% methanol, 20 phút (2 lần);  Rửa gel 200 mL nƣớc cất, phút (3 lần);  Chuẩn bị dung dịch nhuộm gồm: dung dịch A (0,8 g silver nitrate + mL nƣớc cất) Chuẩn bị Dung dịch B: 21 mL nƣớc cất + 250 µL 30% NaOH + 1,4 mL 14,8M NH4OH Chuẩn bị dung dịch nhuộm: vừa nhỏ từ từ dung dịch A vào dung dịch B vừa khuấy Thêm 76 mL nƣớc cất, lắc đều;  Ngâm gel dung dịch nhuộm – 10 phút;  Rửa gel với khoảng 200 mL nƣớc, phút (2 lần);  Ngâm gel dung dịch giải nhuộm (200 mL nƣớc cất + mL 1% citric acid + 100 µL 37% formaldehyde) đến rõ band;  Dừng trình band cách rửa gel lần với khoảng 200 mL nƣớc cất Phụ lục 5: Quy trình xác định nồng độ IgY dịch chiết từ lòng đỏ trứng gà kit IgY Chicken ELISA Kit (abcam®) - Xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ IgY mật độ quang bƣớc sóng 450 nm IgY chuẩn cung cấp kèm theo kit - Chuẩn bị mẫu thử: dịch chiết IgY đƣợc pha loãng thành nồng độ khác dung dịch Diluent Solution theo phƣơng thức pha loãng bậc - Tiến hành phản ứng ELISA  Hút 100μl dịch chiết kháng thể IgY vào giếng Ủ nhiệt độ phòng 30 ± phút;  Hút bỏ dịch giếng rửa giếng dung dịch Wash Buffer (4 lần);  Thêm 100 μl Enzyme-Antibody Conjugate vào giếng Ủ tối, nhiệt độ phòng, 30 ± phút;  Hút bỏ dịch giếng rửa giếng dung dịch Wash Buffer (4 lần);  Thêm 100 μl TMB Substrate Solution vào giếng;  Ủ tối, nhiệt độ phòng, 10 phút;  Thêm 100 μl dung dịch Stop Solution vào giếng;  Đọc kết quả: Đo độ hấp thụ bƣớc sóng 450 nm giếng máy đọc Infinite F50 (Tecan, Áo) Phụ lục 6: So sánh khác biệt ý nghĩa F-test (phép thử Turkey) a Thí nghiệm – Năng suất đẻ trứng Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: TB Source Type III Sum of Squares Corrected Model 7.462a Intercept 6309.539 TN 7.462 Error 66.735 Total 6383.736 Corrected Total 74.197 df 2 99 102 101 Mean Square 3.731 6309.539 3.731 674 F 5.535 9360.086 5.535 Sig .005 000 005 a R Squared = 101 (Adjusted R Squared = 082) Multiple Comparisons Dependent Variable: TB Tukey HSD (I) TN Freund Montanide ISA 70VG PBS (J) TN Montanide ISA 70VG PBS Freund PBS Freund Montanide ISA 70VG Mean Difference (I-J) -.1662 -.6385* 1662 -.4724 6385* 4724 Std Error 19913 19913 19913 19913 19913 19913 Sig .683 005 683 051 005 051 95% Confidence Interval Lower Bound -.6400 -1.1124 -.3076 -.9462 1647 -.0015 b Thí nghiệm – Lƣợng kháng thể IgY trứng Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: TB Source Type III Sum of Squares df Mean Square a Corrected 87195.086 43597.543 Model Intercept 176104.852 176104.852 TN 87195.086 43597.543 Error 29071.674 45 646.037 Total 292371.613 48 Corrected Total 116266.761 47 a R Squared = 750 (Adjusted R Squared = 739) F 67.485 Sig .000 272.592 67.485 000 000 Multiple Comparisons Dependent Variable: TB Tukey HSD (I) TN Freund Montanide ISA 70VG PBS Mean Difference (J) TN (I-J) Montanide ISA 70VG -2.8537 PBS 88.9525* Freund 2.8537 PBS 91.8062* Freund -88.9525* Montanide ISA 70VG -91.8062* Std Error 8.98636 8.98636 8.98636 8.98636 8.98636 8.98636 Sig .946 000 946 000 000 000 95% Confidence Interval Lower Bound -24.6332 67.1730 -18.9257 70.0268 -110.7320 -113.5857 c Thí nghiệm – Hiệu giá kháng thể Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: TB Source Type III Sum of Squares df Mean Square a Corrected 997.216 498.608 Model Intercept 1993.052 1993.052 TN 997.216 498.608 Error 391.522 45 8.700 Total 3381.790 48 Corrected Total 1388.738 47 a R Squared = 718 (Adjusted R Squared = 706) F 57.308 Sig .000 229.074 57.308 000 000 Multiple Comparisons Dependent Variable: TB Tukey HSD (I) TN Freund Montanide ISA 70VG PBS (J) TN Montanide ISA 70VG PBS Freund PBS Freund Montanide ISA 70VG Mean Difference Std (I-J) Error 2938 1.04286 9.8125* -.2938 9.5187* -9.8125* -9.5187* 1.04286 1.04286 1.04286 1.04286 1.04286 Sig .957 95% Confidence Interval Lower Bound -2.2337 000 957 000 000 000 7.2850 -2.8212 6.9913 -12.3400 -12.0462 d Thí nghiệm – Hiệu giá kháng thể ngày thứ 42 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: TB Source Type III Sum of Squares df Mean Square a Corrected 854 427 Model Intercept 2.077 2.077 TN 854 427 Error 1.981 21 094 Total 4.912 24 Corrected Total 2.835 23 a R Squared = 301 (Adjusted R Squared = 235) F 4.529 Sig .023 22.019 4.529 000 023 Multiple Comparisons Dependent Variable: TB Tukey HSD (I) TN Freund Montanide ISA 70VG PBS (J) TN Montanide ISA 70VG PBS Freund PBS Freund Montanide ISA 70VG Mean Difference (I-J) -.0650 3638 0650 4288* -.3638 -.4288* Std Error 15356 15356 15356 15356 15356 15356 Sig .906 068 906 028 068 028 95% Confidence Interval Lower Bound -.4520 -.0233 -.3220 0417 -.7508 -.8158 e Thí nghiệm – Năng suất đẻ trứng Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: TB Source Type III Sum of Squares df Mean Square F a Corrected 30.268 10.089 22.125 Model Intercept 7674.920 7674.920 16830.326 TN 30.268 10.089 22.125 Error 60.194 132 456 Total 7765.383 136 Corrected Total 90.463 135 a R Squared = 335 (Adjusted R Squared = 319) Sig .000 000 000 Multiple Comparisons Dependent Variable: TB Tukey HSD (I) TN (J) TN Mean Difference (I-J) 10^4 10^5 0394 10^6 7950* PBS -.5291* 10^5 10^4 -.0394 10^6 7556* PBS -.5685* 10^6 10^4 -.7950* 10^5 -.7556* PBS -1.3241* PBS 10^4 5291* 10^5 5685* 10^6 1.3241* Std Error 16378 16378 16378 16378 16378 16378 16378 16378 16378 16378 16378 16378 Sig .995 000 008 995 000 004 000 000 000 008 004 000 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound -.3868 4656 3688 1.2212 -.9553 -.1029 -.4656 3868 3294 1.1818 -.9947 -.1424 -1.2212 -.3688 -1.1818 -.3294 -1.7503 -.8979 1029 9553 1424 9947 8979 1.7503 f Thí nghiệm – Lƣợng kháng thể IgY trứng Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: TB Source Type III Sum of Squares df Mean Square a Corrected 98286.359 32762.120 Model Intercept 295472.422 295472.422 TN 98286.359 32762.120 Error 46256.709 60 770.945 Total 440015.489 64 Corrected Total 144543.067 63 a R Squared = 680 (Adjusted R Squared = 664) F 42.496 Sig .000 383.260 42.496 000 000 Multiple Comparisons Dependent Variable: TB Tukey HSD Mean 95% Confidence Interval Difference (IStd Lower Upper (I) TN (J) TN J) Error Sig Bound Bound 10^4 10^5 -6.9644 9.81673 893 -32.9053 18.9765 10^6 -9.0244 9.81673 795 -34.9653 16.9165 * PBS 84.8419 9.81673 000 58.9010 110.7828 10^5 10^4 6.9644 9.81673 893 -18.9765 32.9053 10^6 -2.0600 9.81673 997 -28.0009 23.8809 * PBS 91.8062 9.81673 000 65.8653 117.7472 10^6 10^4 9.0244 9.81673 795 -16.9165 34.9653 10^5 2.0600 9.81673 997 -23.8809 28.0009 PBS 93.8663* 9.81673 000 67.9253 119.8072 PBS 10^4 -84.8419* 9.81673 000 -110.7828 -58.9010 * 10^5 -91.8062 9.81673 000 -117.7472 -65.8653 10^6 -93.8663* 9.81673 000 -119.8072 -67.9253 Based on observed means The error term is Mean Square(Error) = 770.945 * The mean difference is significant at the 0.05 level g Thí nghiệm – Hiệu giá kháng thể Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: TB Source Type III Sum of Squares df Mean Square a Corrected 1092.070 364.023 Model Intercept 3215.882 3215.882 TN 1092.070 364.023 Error 580.317 60 9.672 Total 4888.269 64 Corrected Total 1672.387 63 a R Squared = 653 (Adjusted R Squared = 636) F 37.637 Sig .000 332.496 37.637 000 000 Multiple Comparisons Dependent Variable: TB Tukey HSD Mean 95% Confidence Interval Difference (IStd Lower Upper (I) TN (J) TN J) Error Sig Bound Bound 10^4 10^5 -.7075 1.09954 917 -3.6131 2.1981 10^6 -1.5825 1.09954 480 -4.4881 1.3231 * PBS 8.6881 1.09954 000 5.7826 11.5937 10^5 10^4 7075 1.09954 917 -2.1981 3.6131 10^6 -.8750 1.09954 856 -3.7806 2.0306 * PBS 9.3956 1.09954 000 6.4901 12.3012 10^6 10^4 1.5825 1.09954 480 -1.3231 4.4881 10^5 8750 1.09954 856 -2.0306 3.7806 PBS 10.2706* 1.09954 000 7.3651 13.1762 PBS 10^4 -8.6881* 1.09954 000 -11.5937 -5.7826 * 10^5 -9.3956 1.09954 000 -12.3012 -6.4901 10^6 -10.2706* 1.09954 000 -13.1762 -7.3651 Based on observed means The error term is Mean Square(Error) = 9.672 * The mean difference is significant at the 0.05 level h Thí nghiệm – Hiệu giá kháng thể ngày thứ 42 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: TB Source Type III Sum of Squares df Mean Square F Sig a Corrected 1.064 355 3.442 030 Model Intercept 3.144 3.144 30.503 000 TN 1.064 355 3.442 030 Error 2.886 28 103 Total 7.094 32 Corrected Total 3.950 31 a R Squared = 269 (Adjusted R Squared = 191) Multiple Comparisons Dependent Variable: TB Tukey HSD Mean 95% Confidence Interval Difference (ILower Upper (I) TN (J) TN J) Std Error Sig Bound Bound 10^4 10^5 -.1813 16052 675 -.6195 2570 10^6 -.2100 16052 566 -.6483 2283 PBS 2475 16052 427 -.1908 6858 10^5 10^4 1813 16052 675 -.2570 6195 10^6 -.0287 16052 998 -.4670 4095 PBS 4288 16052 057 -.0095 8670 10^6 10^4 2100 16052 566 -.2283 6483 10^5 0287 16052 998 -.4095 4670 * PBS 4575 16052 038 0192 8958 PBS 10^4 -.2475 16052 427 -.6858 1908 10^5 -.4288 16052 057 -.8670 0095 * 10^6 -.4575 16052 038 -.8958 -.0192 Based on observed means The error term is Mean Square(Error) = 103 * The mean difference is significant at the 0.05 level i Khả trung hòa V parahaemolyticus dịch chiết IgY Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: TB Source Type III Sum of Squares df Mean Square a Corrected 21.902 7.301 Model Intercept 23.595 23.595 TN 21.902 7.301 Error 3.000 12 250 Total 48.497 16 Corrected Total 24.902 15 a R Squared = 880 (Adjusted R Squared = 849) F 29.202 Sig .000 94.380 29.202 000 000 Multiple Comparisons Dependent Variable: TB Tukey HSD Mean 95% Confidence Interval Difference (IStd Lower Upper (I) TN (J) TN J) Error Sig Bound Bound 1.6650* 35355 002 6153 2.7147 2.8100* 35355 000 1.7603 3.8597 * 10 2.8975 35355 000 1.8478 3.9472 * -1.6650 35355 002 -2.7147 -.6153 1.1450* 35355 031 0953 2.1947 10 1.2325* 35355 020 1828 2.2822 * -2.8100 35355 000 -3.8597 -1.7603 * -1.1450 35355 031 -2.1947 -.0953 10 0875 35355 994 -.9622 1.1372 10 -2.8975* 35355 000 -3.9472 -1.8478 * -1.2325 35355 020 -2.2822 -.1828 -.0875 35355 994 -1.1372 9622 Based on observed means The error term is Mean Square(Error) = 250 * The mean difference is significant at the 0.05 level ... thi vi? ??c chế tạo IgY kháng V parahaemolyticus điều kiện Vi? ??t Nam, đề tài ? ?Nghiên cứu tạo kháng thể IgY kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng EMS tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei)? ??... vi khuẩn V parahaemolyticus 13-028/A3 21 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu Nghiên cứu tạo kháng thể IgY kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng EMS tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei). .. Các nghiên cứu hội chứng EMS tôm chân trắng biện pháp phòng trị 1.2.1 Nghiên cứu hội chứng EMS tôm chân trắng 1.2.2 Các biện pháp phòng trị hội chứng EMS 1.3 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus