BÁO cáo NGHIÊN cứu KHOA học kĩ THUẬT “ứng dụng ánh sáng đơn sắc (LED) trong nghiên cứu nâng cao chất lượng cây giống cúc

GIỚI THIỆU VÀ TỔNG QUAN I GIỚI THIỆU VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Giới thiệu Cúc (Chrysanthemum morifolium) loại trồng làm cảnh lâu đời giới, loại hoa thương phẩm ưa chuộng, khơng đa dạng màu sắc hình dáng mà cịn dễ nhân giống, khơng cần phải chăm sóc nhiều, dễ điều khiển hoa theo ý muốn giữ tươi lâu Do vậy, ngày nhiều nghiên cứu nhằm cải tiến chất lượng hoa Cúc tiến hành, làm cho ngày đa dạng màu sắc hình dạng, tăng khả chống chịu nấm bệnh thích nghi tốt với mơi trường Ngoài việc sử dụng rộng rãi thiết bị, LED ứng dụng nghiên cứu nông nghiệp Việc sử dụng đi-ốt phát quang nguồn xạ cho thực vật đặc biệt trọng năm gần tiềm ứng dụng thương mại lớn LED sinh nhiệt giảm thiểu nhu cầu sử dụng hệ thống làm lạnh việc tạo điều kiện thuận lợi cho nhân giống vơ tính thương mại với chi phí hiệu Do có độ dài sóng đặc biệt phổ hẹp nên gần LED dùng nhiều lĩnh vực nghiên cứu quang sinh học tổng hợp chlorophyll, quang hợp phát sinh hình thái Nhiều nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng LED lên sinh trưởng phát triển số trồng như: Dâu tây, Lan Ý, Lan Hồ Điệp, Lilium… ánh sáng LED thích hợp cho sinh trưởng ánh sáng huỳnh quang Tuy nhiên, nghiên cứu bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng LED đến hình thái sinh lý trồng Nhóm chúng em muốn có thêm nghiên cứu để tìm hiểu thêm Cúc cần loại ánh sáng đơn sắc nào, kết hợp sao, cường độ giai đoạn chiếu sáng phù hợp, sinh trưởng phát triển giai đoạn ex vitro để góp phần đánh giá đầy đủ ảnh hưởng đèn LED đến trình sinh trường phát triển Cúc Vì vậy, chúng em tiến hành đề tài: “Ứng dụng ánh sáng đơn sắc (LED) nghiên cứu nâng cao chất lượng giống Cúc (Chrysanthemum morifolium) nuôi cấy in vitro” Mục tiêu đề tài Đề tài tiến hành nhằm khảo sát: Ảnh hưởng loại ánh sáng tỷ lệ ánh sáng LED (LED đỏ/LED xanh) lên khả tái sinh chồi Cúc in vitro từ mẫu mẫu cấy thân Ảnh hưởng loại ánh sáng tỷ lệ ánh sáng LED (LED đỏ/LED xanh) lên nhân chồi Cúc in vitro Ảnh hưởng loại ánh sáng tỷ lệ ánh sáng LED (LED đỏ/LED xanh) đến trình sinh trưởng phát triển Cúc in vitro Ảnh hưởng cường độ ánh sáng LED đến trình sinh trưởng phát triển Cúc in vitro Ảnh hưởng giai đoạn chiếu sáng khác ánh sáng LED đỏ LED xanh đến trình sinh trưởng phát triển Cúc in vitro Khả sống sót, sinh trưởng phát triển Cúc in vitro vườn ươm II TỔNG QUAN SỰ TÁI SINH CỦA THỰC VẬT Q trình mơ biệt hóa phản biệt hóa chuyển thành mơ non trẻ, có khả phân chia tế bào bước vào chu trình tế bào mới, hình thành quan gọi tái sinh Quá trình bao gồm ba giai đoạn (giai đoạn phản biệt hóa, giai đoạn cảm ứng chất điều hịa sinh trưởng thực vật giai đoạn phát sinh quan hình thành chồi) chịu điều hịa nhiều nhân tố khác (Klerk et al., 1997) Mô biệt hóa mơ đảm nhiệm chức thực vật khơng có có khả phân chia tế bào thấp Sự phản biệt hóa xảy mô tách khỏi mẹ đáp ứng với thay đổi môi trường dinh dưỡng nhân tạo thơng qua vùng bị thương Auxin đóng vai trị quan trọng giai đoạn kích thích lỏng lẻo vách tế bào thông qua hoạt động acid hóa vách tế bào kích thích phân chia tế bào Những tế bào phản biệt hóa cảm ứng với chất điều hịa sinh trưởng thực vật làm gia tăng phân chia tế bào lặp lại chương trình phát triển theo hướng khác Nồng độ, kiểu loại thời gian tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh đóng vai trị quan trọng, định hướng tái sinh mô giai đoạn Thông thường, tỷ lệ cytokinin/auxin cao cảm ứng hình thành chồi, tỷ lệ cytokinin/auxin thấp cảm ứng hình thành rễ tỷ lệ cân hình thành sẹo (Klerk et al., 1997) Bổ sung auxin vào môi trường giúp mô cấy tạo rễ, đồng thời ức chế tạo chồi; ảnh hưởng ức chế đảo ngược cách thêm vào đường phosphate hữu Rễ hình thành mơi trường có NAA Zeatin, cịn hình thành chồi mơi trường có Zeatin BA mà khơng có auxin Ngồi tỷ lệ auxin/cytokinin, số yếu tố khác xác định có ảnh hưởng đến phát sinh quan Các chất có hoạt tính gibberellin thường có khuynh hướng cản hình thành chồi rễ, việc ức chế tổng hợp tinh bột Ethylen cho có khả thúc đẩy phát sinh chồi Đường thêm vào môi trường nguồn cung cấp lượng hô hấp cho tế bào thông qua đường thẩm thấu Áp lực thẩm thấu nhẹ tạm thời tạo số biến đổi sinh hóa, dẫn đến thay đổi tăng trưởng phát sinh hình thái mơ sẹo VAI TRỊ CỦA ÁNH SÁNG ĐỐI VỚI THỰC VẬT Ánh sáng yếu tố quan trọng sinh trưởng thực vật, ánh sáng tác động đến trình quang hợp, quang phát sinh hình thái đáp ứng hướng sáng Các bước sóng thực vật thật hấp thu sử dụng quang hợp phần nhỏ toàn quang phổ điện tử Ở thực vật bậc cao, ánh sáng đỏ, tím, xanh điều khiển q trình quang hợp hiệu Những màu nằm vùng ánh sáng khả kiến có bước sóng khoảng từ 380 – 750 nm Khả kích thích electron ánh sáng liên quan đến độ dài bước sóng cường độ chùm sáng Quang hợp trình biến đổi lượng ánh sáng mặt trời thành lượng hoá học dạng hợp chất hữu Nói cách khác, quang hợp trình biến đổi chất vơ đơn giản thành hợp chất hữu phức tạp có hoạt tính cao thể thực vật tác dụng ánh sáng mặt trời tham gia hệ sắc tố thực vật (V.V.Vụ, 2009) Hầu hết hoạt động quang hợp mô tế bào thực vật bậc cao diễn tế bào thịt lá Tế bào thịt có chứa nhiều lục lạp, nơi đặc biệt hấp thụ ánh sáng mặt trời (chlorophyll) Khi đó, phân tử chlorophyll khởi phát chuỗi phản ứng hóa học chuyển hóa nước CO2 có khí thành O2 phân tử đường Ánh sáng biến đổi thành lượng hóa học hai quang hệ thống khác quang hệ thống I II (Leibert, 1976) Trong nhân tố môi trường, ánh sáng đặc biệt phù hợp với vai trị nguồn thơng tin tác động đến sinh trưởng phát triển thực vật Ánh sáng truyền thơng tin đến thực vật qua nhiều dạng khác nhau: chất lượng (dạng lượng xạ, màu, quang phổ, thành phần bước sóng), lượng (số lượng lượng xạ, cường độ, số photon, tốc độ dịng), hướng, quang kỳ (chu kì ngày đêm thay đổi độ dài ngày theo mùa) Thực vật có ba dạng quang hệ thống (photosystem) để thu lượng đáp ứng tín hiệu thơng tin ánh sáng: sắc tố quang hợp, thụ quan nhận ánh sáng đỏ đỏ xa (phytochrome), thụ quan nhận ánh sáng xanh (cryptochrome), hiểu với cách thức hoạt động nơi tiếp nhận tín hiệu, nơi truyền đáp ứng tín hiệu ánh sáng Quá trình quang phát sinh hình thái thực vật điều hồ loại thụ quan ánh sáng (photoreceptor): Các phytochrome nhạy cảm với ánh sáng đỏ đỏ xa Các thụ quan nhận ánh sáng xanh Các thụ quan hấp thụ tia cực tím (UV-A) Các thụ quan hấp thụ tia cực tím (UV-B) 2.1 Các thụ quan ánh sáng thực vật 2.1.1 Thụ quan ánh sáng đỏ đỏ xa (phytochrome (520 nm)) thực vật Loại sắc tố liên kết với protein tìm thấy nồng thấp hầu hết quan thực vật, cụ thể mô phân sinh Sắc tố tồn hai dạng chuyển hố lẫn Dạng Pr 660 có đỉnh hấp thụ ánh sáng cực đại 660 nm (ánh sáng đỏ) dạng Pfr 730 có đỉnh hấp thụ ánh sáng cực đại 730 nm (ánh sáng đỏ xa) Ánh sáng ban ngày thích hợp cho hình thành dạng Pfr 730 - dạng có hoạt động sinh lí Cường độ ánh sáng để xảy chuyển hoá thấp thời gian chuyển hố xảy nhanh, tính giây Phytochrome có chức đáp ứng ánh sáng quang vật: phân hóa lục lạp từ proplastid, nảy mầm hạt, kéo dài thân hoa Phytochrome nhân tố trung gian đáp ứng ức chế kéo dài trục hạ diệp ánh sáng xanh Nó tham gia vào trình truyền tín hiệu cry1 Tuy nhiên, ức chế kéo dài trục hạ diệp phụ thuộc cry1 độc lập với phytochrome Phytochrome kiểm soát phiên mã số gene bao gồm tiểu phần nhỏ rubisco, protein gắn kết với chlorophyll a hay b enzyme ly giải phenylalanine ammonia Dưới ánh sáng đỏ, tốc độ phiên mã tiểu phần nhỏ rubisco tăng lên 20 lần (Dương Tấn Nhựt, 2011) Ở thực vật, có phytochrome PhyA, PhyB, PhyC, PhyD PhyE với chức riêng biệt khác 2.1.2 Thụ quan ánh sáng xanh dương thực vật Vùng ánh sáng xanh dương (400 - 500 nm) có vai trị quan trọng đời sống thực vật chìa khóa hoạt động nhiều phản ứng quang sinh hóa đóng mở khí khổng, quang hướng động, ức chế kéo dài thân, kích hoạt gene, sinh tổng hợp sắc tố, tự điều chỉnh hướng theo nguồn ánh sáng mặt trời, di chuyển lục lạp tế bào Ánh sáng xanh dương kích thích sinh trưởng bất đối xứng uốn cong thực vật (Leibert, 1976) Cryptochrome Cryptochrome diện hầu hết thể eukaryote bậc cao (thực vật, động vật người) với đa dạng số lượng kiểu loại Ở thực vật, diện hai mầm, mầm, dương xỉ, rêu tảo Hầu hết cryptochorme thực vật protein có trọng lượng 70 - 80 kDa Cryptochrome flavoprotein nhân, khác với phytochrome chuyển đến nhân áp lực ánh sáng (Yamaguchi et al., 1999), xác định phổ hoạt động nó, thụ quan ánh sáng xanh giống photoplyase, enzyme có chức sửa chữa sai hỏng DNA tác dụng ánh sáng (Lin, 2000) Cryptochrome khơng có hoạt tính sinh hóa, biểu gene crytochrome lại điều hòa ánh sáng chế khác từ phiên mã thối hóa Chức cryptochrome phát sinh hình thái thực vật tương tự với hầu hết chức phytochrome, thể điều khiển phản vàng hóa, biểu gene hoa theo quang kỳ biểu diễn cryptochrome phytochrome, đóng vai trò khởi đầu đáp ứng với ánh sáng xanh/UVA ánh sáng đỏ/đỏ xa Phototropin Cho đến nay, phototropin xác định nhiều loài thực vật khác nhau, từ loài tảo xanh (Chlamydomonas reinhardtii) loài thực vật bậc cao (Briggs et al., 2001) Phototropin ban đầu biết đến protein liên kết với màng sinh chất có trọng lượng 120 kDa, cảm ứng q trình phosphoryl hóa ánh sáng xanh Arabidopsis thaliana (Gällagher et al., 1988) Phototropin xem thụ quan có chất flavoprotein, điều khiển khơng quang hướng động thực vật, cịn có vai trò quan trọng khác như: di chuyển lục lạp để tránh ánh sáng có cường độ cao (Kagawa et al., 2001), mở khí (Kinoshita et al., 2001) ức chế nhanh việc khởi đầu sinh trưởng trục hạ diệp (Folta Spalding, 2001) Arabidopsis chu trình sinh sản Chlamydomonas (Huang Beck, 2003) Ngồi ra, thực vật cịn có phototropin đáp ứng với ánh sáng xanh tương tự phototropin phototropin hấp thu ánh sáng cường độ cao (1 - 10 μmol.m-2.s-1), đó, phototropin hấp thu ánh sáng xanh cường độ thấp từ (0,01 - μmol.m-2.s-1) (Sakai et al., 2001) 2.1.3 Thụ quan hấp thu tia cực tím (UV receptor) thực vật Tia cực tím làm tổn thương tế bào thực vật, vậy, tế bào tổng hợp chất bảo vệ flavonoid biểu bì lớp siêu dính cutin Những đáp ứng kích thích tia UV-B, tia khơng nhận biết chromophore Thay vào đó, tiểu phần D2 quang hệ thống II (PSII) hấp thụ bị phá hủy UV-B, chu trình cảm ứng sản phẩm thối hóa Chất bảo vệ flavonoid có màu vàng (flava Lat), hầu hết chúng hấp thu ánh sáng (gồm tia xanh xa UV) Flavonoid chất chống oxy hóa (như vitamin A, C E), thu gom gốc tự (Leibert, 1976) II.2 Vai trò ánh sáng sinh trưởng phát triển thực vật Ánh sáng có ảnh hưởng lớn lên q trình quang phát sinh hình thái thực vật thơng qua quang thụ quan (Kendrick Kronenberg, 1994) Sự chiếu sáng có ảnh hưởng lên sinh trưởng tế bào, mô thực vật sinh tổng hợp chất biến dưỡng sơ cấp thứ cấp (Ouyang et al., 2003) Nhìn chung, chúng tăng theo cường độ chiếu sáng tượng bão hòa ánh sáng xuất sau cường độ chiếu sáng đạt đến điểm bão hịa ánh sáng, khác từ lồi đến lồi khác (Zhong et al., 1991) Sự chiếu sáng với cường độ ánh sáng chất lượng phổ ánh sáng khác có tác động đáng kể lên sinh trưởng mô sẹo Cistanche deserticola sinh tổng hợp phenylethanoid glycosides, thành phần có vai trị quan trọng việc ổn định chức sinh sản, tiếp nhận gốc oxygen tự chống lão hóa biến đổi hoạt tính phenylalanine ammonia lyase (PAL), enzyme then chốt xúc tác cho bố trí cố định khơng gian, kháng, khử nhóm ammonia từ phenylalanine tyrosine để tạo cinamic acid tiền chất (Ouyang et al., 2003) Ánh sáng trắng tổng hợp loại ánh sáng có bước sóng khác (400 - 800 nm), thích hợp cho nhiều loại đáp ứng thực vật Trong nuôi cấy dịch huyền phù Perilla frutescens, ánh sáng trắng với cường độ 27,2 W.m -2 suốt thời gian nuôi cấy hiệu lượng anthocyanin tạo cao gấp hai lần so với không chiếu sáng (Zhong et al., 1991) Ánh sáng trắng tăng cường sinh trưởng chồi Artemisia annua L làm tăng hàm lượng artemisinin Trong điều kiện tối, chồi không sinh trưởng artemisinin không tạo (Cashmore et al., 1999) Ánh sáng đỏ đỏ xa có tác dụng kéo dài rễ lóng thân Khi nuôi cấy lông rễ Artemisia annua L., sinh khối lông rễ hàm lượng artemisia ánh sáng đỏ cao 17 - 67% so với ánh sáng trắng Tỷ lệ xạ tia đỏ:đỏ xa (R:Fr) có ảnh hưởng đến kéo dài lóng thân thực vật Người ta tính tỷ lệ xạ R:Fr môi trường khác dựa hấp thu sắc tố quang hợp (Wang et al., 2001) Ánh sáng xanh thúc đẩy sinh trưởng mô sẹo lại ức chế kéo dài thân Mô sẹo nuôi cấy ánh sáng xanh 435 nm cho nhiều sinh khối (18,4 g trọng lượng khô) PeG (2,4 g/l) cao nhất, cao 19 41% so với nuôi cấy ánh sáng trắng Điều giải thích hoạt tính PAL mơ sẹo ni cấy ánh sáng xanh cao so với ánh sáng trắng (Ouyang et al., 2003) Việc chiếu ánh sáng xanh liên tục nuôi cấy Rau diếp (Lactuca sativa L.) môi trường nước làm giảm đáng kể kéo dài trục hạ diệp so với việc chiếu ánh sáng đỏ (Volmaro et al., 1998) Ánh sáng xanh tăng làm giảm chiều cao Antirrhinum (Khattak Pearson, 2004) Ánh sáng xanh lục tia UV gần (bước sóng 200 - 380 nm) có khả kìm hãm sinh trưởng thực vật tác động đến quang hợp phát triển bình thường Ngược lại, loại bỏ cách có chọn lọc tia UV gần xanh lục từ ánh sáng trắng tăng cường sinh trưởng cho (Khattak Pearson, 2004) II.3 Ứng dụng ánh sáng nhân tạo led (light-emitting diode) nuôi cấy in vitro Kể từ đời vào năm 1879 đến nay, bóng đèn sợi đốt không ngừng cải thiện để tăng chất lượng chiếu sáng nhằm phục vụ nhu cầu đời sống sinh hoạt người Về sau, loại nguồn sáng compact, huỳnh quang ứng dụng rộng rãi lĩnh vực sản xuất nông nghiệp, đặc biệt phịng thí nghiệm ni cấy mơ thực vật Bóng đèn huỳnh quang thường sử dụng với ưu điểm sau: Tiết kiệm tiêu thụ điện (tiết kiệm 20 - 30% so với đèn sợi đốt), 90% xạ nằm vùng quang phổ hấp thụ thực vật Đặc biệt tuổi thọ bóng lên đến 20.000 - 36.000 (Simpson, 2003) Tuy vậy, người ta quan tâm tới nguồn sáng khác với ưu điểm khả áp dụng thực tế chẳng hạn đèn halogen kim loại Với ưu điểm vượt trội như: phát ánh sáng với cường độ cao nên sử dụng để thay ánh sáng tự nhiên bổ sung vào nguồn sáng khác để tăng cường độ chiếu sáng q trình ni cấy Bức xạ bóng có vùng quang phổ phục vụ cho q trình quang hợp cao, ánh sáng xanh chiếm tới 20% tổng số xạ phát thích hợp cho trình trao đổi chất trồng (Brown et al., 1995; Schuerger et al., 1997) Tuy nhiên, chất lượng vùng quang phổ chúng khơng thích hợp cho trình quang hợp phát sinh hình thái thực vật nên thân thường bị kéo dài thực vật phát triển nguồn chiếu sáng (Wheeler et al., 1991; Tibbitts, 1983) Tỷ lệ ánh sáng đỏ/đỏ xa thấp với tỷ lệ ánh sáng xanh vùng quang phổ phát thấp so sánh với nguồn chiếu sáng khác, vậy, chúng khơng phải nguồn sáng ưu tiên lựa chọn ni cấy in vitro Ngồi nguồn sáng trên, cịn có nhiều loại đèn khác như: thủy ngân hạ áp, thủy ngân cao áp, natri hạ áp, compact…Tóm lại, vùng quang phổ định đến chất lượng nguồn chiếu sáng chúng tác động trực tiếp đến khả sinh trưởng phát triển thực vật Những nguồn chiếu sáng kiểm sốt vùng quang phổ q trình ni cấy Vào năm 1907, Round phát ánh sáng phát từ khối bán dẫn cho dòng điện chạy qua, gọi điốt phát quang (LED), mở đầu cho kỷ nguyên công nghiệp chiếu sáng Với kích thước thể tích nhỏ, tuổi thọ cao vùng quang phổ kiểm soát, đèn LED hứa hẹn nguồn chiếu sáng vi nhân giống trồng trọt (Bula et al., 1991) II.3.1 Ánh sáng đơn sắc (Light-emitting diode) Đèn LED cấu tạo từ hai khối bán dẫn Một khối chứa điện tử điện tích âm (n-type) khối cịn lại mang điện tích dương (p-type) Khi chúng gặp nhau, điện tích âm dương kết hợp với nhau, tạo electron giải phóng lượng dạng lượng tử ánh sáng Henry Josef Round báo cáo đèn LED vào năm 1907, SiC (silicon carbide) biết với tên caborundum vật liệu để chế tạo đèn LED LED chất bán dẫn trạng thái đặc Sự phát quang LED tạo tinh thể chất bán dẫn kích thích để trực tiếp tạo ánh sáng nhìn thấy dãy bước sóng mong muốn (màu) Tùy vào nguồn cấu tạo chất bán dẫn mà định đến bước sóng đèn LED Ứng dụng thực tiễn điốt phát quang chúng sử dụng rộng rãi thay cho thiết bị thị bóng sợi đốt Đến cuối kỷ 20 đầu kỷ 21, mà công nghệ LED phát triển cách nhanh chóng, nguồn LED có hiệu suất phát sáng hiệu phát minh phục vụ cho mục đích chiếu sáng; đem lại nhiều tiện dụng cho thiết bị kỹ thuật số dãy thiết bị đa chức năng, tín hiệu vào, đèn nổi, đèn giao thơng, đèn vịm, đèn tường, đèn nước, đèn trời Trong năm gần đây, đèn LED thực quan tâm nguồn xạ cho thực vật tiềm ứng dụng thương mại lớn (Nhut et al., 2002) 10 .. .cứu nâng cao chất lượng giống Cúc (Chrysanthemum morifolium) nuôi cấy in vitro” Mục tiêu đề tài Đề tài tiến hành nhằm khảo sát: Ảnh hưởng loại ánh sáng tỷ lệ ánh sáng LED (LED đỏ/LED... sáng Quang hợp trình biến đổi lượng ánh sáng mặt trời thành lượng hoá học dạng hợp chất hữu Nói cách khác, quang hợp trình biến đổi chất vô đơn giản thành hợp chất hữu phức tạp có hoạt tính cao. .. (2,4 g/l) cao nhất, cao 19 41% so với nuôi cấy ánh sáng trắng Điều giải thích hoạt tính PAL mô sẹo nuôi cấy ánh sáng xanh cao so với ánh sáng trắng (Ouyang et al., 2003) Việc chiếu ánh sáng xanh