Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở việt nam TT

1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết đề tài Khoai tây (Solanum tuberosum L.) trồng quan trọng chương trình an ninh lương thực giới sau ngô, lúa mỳ gạo Theo thống kê tổ chức Nông lương giới (FAOSTAT, 2019), diện tích khoai tây giới năm 2017 đạt 19,30 triệu ha, suất trung bình đạt 20,11 tấn/ha, với tổng sản lượng 388,2 triệu Tại Việt Nam, khoai tây trồng lý tưởng cho vụ Đông Đồng Sông Hồng, nhiên diện tích trồng nước 20.480 với suất 14,8 tấn/ha, sản lượng 303 nghìn (FAOSAT, 2017) Có nhiều nguyên nhân mặt kinh tế lẫn kỹ thuật dẫn đến hạn chế phát triển khoai tây Việt Nam Về mặt kinh tế, nguyên nhân trồng khoai tây hiệu so với trồng khác đầu hạn chế Về mặt kỹ thuật, nguyên nhân chủ yếu tượng thối hóa giống gây virus Bệnh virus hại khoai tây phổ biến, dễ lan truyền thông qua môi giới truyền bệnh Khoai tây trồng nhân giống củ, bị nhiễm virus toàn củ bị lây nhiễm Đây tượng thối hóa giống khoai tây gây virus Có nhiều loại virus hại khoai tây, PVY 10 loại virus phổ biến gây tổn thất suất nghiêm trọng nước nhiệt đới trồng khoai tây Việc sản xuất giống virus phải qua nhiều công đoạn phức tạp nuôi cấy mô nguyên liệu bệnh, nhân trồng vật liệu điều kiện cách ly, sản xuất củ giống vùng chuyên sản xuất giống tốn Trong giải pháp khắc phục bệnh virus, nói biện pháp hiệu có tính bền vững việc tạo sử dụng giống kháng virus Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kinh điển phương pháp lai tạo Phương pháp vấp phải khó khăn mặt di truyền NST khoai tây tứ bội (2n=4x=48) Bộ genome tứ bội tạo tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, q trình chọn lọc gặp khó khăn với quần thể lớn trước tìm lai có tính trạng mong muốn để phát triển thành giống Thông thường tạo giống khoai tây thời gian chọn lọc đòi hỏi 10-12 năm Chuyển gen kháng bệnh, gen mang tính trạng mong muốn vào trồng áp dụng chương trình chọn tạo giống nhiều trồng Cơng nghệ rút ngắn thời gian chọn tạo giống khoai tây so với phương pháp chọn tạo giống kinh điển Tuy nhiên, lo ngại an toàn sinh học thể GMO nên kỹ thuật chuyển gen vấn đề nhiều tranh luận Trước bối cảnh này, việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chuyển tích hợp gen mong muốn lên giải pháp có tính khả thi cao Dung hợp tế bào trần tạo giống khoai tây Wenzel et al., vào năm 1979 trải qua 40 năm phát triển, kỹ thuật ngày hồn thiện Với kỹ thuật i) tạo lai soma trì tính trạng mong muốn cho đời sau nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống, ii) chuyển gen tích hợp nhiều gen từ vật liệu dung hợp, iii) tái tổ hợp genome nhân tế bào tế bào chất, iv) tránh luật lệ liên quan đến chuyển gen Nhằm góp phần nghiên cứu tạo giống khoai tây mang tính kháng bệnh virus PVY, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY Việt Nam” thực Mục tiêu đề tài Ứng dụng thành công kỹ thuật tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần, xác định lai soma, chọn lọc lai backcross (BC) để tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY có đặc tính nơng sinh học mong muốn Ý nghĩa khoa học đề tài Đề tài chứng minh góp phần khẳng định khả trì tính kháng virus cải thiện đặc tính nơng sinh học dịng nhị bội qua dung hợp tế bào trần khả chuyển đặc tính kháng bệnh virus PVY từ lồi khoai tây dại Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum dung hợp tế bào trần Con lai soma làm vật liệu khởi đầu công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus mang đặc tính nơng sinh học mong muốn Đây dẫn liệu khoa học quý, mẻ phục vụ nghiên cứu, giảng dạy công nghệ tế bào thực vật, công nghệ sinh học chọn tạo giống trồng Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết nghiên cứu đề tài luận án tạo dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2, 131/11 sản phẩm dung hợp hai dòng nhị bội Solanum tuberosum dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 sản phẩm lai lại lai soma khoai tây dại khoai tây trồng Các dòng vừa có khả kháng bệnh virus, vừa mang đặc tính nơng sinh học q sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus có suất cao, phẩm chất tốt Ngoài ra, đề tài hình thành quy trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY, mang đặc tính nơng sinh học mong muốn thông qua việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần Những đóng góp đề tài • Khẳng định thơng số tách, nuôi cấy, dung hợp, tái sinh, xác định lai soma phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây dung hợp tế bào trần vật liệu khoai tây nhị bội (A15, A16, A56, B186, B208), khoai tây dại (S tarnii, S pinatisectum, S bulbocastanum) khoai tây tứ bội (Rasant, Delikat, Atlantic) • Chứng minh góp phần khẳng định khả trì tính kháng bệnh virus PVY từ dịng nhị bội khoai tây trồng Solanum tuberosum khả chuyển đặc tính kháng bệnh virus từ lồi khoai tây dại S tarnii, S pinatisectum, S, bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum qua dung hợp tế bào trần • Đã tạo dịng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2, 131/11 sản phẩm dung hợp hai dòng nhị bội Solanum tuberosum dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 sản phẩm lai lại lai soma khoai tây dại khoai tây trồng Các dịng vừa có khả kháng bệnh virus PVY vừa mang đặc tính nơng sinh học q sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus PVY có suất cao, phẩm chất tốt NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần Tổng quan tài liệu tập hợp tất nghiên cứu nước quốc tế vấn đề: tình hình sản xuất khoai tây; tìm hiểu virus hại khoai tây hướng khắc phục; phương pháp chọn tạo giống khoai tây kháng virus CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Bảng 2.1 Các vật liệu thu thập, nguồn gốc, độ bội tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma Solanum pinnatisectum Dạng vật liệu Khoai tây dại Solanum tarnii Khoai tây dại Solanum bulbocastanum Atlantic Delikat Rasant A15 Khoai tây dại Khoai tây trồng Khoai tây trồng Khoai tây trồng Dòng nhị bội Kiểu gen Ký hiệu Độ bội pnt2G 2x trn3G 2x blb2G 2x 4x 4x 4x 2x Nguồn gốc (Ngân hàng gen, công ty, Viện NC) Ngân hàng gen Khoai tây quốc tế IPK, Đức Ngân hàng gen Khoai tây quốc tế IPK, Đức Ngân hàng gen Khoai tây quốc tế IPK, Đức Mỹ Công Ty NORIKA, Đức Công Ty NORIKA, Đức Viện nghiên cứu tài nguyên Các tính trạng mục tiêu cho chọn tạo giống Kháng PVY, mốc sương Kháng PVY, mốc sương Kháng PVY, mốc sương Năng suất, chất lượng Năng suất, chất lượng Năng suất, chất lượng Kháng PVY, PVX Kiểu gen Dạng vật liệu Ký hiệu Độ bội A16 Dòng nhị bội 2x A56 Dòng nhị bội 2x B186 Dòng nhị bội 2x B208 Dòng nhị bội 2x Nguồn gốc (Ngân hàng gen, công ty, Viện NC) trồng-Bavaria – Đức Viện nghiên cứu tài nguyên trồng-Bavaria- Đức Viện nghiên cứu tài nguyên trồng-Bavaria – Đức Viện nghiên cứu tài nguyên trồng-Bavaria - Đức Viện nghiên cứu tài nguyên trồng-Bavaria - Đức Các tính trạng mục tiêu cho chọn tạo giống Kháng PVY Kháng PVY, PVX Kháng PVY, PVX Kháng PVY, PVX 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Nội dung 1: Xác định thông số tối ưu cho trình dung hợp khoai tây từ nguyên liệu nhị bội, tứ bội khoai tây dại 2.2.2 Nội dung 2: Xác định đánh giá thể lai soma tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội 2.2.3 Nội dung 3: Xác định thể lai soma tổ hợp dung hợp khoai tây dại nhị bội khoai tây trồng tứ bội Đánh giá khả kháng PVY chúng 2.2.4 Nội dung 4: Đánh giá lai backcross (BC1) thể lai soma (khoai tây dại khoai tây trồng) với khoai tây trồng 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Tách tế bào trần Theo quy trình E.C.Cooking (1960) cải tiến theo Thach et al (1993) Thieme (1997) 2.3.2 Dung hợp tế bào trần • Trộn huyền phù tế bào trần dòng bố mẹ theo tỷ lệ 1:1 • Sử dụng máy xung điện (electrofusion machine) công ty Krϋss, Đức Đặt buồng dung hợp vào kính hiển vi tủ cấy vơ trùng; hút 400 µm hỗn hợp tế bào trần dung dịch dung hợp (Fusion Solution) vào buồng xung điện • Khởi động máy xung điện với thông số sau: Trường AC Xung Lần xung Trước-AC-Sau V kHz V µs No s s s 0,0 800-1000 120 10-15 2,0 10 20 Khi bật AC 18-20 800 120 10 2,0 10 20 • Sau pha cực nhanh theo chương trình cài đặt sẵn, tác dụng luồng xung điện, tế bào trần kết hợp với (có thể quan sát kính hiển vi), chương trình ngừng lại, dùng pipet hút dịch tế bào trần vào đĩa petri (Ø = 3,5 cm) bổ sung 1,8 ml môi trường nuôi: VKM II VKM II + BSA; quấn parafilm đem nuôi cấy điều kiện 250C tối 2.3.3 Xác định lai đếm độ bội flow cytometry Phương pháp đánh giá độ bội máy Cell Lab QuantaTM Flow cytometry theo phương pháp Viện nghiên cứu chọn tạo giống trồng (CHLB Đức) 2.3.4 Chiết tách DNA tổng số DNA tổng số mẫu tách từ theo phương pháp CTAB cải tiến theo 2.3.5 Xác định lai sinh học phân tử Khi sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi SSR đa hình bố mẹ lai chúng, tiếp tục sử dụng phản ứng SSR có gắn huỳnh quang (Biomers net GMbD cung cấp) sử dụng hệ thống GenomeLab GeXP 8800 Beckman GenomeLab Coulters) để phân tích kết 2.3.6 Lây nhiễm nhân tạo PVY Phương pháp lây nhiễm nhân tạo virus PVY theo mô tả Kado (1972) Hill (1984) 2.3.7 Kiểm tra gen kháng PVY lai soma thị phân tử Tính kháng bệnh virus PVY lai soma đánh giá phương pháp thị phân tử CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic sequences) 2.3.8 Đánh giá đặc tính nơng sinh học Trong điều kiện chậu vại: Thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên hồn tồn (RCB) với cây/lần lặp, thí nghiệm lặp lại lần Trên điều kiện đồng ruộng: Thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên hồn tồn (RCB) với lần nhắc lại, diện tích thí nghiệm 30 m2 2.3.9 Phân tích tiêu hóa sinh Phương pháp định lượng đường khử (phương pháp iod-Ixekutz); Phương pháp định lượng tinh bột; Phương pháp xác định hàm lượng chất khô 2.3.10 Lai lại (backcross) số tổ hợp khoai tây có triển vọng với khoai tây trồng Thu hạt phấn khoai tây trồng (dòng bố) → Khử đực dòng nhận phấn (dòng mẹ) → Thụ phấn → Bảo quản lai thu hạt lai CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định thông số tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại khoai tây trồng 3.1.1 Nghiên cứu thông số tách tế bào trần dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại, khoai tây trồng phục vụ cho dung hợp tế bào trần 3.1.1.1 Ảnh hưởng dung dịch enzyme khác đến hiệu suất tách tế bào trần Các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại khoai tây trồng khác có cấu tạo thành phần mơ vách tế bào khác Vì vậy, việc xác định loại dung dịch enzyme có tỷ lệ enzyme phân giải cellulose pectine phù hợp với dòng hiệu suất tế bào trần thu tối đa cần thiết Các kết thí nghiệm thể Bảng 3.1: Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng đội macerozyme cellulase dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần dòng khoai tây nhị bội (Tế bào trần/ml môi trường) Dung dịch enzyme Tên dòng Dạng vật liệu A15 A16 A56 B186 B208 pnt2G trn3G blb2G Delikat Rasant Atlantic Nhị bội Nhị bội Nhị bội Nhị bội Nhị bội Khoai tây dại Khoai tây dại Khoai tây dại Khoai tây trồng Khoai tây trồng Khoai tây trồng E1 (TB x105/ml) 3,69 ± 0,24 4,12 ± 0,16 1,09 ± 0,05 3,60 ± 0,16 3,55 ± 0,08 1,61 ± 0,11 3,73 ± 0,08 3,65 ± 0,09 2,86 ± 0,12 3,80 ± 0,05 0,92 ± 0,05 E2 (TB x105/ml) 2,54 ± 0,09 1,15 ± 0,07 1,59 ± 0,09 2,35 ± 0,11 1,07 ± 0,04 3,12 ± 0,09 1,62 ± 0,10 1,52 ± 0,04 3,01 ± 0,11 1,91 ± 0,11 1,24 ± 0,06 E3 (TB x105/ml) 0,55 ± 0,05 2,65 ± 0,09 2,95 ± 0,05 0,68 ± 0,05 0,43 ± 0,02 0,86 ± 0,04 1,04 ± 0,06 1,01 ± 0,07 1,14 ± 0,09 0,78 ± 0,01 2,81 ± 0,08 Ghi chú: Dung dịch enzyme 1: 0,2% Macerozyme, 0,8% Cellulase Dung dịch enzyme 2: 0,2% Macerozyme, 0,6% Cellulase Dung dịch enzyme 3: 0,1% Macerozyme, 0,8% Cellulase Dung dịch enzyme 4: 0,1% Macerozyme, 0,6% Cellulase E4 (TB x105/ml) 0,12 ± 0,01 0,35 ± 0,03 0,74 ± 0,05 0,22 ± 0,01 0,10 ± 0,00 1,21 ± 0,04 0,34 ± 0,01 0,33 ± 0,01 0,10 ± 0,00 0,10 ± 0,00 1,11 ± 0,08 Từ kết Bảng 3.1 cho thấy: Các loại dung dịch enzyme khác có ảnh hưởng khác đến hiệu tách tế bào trần Để tách tế bào trần có hiệu suất cao nhất, dịng khoai tây nhị bội cần loại dung dịch enzyme phù hợp 3.1.1.2 Ảnh hưởng thời gian ủ mẫu dung dịch enzyme đến hiệu suất tách tế bào trần Các kết nghiên cứu cho thấy thời gian ủ mẫu dung dịch enzyme có ảnh hưởng rõ rệt đến kết tách tế bào trần Thí nghiệm tiến hành ủ mẫu thời gian ủ dung dịch enzyme khác dao động khoảng 13-16h Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian ủ dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần thu Thời gian Dòng A15 A16 A56 B186 B208 pnt2G trn3G blb2G Delikat Rasant Atlantic 13h (TB x105/ml) 1,44 ± 0,06 1,09 ± 0,04 1,24 ± 0,03 2,45 ± 0,05 2,08 ± 0,05 0,52 ± 0,01 1,01 ± 0,04 1,24 ± 0,04 1,24 ± 0,03 3,18 ± 0,04 1,92 ± 0,02 14h (TB x105/ml) 2,86 ± 0,05 2,93 ± 0,03 2,98 ± 0,02 4,56 ± 0,04 4,38 ± 0,05 1,74 ± 0,03 2,33 ± 0,04 2,63 ± 0,05 2,84 ± 0,04 4,13 ± 0,10 2,52 ± 0,04 15h (TB x105/ml) 3,39 ± 0,11 4,01 ± 0,06 3,40 ± 0,12 3,81 ± 0,07 3,95 ± 0,06 2,81 ± 0,06 3,62 ± 0,12 3,43 ± 0,11 3,55 ± 0,05 3,83 ± 0,07 3, 59 ± 0,04 16h (TB x105/ml) 2, 61 ± 0,05 3,45 ± 0,05 3,35 ± 0,07 2,76 ± 0,12 2,54 ± 0,10 3,46 ± 0,15 2,91 ± 0,08 2,41 ± 0,09 3,04 ± 0,07 2,83 ± 0,16 2,77 ± 0,10 Kết cho thấy, thời gian ủ mơ dung dịch enzym có ảnh hưởng rõ rệt đến kết tách tế bào trần, thời gian ủ thích hợp với dịng dao động từ 15 ±1 Thời gian ủ thích hợp cho mơ dịng khác khác 3.1.1.3 Ảnh hưởng tuổi in vitro đến mật độ tế bào trần thu từ mẫu Các dịng nhân in vitro mơi trường MS (Murashige and Skoog 1962) sau tách tế bào trần độ tuổi khác (2 tuần, tuần, tuần, tuần) Kết sau: Bảng 3.3 Ảnh hưởng tuổi in vitro đến mật độ tế bào trần thu từ mẫu Tuổi Dòng A15 A16 A56 B186 B208 pnt2G trn3G blb2G Delikat Rasant Atlantic tuần (TB x105/ml) tuần (TB x105/ml) tuần (TB x105/ml) tuần (TB x105/ml) 0,14 ± 0,02 1,59 ± 0,04 0,34 ± 0,02 0,85 ± 0,03 0,28 ± 0,02 0,47 ± 0,01 0,47 ± 0,01 0,28 ± 0,01 1,95 ± 0,03 1,28 ± 0,02 1,26 ± 0,04 3,69 ± 0,02 4,12 ± 0,06 2,95 ± 0,03 3,60 ± 0,09 3,55 ± 0,09 2,54 ± 0,20 2,98 ± 0,10 2,99 ± 0,10 2,60 ± 0,12 2,59 ± 0,28 2,94 ± 0,13 3,39 ± 0,08 4,01 ± 0,07 3,40 ± 0,03 2,91 ± 0,05 3, 94 ± 0,07 3,27 ± 0,05 3,48 ± 0,02 3,74 ± 0,08 3,91 ± 0,07 3,14 ± 0,04 4,02 ± 0,27 2,45 ± 0,06 2,01 ± 0,07 1,55 ± 0,04 1,87 ± 0,02 2,06 ± 0,04 2,14 ± 0,10 2,55 ± 0,22 2,72 ± 0,12 2,37 ± 0,07 2,02 ± 0,05 2,09 ± 0,03 Kết cho thấy: từ có thời gian ni cấy in vitro khác có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu tạo tế bào trần Độ tuổi in vitro thích hợp để tách tế bào trần cho tất dòng - tuần tuổi 3.1.2 Xác định thông số dung hợp tế bào trần 3.1.2.1 Ảnh hưởng tần số dung hợp số lần xung điện đến chất lượng tế bào sau dung hợp Do có nhiều tổ hợp lai nên khối lượng công việc lớn thu nhiều kết Trong khuôn khổ thời gian cho phép, luận án chọn tổ hợp lai từ tổ hợp bố mẹ nhị bội B186 (+) B208 tổ hợp lai khoai tây dại khoai tây trồng trn3G (+) Delikat để trình bày 6 Tiến hành dung hợp tế bào trần mật độ 3x 105 tế bào/ml, chất lượng tế bào thu sau xung thể qua Bảng 3.4: Bảng 3.4 Ảnh hưởng tần số dung hợp số lần tạo xung điện đến khả tạo mô sẹo tổ hợp B186 (+) B208 tổ hợp trn3G (+) Delikat STT CT CT1 CT2 CT3 CT4 CT1 CT2 CT3 CT4 Thời gian tế Thời gian xuất bào phân chia (ngày) microcallus (ngày) Tổ hợp B186 (+) B208 29,8 18,9 22,5 28,3 Tổ hợp trn3G (+) Delikat 27,3 18,2 28,7 30,3 Số lượng macrocallus/đĩa 21,5 73,4 37,6 29,2 19,5 70,8 24,6 28,8 Chú thích: CT1: 700 kHz + lần xung; CT2: 800 kHz + lần xung; CT3: 900 kHz + lần xung; CT4: 1000KHz + lần xung Từ kết Bảng 3.4 cho thấy: tần số số lần xung hợp ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng tế bào sau dung hợp Với thông số 800 kHz lần xung thích hợp cho dung hợp xung điện đối tượng dòng khoai tây nhị bội khoai tây dại khoai tây trồng 3.1.2.2 Ảnh hưởng nồng độ ion Ca2+ dịch dung hợp tới hiệu suất dung hợp Ion Ca2+ ion dẫn truyền điện tích ion khơng thể thiếu q trình dung hợp xung điện Ion Ca2+ giúp tế bào xếp thành hàng, giúp cho hiệu suất dung hợp tế bào cao Kết nghiên cứu thể qua Bảng 3.5: Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ Ca2+ đến khả kết dính thành hàng tế bào trình dung hợp (tế bào/hàng) khả tế bào phân chia sau dung hợp STT Tổ hợp lai -5 CT1 (10 ) Tế Thời bào/hàng gian phân chia (ngày) B186 (+) B208 3,1 Trn3G(+)Delikat 3,7 Nồng độ Ca2+ (M) CT2 (10-4) CT3 (10-3) Tế Thời Tế Thời bào/hàng gian bào/hàng gian phân phân chia chia (ngày) (ngày) 14,2 21,7 13,6 21,6 CT4 (10-2) Tế Thời bào/hàng gian phân chia (ngày) 10,2 10,8 Qua Bảng 3.5 cho thấy nồng độ Ca2+ có ảnh hưởng rõ rệt đến tạo hàng tế bào trình dung hợp xung điện Số tế bào/ hàng tăng tăng nồng độ Ca2+ tăng 105 M đến 10-3 M dung dịch dung hợp 3.1.2.3 Ảnh hưởng mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp Tiến hành thí nghiệm dung hợp xung điện tế bào mật độ khác để xác đinh mật độ thích hợp Kết trình bày Bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng mật độ protoplast đến kết dung hợp tổ hợp nhị bội B186 (+) B208 Mật độ xung hợp (tế bào/ml) x 105 x 105 x 105 Thời gian phân chia (ngày) 2 Số macrocallus/ đĩa* Số tái sinh** Tỷ lệ 2x (%) Tỷ lệ 4x (%) Tỷ lệ hỗn bội (%) 28,5 ± 0,3 75,7 ± 1,5 85,6 ± 0,6 16 ± 1,0 35 ± 3,8 46 ± 1,7 56,25 ± 1,5 37,14 ± 0,6 13,88 ± 0,1 25,00 ± 1.5 34,29 ± 0,9 45,65 ± 0,7 18,75 ± 2,9 28,57 ± 1,5 40,47 ± 0,8 x 105 x 105 2 68,3 ± 1,0 62,6 ± 1,0 47 ± 3,1 29 ± 2,0 14,90 ± 0,6 10,31 ± 0,5 31,91 ± 1,0 24,13 ± 2,0 53,19 ± 0,4 65,56 ± 2,4 Chú thích: *sau tuần nuôi cấy môi trường Cul-medium, **sau 2-3 tháng nuôi cấy môi trường RJM Từ kết Bảng 3.6 cho thấy: mật độ ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào tỷ lệ lai tứ bội tạo thành Mật độ tế bào tối ưu để tạo tứ bội 3x 105 tế bào/ ml Bảng 3.7 Ảnh hưởng mật độ protoplast đến kết dung hợp xung điện tổ hợp khoai tây dại khoai tây trồng Trn3G (+) Delikat Mật độ dung hợp (tế bào/ml) Thời gian phân chia (ngày) Số macrocallus/đĩa Sau tuần Số tái sinh Sau tuần x 105 32,5 ± 0,5 21 ± 1,2 x 105 x 105 x 105 x 105 2 2 65,7 ± 0,8 74,6 ± 0,6 88,3 ± 0,5 72,6 ± 0,8 55 ± 1,5 66 ± 2,0 81 ± 0,6 68 ± 2,3 Tỷ lệ 2x (%) Tỷ lệ 4x (%) Tỷ lệ 6x (%) Tỷ lệ hỗn bội (%) 25,3 ± 0,9 45,0 ± 1,0 14,4 ± 1,2 16,2 ± 1,4 10,3 ± 0,7 2,3 ± 0,4 0,0 ± 0,0 30,9 ± 1,0 10,6 ± 0,1 9,6 ± 0,4 10,8 ± 0,2 32,3 ± 1,4 58,4 ± 1,6 61,9 ± 0,8 48,2 ± 1,5 15,3 ± 1,6 20,7 ±1,8 20,7 ±1,4 26,2 ±0,7 41,0 ±1,7 Như mật độ tế bào tối ưu cho hiệu dung hợp tạo lai 4x x 105 tế bào/ml; lai 6x x 105 tế bào/ml 3.1.3 Nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp 3.1.3.1 Ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy lỏng sau dung hợp đến phân chia tái sinh microcallus tổ hợp lai sau dung hợp Tế bào trần tổ hợp lai sau dung hợp nuôi cấy loại môi trường lỏng khác nhau: môi trường VKM II (Thieme et al., 1997), Medium A* (Ehsanpour et al., 2001), KM8P* (Paula Conde et al., 2006) trình bày bảng Bảng 3.8 Sự phân chia tổ hợp lai nhị bội tổ hợp lai khoai tây dại khoai tây trồng môi trường nuôi cấy khác Môi trường VKM II A* KM8P* Thời gian xuất tế bào phân chia (ngày) Thời gian xuất microcallus (ngày) Số lượng microcallus trung bình/đĩa petri trn3G(+)Delikat B186(+)B208 trn3G(+)Delikat B186(+)B208 trn3G(+)Delikat B186(+)B208 12 21 - 18 28 35,7 5,8 - 33,8 4,7 Chú thích: - tế bào khơng phân chia Như vậy, mơi trường VKM II mơi trường thích hợp để nuôi cấy tạo microcallus tế bào trần sau dung hợp 3.1.3.2 Ảnh hưởng môi trường tái sinh khác đến tái sinh chồi tổ hợp lai Các tổ hợp lai sau dung hợp phân chia tạo microcallus môi trường lỏng VKM II sau 3-4 tuần nuôi cấy, chuyển sang nuôi cấy đĩa peptri lớn ( 9cm), chứa môi trường rắn Cul-medium (Moller et al, 1992) đặt điều kiện 16 chiếu sáng, cường độ ánh sáng 4000 lux nhiệt độ 210C để tạo macrocallus Sau 3-8 tuần, chuyển macrocallus vào môi trường tái sinh khác Thí nghiệm theo dõi 10 đĩa petri/tổ hợp lai, đĩa petri cấy 10 macrocallus Mỗi callus lấy chồi lấy số lượng chồi trung bình/đĩa Kết thể Bảng 3.9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng môi trường tái sinh khác đến khả tạo chồi tổ hợp lai Tổ hợp lai Số lượng chồi tái sinh/chất lượng chồi Môi trường RJM Môi trường MSO Môi trường K8P B186 (+) B208 7,4/++ 2,6/+ 0,0/ trn3G (+) Delikat 8,4/++ 0,0/ 1,8/Chú thích: (-) Chồi yếu, màu trắng; (+) Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; (++) chồi tốt, mập, xanh Từ kết Bảng 3.9 cho thấy môi trường khác có ảnh hưởng rõ rệt đến khả tái sinh tạo chồi tổ hợp lai Môi trường tối ưu để tạo chồi tổ hợp lai RJM Kết luận: Từ thí nghiệm dung hợp, tái sinh khẳng định thông số tối ưu sau: + Tần số dung hợp số 800 kHz lần xung + Nồng độ Ca2+ dung dịch dung hợp xung điện thích hợp 10-3 M + Mật độ tế bào dung hợp thích hợp với tổ hợp khoai tây nhị bội x 105 tế bào/ml; với tổ hợp khoai tây dại khoai tây trồng x 105 tế bào/ml + Các tế bào sau dung hợp nôi cấy môi trường VKM II để tạo microcallus tái sinh môi trường RJM 3.2 Xác định đánh giá thể lai soma tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x) 3.2.1 Tạo lai Có 10 tổ hợp lai tạo thành từ nguyên liệu nhị bội chọn lọc (A15, A16, A56, B186, B208) Tuy nhiên, khả tái sinh tổ hợp không đồng Trong khuôn khổ thời gian cho phép, luận án trình bày kết tổ hợp lai có khả sinh trưởng, phát triển tốt để báo cáo Kết trình bày Bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết dung hợp, nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai nhị bội sau dung hợp TT Tổ hợp lai Sự tái sinh tổ hợp lai Số lượng callus đem tái sinh Số lượng cây (callus) tái sinh (cây) 1026 ± 11,4 25 ± 1,5 375 ± 8,1 53 ± 3,2 175 ± 9,6 25 ± 2,1 1576 103 Tỷ lệ tái sinh (%) 2,43 14,13 14,28 6,54 A15 (+) A56 A16 (+) B186 B186 (+) B208 Tổng Kết tái sinh Bảng 3.10 cho thấy tỷ lệ tái sinh thành phụ thuộc vào tổ hợp genotype khác Tổ hợp B186 (+) B208 có tỷ lệ tái sinh cây/ callus cao đạt 25 cây/ 175 callus đem tái sinh đạt 14,28%; tổ hợp A15 (+) A56 có tỷ lệ tái sinh cây/ callus thấp nhất, đạt 2,43% Từ 1576 callus tổ hợp dung hợp đem tái sinh thu 103 cây, đạt tỷ lệ tái sinh trung bình 6,54% Các lai ngẫu nhiên đồng hợp nhân (homozygous) dị hợp nhân (heterozygous) Một khâu quan trọng kỹ thuật lai soma phải chọn lọc xác có kiểu gen dị hợp nhân Nghiên cứu thực phương pháp xác định khác để từ quần thể lai tái sinh tìm lai soma từ cung cấp nguồn vật liệu quan trọng cho công tác chọn tạo giống khoai tây 3.2.2 Xác định độ bội thể tái sinh Sử dụng máy Flow cytometry để đo độ bội lai Kết thể Bảng 3.11, Hình 3.6 Bảng 3.11 Kết xác định độ bội lai sau dung hợp Tổ hợp lai A15 (+) A56 A16 (+) B186 B186 (+) B208 Tổng Số tái sinh (dòng) 25 ± 0,6 53 ± 1,7 25 ± 1,2 103 Cây nhị bội (cây) Cây tứ bội (cây) Cây hỗn bội (cây) ± 0,6 15 ± 1,0 ± 0,6 27 13 ± 0,6 17 ± 1,0 20 ± 0,6 60 ± 0,6 21 ± 1,7 0±0 26 Kết Bảng 3.11 cho thấy: 103 chồi tái sinh từ callus tổ hợp lai tỷ lệ lai có độ bội 2n = 4x đạt 60 (chiếm 58,3%) Trong tổ hợp dung hợp tổ hợp B186 (+) B208 có tỷ lệ lai tứ bội cao nhất, đạt 80% Tỷ lệ lai có độ bội 2n=4x thu chiếm đa số, đạt 58,3% so với tổng số tái sinh 9 Mẫu đối chứng chuẩn (2n=2x) Dòng bố mẹ (2n=2x) Con lai lục bội (2n=6x) Con lai tứ bội (2n=4x) Hình 3.6 Hình ảnh độ bội dòng khoai tây “bố mẹ” lai Sử dụng máy flow cytometry xác định 60/103 dòng lai tứ bội Tuy nhiên, kết bước đầu việc khẳng định lai soma sau dung hợp Các lai tứ bội tạo thành tế bào trần cùng dòng “bố” “mẹ” dung hợp tạo thành, tức khơng phải lai có kiểu gen dị hợp nhân Chính cần xác định xác lai soma phương pháp dùng thị phân tử 3.2.3 Xác định lai soma thị phân tử Kết xác định lai soma với mồi STM 3023 hệ thống GenomeLab GeXP 8800 thể Bảng 3.12 Bảng 3.12 Kết xác định lai soma tổ hợp dung hợp Tổ hợp lai A15 (+) A56 A16 (+) B186 B186 (+) B208 Tổng Số tứ bội (2n= 4x) (cây) 13 17 20 60 Số lai soma (cây) 12 16 36 Tỷ lệ lai soma (%) 92,31 47,06 80,00 60 Kết Bảng 3.12 cho thấy tổng số 60 tứ bội có 36 tái sinh lai dị hợp nhân chiếm 60% Tổ hợp A15 (+) A56 có 13/60 tứ bội lại tổ hợp có 12/13 lai soma, chiếm tỷ lệ cao (92,31%) tổ hợp dung hợp Một lượng lớn tứ bội tái sinh lại lai soma, chúng kết dung hợp hai tế bào trần cùng dòng “bố” dòng “mẹ” 10 Hình 3.9 Xác định lai soma tổ hợp B186(+)B208 với cặp mồi STM 3023 Hình 3.9 biểu thị kích thước alen dịng “bố”, dịng “mẹ” dòng lai soma phát hệ thống điện di mao quản với mồi STM 3023 Có thể nhận thấy kích thước alen dịng nhị bội “bố mẹ” hai cặp base: tổ hợp B186 (+)B208 cho kết dòng “bố mẹ” hai cặp base lai soma xác định có peak có kích thước alen tương tự với peak “bố mẹ” 11 3.2.4 Đánh giá phẩm chất củ của lai soma điều kiện chậu vại Trong nội dung chọn lọc lai, chọn lọc 36 lai dị hợp tử tetraploid (4x) Tuy nhiên, tách dòng đánh giá chọn lọc điều kiện in vitro có 15 dịng số tổ hợp cho khả sinh trưởng phát triển tốt Các dòng đánh giá phẩm chất củ điều kiện chậu vại Các tiêu hóa sinh thể qua Bảng 3.13 Bảng 3.13 Một số tiêu hóa sinh dịng lai soma khoai tây dịng ngun liệu STT Kí hiệu A15 A16 A56 B186 B208 10 47/7 47/11 47/14 47/24 47/26 11 81-2 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21-1 130/2 131/1 131/3 131/4 131/5 131/10 131/11 131/12 Hàm lượng chất khơ (%) Đường khử (%) Các dịng bố mẹ 20,52 0,25 17,41 0,25 20,13 0,18 18,31 0,21 17,70 0,20 Con lai tổ hợp lai A15 (+) A56 20,47 0,14 20,11 0,45 20,35 0,13 20,23 0,18 22,78 0,13 Con lai tổ hợp lai A16 (+) B186 20,06 0,15 Con lai tổ hợp lai B208 (+) B186 20,57 0,19 20,81 0,25 16,62 0,39 15,97 0,22 20,85 0,27 19,78 0,42 14,03 0,56 20,91 0,14 20,02 0,41 Tinh bột (%) 94,88 88,45 94,43 88,69 87,63 92,97 95,18 92,14 90,01 96,95 97,46 90,35 96,68 86,40 89,04 92,76 92,52 88,24 97,42 95,90 Hàm lượng đường khử tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng giống khoai tây chế biến Chỉ tiêu thấp tốt chế biến miếng khoai tây khơng bị đổi màu nâu hóa Bên cạnh đó, hàm lượng tinh bột yếu tố quan tâm Củ khoai tây có hàm lượng cao chế biến chip giịn, khó gãy, vỡ Kết luận: Như qua đánh giá tổ hợp lai, lai có củ phù hợp với hướng chế biến khoai tây chip 47/7; 47/26; 81-2; 131/11 Đây dịng có triển vọng phẩm chất chế biến, cần tiếp tục đánh giá để phục vụ cơng tác chọn giống 3.2.5 Kiểm tra có mặt gen kháng lai soma từ vật liệu nhị bội Trong nghiên cứu sử dụng thị phân tử liên kết chặt với gen Rysto GP 122406 nhân đoạn DNA có kích thước 406 bp, sau dùng enzym EcoV để cắt Kết thể qua hình 3.10, 3.11: 12 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406 liên kết chặt với gen Rysto bố mẹ nhị bội lai soma Chú thích 1: A15; 2: A16; 3: A56; 4: B208; 5: B186; 6: 47/7; 7: 47/11; 8: 47/14; 9: 47/24; 10: 47/26; 11: 81-2; 12: 21-1; 13: 130/2; 14: 131/1; 15: 131/3; 16: 131,4; 17: 131/5; 18: 131/10; 19: 131/11; 20: 131/12 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR cắt với enzym cắt giới hạn EcoRV Chú thích 1: A15; 2: A16; 3: A56; 4: B208; 5: B186; 6: 47/7; 7: 47/11; 8: 47/14; 9: 47/24; 10: 47/26; 11: 81-2; 12: 21-1; 13: 130/2; 14: 131/1; 15: 131/3; 16: 131,4; 17: 131/5; 18: 131/10; 19: 131/11; 20: 131/12 Từ kết điện di hình 3.10 3.11 cho thấy tất dòng bố mẹ dòng lai soma khoai tây chứa gen siêu kháng Rysto Từ đây, khẳng định lai soma tạo dung hợp tế bào trần có chứa gen kháng virus từ “bố mẹ” chúng 3.3 Xác định thể lai soma tổ hợp dung hợp khoai tây dại (2n=2x) khoai tây trồng (2n = 4x) Đánh giá khả kháng virus PVY chúng Các dòng khoai tây dại khoai tây trồng tách tạo tổ hợp dung hợp với thông số xác định từ nội dung tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần dịng nghiên cứu Có tổ hợp kết hợp từ dòng khoai tây dại dòng khoai tây trồng Tuy nhiên, sau trình dung hợp, có tổ hợp lai cho kết tái sinh tốt Sáu tổ hợp lai tỷ lệ tái sinh tổ hợp thể qua Bảng 3.14 Bảng 3.14 Kết nuôi cấy tái sinh chồi tổ hợp lai sau dung hợp STT Tên tổ hợp lai Số lượng callus tái sinh Số lượng chồi tái sinh Tỷ lệ tái sinh (%) trn3G (+) Rasant trn3G (+) Delikat 97 250 25 64 25,8 25,6 trn3G (+) Atlantic pnt2G (+) Atlantic pnt2G (+) Delikat blb2G + Delikat 395 193 53 250 23 26 31 0,50 11,9 49,06 12,4 13 Tổng 1238 171 Từ Bảng 3.14 cho thấy tổ hợp lai khác khả tạo callus, tái sinh chồi khác Các tổ hợp lai trn3G (+) Delikat, pnt3G (+) Delikat, trn3G (+) Rasant có khả tái sinh cao 49,06%, 25,6%, 25,8% Các chồi phát triển tốt Các chồi tách dịng, phân tích độ bội sinh học phân tử để xác định lai dị hợp tử 3.3.1 Xác định lai soma khoai tây dại khoai tây trồng đo độ bội thể Sử dụng phương pháp phân tích độ bội thể Flow cytometry để đo độ bội lai tái sinh tổ hợp lai Kết thể Bảng 3.15, Hình 3.13 Bảng 3.15 Kết tái sinh phân tích độ bội thể tổ hợp lai khoai tây dại khoai tây trồng sau dung hợp Độ bội (dòng) 2n = STT Tên tổ hợp lai Số lượng chồi tái sinh 2x 4x 6x Hỗn bội (2n>6) trn3G (+) Rasant trn3G (+) Delikat trn3G (+) Atlantic pnt2G (+) Atlantic pnt2G (+) Delikat blb2G (+) Delikat Tổng 64 25 23 26 31 171 13 0 5 23 10 14 42 25 20 11 15 80 21 0 26 Hình 3.12 Hình ảnh độ bội thể dòng khoai tây “bố mẹ” lai Chú thích: A- Giống khoai tây trồng (4x), B- Dịng khoai tây dại (2x), C- lai soma lục bội (6x) Kết cho thấy từ 171 chồi tái sinh sau dung hợp có 80 có độ bội 2n = 6x Tỷ lệ lục bội (2n = 6x) phụ thuộc vào tổ hợp dung hợp khác Trong tổ hợp dung hợp tổ hợp lai trn3G (+) Delikat cho tỷ lệ tái sinh có độ bội 6x cao (20/25 dịng) tổ hợp lai trn3G (+) Atlantic khơng cho kết tạo lai lục bội 3.3.2 Xác định lai soma khoai tây dại, khoai tây trồng thị phân tử SSR Các lai 6x xác định thị phân tử SSR (Dinu and Thieme, 2001), sử dụng cặp mồi theo Song et al (2005) Hình 3.13 minh họa kết điện di cho phân tích thị SSR sử dụng cặp mồi STM2022 nhằm xác định kiểu gen dị hợp nhân dòng lục bội tổ hợp lai trn3G+ Rasant 25 dịng lai tái sinh có khả phát triển tốt không bị biến dị tổ hợp lai dịng dại trn3G giống Rasant phân tích có lai lục bội có kiểu gen dị hợp nhân 14 Hình 3.13 Kết điện di cho phân tích thị phân tử STM2022 để xác định kiểu gen dị hợp nhân tổ hợp lai trn3G (+) Rasant Chú thích: giếng 1- trn3G; giếng 2- Rasant; giếng 3-27 25 dòng lai tái sinh tổ hợp lai trn3G (+) Rasant Trong đó, có lai lục bội dị hợp nhân gồm: giếng 6- lai, giếng 12- lai, giếng 20: lai, giếng 21- lai, giếng 22- lai, giếng 24- lai Bảng 3.16 Kết sử dụng marker phân tử xác định lai soma Tổ hợp lai trn3G (+) Rasant trn3G (+) Delikat trn3G (+) Atlantic pnt2G (+) Atlantic pnt2G (+) Delikat blb2G (+) Delikat Tổng Số xác định độ bội 64 25 23 26 31 171 Số dòng lục bội (2n= 6x) 25 20 11 15 80 Số dòng lai soma (Hetezygous) 18 14 53 Tỷ lệ lai/dòng tái sinh (%) 9.4 72.0 0.0 26.1 34.6 45.2 Tên mồi xác định lai STM2022, STIIKA STM2022 STM1104 STM3023 STM3023 STM2022 Kết Bảng 3.16 cho thấy số 171 lai tái sinh có 80 có độ bội 6x có 53 có kiểu gen dị hợp nhân 3.3.3 Kiểm tra có mặt gen kháng PVY lai soma khoai tây dại khoai tây trồng Từ 53 lai thu trên, chọn lọc 13 lai dị hợp tử có khả sinh trưởng phát triển tốt, không bị biến dị điều kiện in vitro Các lai kiểm tra có mặt gen kháng Rysto, sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR mẫu phân tích với cặp mồi GP 122406 thể Hình 3.14 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GP 122406 ADN lai soma dòng bố mẹ khoai tây dại khoai tây trồng Chú thích: Ladder, 1- pnt2; 2- trn3; 3- blb2G; 4- 838/11; 5- 851/2; 6- 2195/2; 7- 2196/4; 8-2235/1; 9- 2044/1; 10- 1/6; 11- 3/9; 12- 248/1; 132281/10; 14- 2283/5; 15- 2292/4; 16- 2295/1; 17- Delikat; 18- Rasant; 19- Atlantic Kết điện di kiểm tra cho thấy tồn dịng khoai tây phân tích thu băng ADN có kích thước 406bp Sản phẩm PCR thu tinh tiếp tục ủ với enzyme giới hạn EcoRV, sau điện di kiểm tra Kết thể qua hình 3.15 15 Hình 3.15 Kết điện di kiểm tra gen kháng virus PVY dòng lai soma dòng bố mẹ khoai tây dại khoai tây trồng Chú thích: Ladder, 1- pnt2; 2- trn3; 3- blb2G; 4- 838/11; 5- 851/2; 6- 2195/2; 7- 2196/4; 82235/1; 9- 2044/1; 10- 1/6; 11- 3/9; 12- 248/1; 13- 2281/10; 14- 2283/5; 15- 2292/4; 162295/1; 17- Delikat; 18- Rasant; 19- Atlantic Quan sát Hình 3.15 cho thấy sản phẩm ủ với EcoRV xuất vạch băng tương ứng với kích thước 200bp 206bp tất giếng (từ giếng – 16) Như tất mẫu ADN các lai có mặt gen kháng virus PVY Điều đồng nghĩa với việc dòng lai soma chuyển gen kháng bệnh từ dịng khoai tây dại thơng qua dung hợp 3.3.4 Đánh giá khả kháng PVY lai soma khoai tây dại khoai tây trồng lây nhiễm nhân tạo Các lai soma bố mẹ chúng đánh giá khả kháng virus lây nhiễm nhân tạo Kết lây nhiễm kiểm tra kit test DAS-ELISA Bảng 3.17 Kết mức độ kháng bệnh lai 4x sau lây nhiễm nhân tạo STT Dòng N/B Tỷ lệ nhiễm% Atlantic 10/10 100 Delikat 10/10 100 12 2281/10 0/10 Rasant 10/10 100 13 2283/5 0/10 pnt2G 0/10 14 2292/4 0/10 trn3G 0/10 15 2295/1 0/10 blb2G 0/10 Con lai tổ hợp trn 3G (+) Delikat STT Dòng N/B Tỷ lệ nhiễm% Con lai tổ hợp blb2G+Delikat Con lai tổ hợp ptn2G (+) Rasant 16 2044/1 0/10 Con lai tổ hợp trn3G (+) Rasant 838/11 0/10 851/2 0/10 17 1/6 0/10 2195/2 0/10 18 3/9 0/10 Con lai tổ hợp pnt2G (+) Delikat Con lai tổ hợp pnt2G (+) Atlantic 10 2196/4 0/10 19 248/1 0/10 11 2235/1 0/10 ĐC Thuốc 10/10 100 Kết đánh giá cho thấy tất dòng lai soma khoai tây dại (trn3G, pnt2G) không bị nhiễm virus, dịng khoai tây trồng (100%) bị nhiễm với PVY sau lây nhiễm nhân tạo Điều chứng tỏ gen kháng virus khoai tây dại chuyển sang dòng lai soma 3.3.5 Đánh giá lai soma khoai tây dại khoai tây trồng tính trạng nơng sinh học phẩm chất củ Cùng với khả kháng lại bệnh hại khả sinh trưởng phát triển tiêu quan trọng ảnh hưởng tới suất chất lượng khoai tây thu trồng Đây liệu quan trọng để nhà chọn tạo giống xem xét để đề xuất dịng triển vọng làm giống Kết Bảng 3.18 cho thấy đa số lai tạo có hình thái tương tự với khoai tây trồng (tuberosum) trừ lai 245/6 tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic Khả hoa lai soma khác Đặc biệt, lai tổ hợp blb2G (+) Delikat có khả hoa cao đạt thang điểm đánh giá từ 5, 7, Đây lai có triển vọng cho chọn tạo giống lai có khả hoa tiếp tục lai trở với khoai tây trồng để chọn tạo giống khoai tây mang đặc tính mong muốn 16 Do trồng từ in vitro chuyển trồng điều kiện chậu vại nên dịng đạt suất, số củ/khóm khối lượng củ/khóm đạt khơng cao Chỉ tiêu khối lượng trung bình củ/khóm (klc TB/khóm) yếu tố quan trọng để đánh giá suất khoai tây điều kiện chậu vại Từ kết Bảng 3.18 cho thấy có dịng lai soma 851/2 (185g/khóm) tổ hợp trn3G (+) Delikat cho suất cao so với bố mẹ khoai tây trồng ý nghĩa thống kê, dịng soma khác cho khối lượng củ/khóm thấp Điều dịng dại thường cho củ, trọng lượng củ thấp, chí số dịng khơng có khả khăng củ nên lai soma tạo khoai tây dại khoai tây trồng thường cho trọng lượng trung bình thấp khoai tây trồng Để cải thiện điều này, dòng soma lai lại với khoai tây trồng Qua q trình đánh giá có số số lai soma có xuất biến dị thân, lá, hoa củ (Hình 3.18) Nguyên nhân tượng lai soma tạo từ phép lai dung hợp khác loài khoai tây dại khoai tây trồng Các lai xa mang số đặc điểm hình thái khoai tây dại, đặc điểm khác với khoai tây trồng Các biến dị lai lại với khoai tây trồng Các lai tạo sau phép lai lại dần có tính trạng hình thái giống với khoai tây trồng mà khơng bị tính trạng mong muốn khoai tây dại A A B C Hình 3.18 Các biến dị lai soma Chú thích từ trái sang phải: A: Hình thái giống Atlantic, 248/1 245/6 B: Hoa nhị Ransant lai soma 1/6, 3/9 tổ hợp lai trn3G Rasant C: Biến dị hình dạng củ lai soma 1/6 3/9 tổ hợp lai trn3G Rasant Kêt luận: - Đánh giá khả kháng bệnh virus PVY qua lây nhiễm nhân tạo lai soma cho thấy lai soma có khả kháng bệnh virus PVY Kết khẳng định chuyển thành công gen kháng virus PVY từ khoai tây dại sang dòng lai soma - Qua đánh giá đặc tính nơng sinh học cho thấy nhiều lai soma có kiểu hình tương đối giống với khoai tây trồng Tuy nhiên, tìm thấy số biến dị số lai Năng suất lai soma thấp khoai tây trồng bố mẹ nên cần phải tiếp tục chọn lọc lai trở lại với giống khoai tây trồng 17 Klc TB/khóm (gam) Slc TB/khóm (củ/khóm) Độ sâu mắt ngủ 1-9 Màu thịt củ: 1-10 Màu vỏ củ 1-8 Dạng củ 1-6 1=tròn, 6=dài Khả hoa 1-9 9=rất cao Hình thái cây/sức sinh trưởng Ký hiệu dòng Tên giống Bảng 3.18 Đánh giá đặc tính nơng sinh học lai soma điều kiện chậu vại Atlantic T,+++ 2 3,9a±1,1 128,3a±19,12 Rasant T,+++ b b Delikat T,+++ 3 8,03 ±2,25 169,6 ±18,2 S tarnii trn 3G W,+ c c S pinnatisectum pnt2G W,++ 4,88 ±1,4 88,4 ±8,8 S bulbocastanum blb2G W, ++ pnt2G (+) Atlantic 248/1 T,++ 5,2d±1,2 108,9d±15,4 pnt2G(+) Rasant 2044/1 T,++ 5 4,7e±2 151,1e±19,4 e trn3G (+) Delikat 838/11 T, ++ 4,56 ±1,5 102,2d±11,4 trn3G (+) Delikat 851/2 T, ++ 5 4,89de±3,6 185,00f±8,3 trn3G (+) Delikat 2195/2 W,+++ 2 3 2,2f±0,44 105,6d±14 de pnt2G (+) Delikat 2196/4 T,+++ 4,78 ±2,5 141,1g±17,9 pnt2G (+) Delikat 2235/1 T,+++ 3,6a±0,13 97,6h±14,4 f trn3G (+) Rasant 1/6 T, ++ 2,67 ±2,5 98,3h±10 trn3G (+) Rasant 3/9 T,++ 2,6f±2,56 125,6i±4,1 a blb2G (+) Delikat 2281/10 T,+++ 5 3,6 ±1,3 97,8h±14,4 blb2G (+) Delikat 2283/5 T,+++ 3 4,4de±1,8 142,2g±2,94 blb2G (+) Delikat 2292/4 T,+++ 3 4,3e±0,8 118,9i±6,4 f blb2G (+) Delikat 2295/1 T,+++ 3 2,6 ±0,3 106,1d±17,9 LSD0,05 0,47 7,39 CV% 7,6 4,7 Chú thích: (-) khơng xác định; (+)= yếu, (++)= Trung bình; (+++) = Khỏe; T = dạng khoai tây trồng, W= dạng dại, chữ a, b,c… khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức α=0,05 18 3.4 Đánh giá lai backcross (BC1) thể lai soma (khoai tây dại khoai tây trồng) với khoai tây trồng 3.4.1 Lai hữu tính lai soma (của khoai tây dại khoai tây trồng) với giống khoai tây trồng chọn lọc lai có đặc tính mong muốn 3.4.1.1 Chọn lọc lai Con lai soma 6x tạo từ tổ hợp khoai tây dại khoai tây trồng thường mang nhiều biến dị khác xa so với khoai tây trồng Để tổ hợp đặc tính khoai tây trồng vào lai soma, lai soma thường lai lại với khoai tây trồng (sử dụng khoai tây trồng làm bố) Lựa chọn lai có khả hoa cao để làm mẹ Các phép lai hữu tính tiến hành Sapa – Lào Cai vào năm 2016 Các hạt lai gieo nảy tiếp tục đánh giá, sàng lọc tính kháng PVY tính trạng nông sinh học Kết lai tạo thể qua Bảng 3.19 Bảng 3.19 Kết lai hữu tính lai soma khoai tây trồng tứ bội STT Tổ hợp lai soma (dòng mẹ) Ký hiệu dòng mẹ Cây bố Số thu Số hạt thu Ký hiệu trn3G (+) Delikat pnt2G (+) Delikat trn3G (+) Delikat 2195/2 2235/1 2195/2 Rasant Atlantic Delikat 10 19 178 62 484 13.1300 13.1301 13.1302 blb2G (+) Delikat 2283/5 Delikat 18 352 13.1303 pnt2G (+) Delikat 2235/1 Delikat 21 738 13.1304 pnt2G (+) Delikat 2235/1 Rasant 23 95 284 2098 13.1305 Tổng Kết lai hữu tính thu 95 lai tổ hợp lai, đếm tổng số 2098 hạt lai Một lượng lớn hạt lai tạo ra, hạt lai dòng lai BC1 cần đánh giá đặc tính nơng sinh học tính kháng bệnh virus, nhằm đánh giá hiệu phương pháp chọn tạo giống khoai tây dung hợp tế bào kết hợp lai hữu tính 3.4.1.2 Chọn lọc lai BC1 có khả kháng virus PVY Để giảm tải công việc chọn lọc đánh giá số lượng lớn hạt lai BC1 (2098 hạt) việc sàng lọc tính kháng giai đoạn quan trọng Sàng lọc sinh trưởng phát triển yếu, khơng có khả kháng virus giúp cho việc theo dõi, đánh giá thí nghiệm thuận lợi Các hạt lai BC1 sau xử lý ngủ nghỉ với GA3 qua đêm gieo giá thể mùn tơi xốp Bảng 3.20 Khả nảy mầm hạt lai BC1 STT Tổ hợp trn3G (+) Delikat pnt2G (+) Delikat trn3G (+) Delikat blb2G (+) Delikat pnt2G (+) Delikat pnt2G (+) Delikat Dòng “mẹ” 2195/2 2235/1 2195/2 2283/5 2235/1 2235/1 Tổng Dòng “bố” Rasant Atlantic Delikat Delikat Delikat Rasant Ký hiệu dòng lai BC1 1300 BC1 1301 BC1 1302 BC1 1303 BC1 1304 BC1 1305 Số hạt gieo 70 30 60 70 50 35 315 Số hạt nảy mầm (hạt) 50 12 48 36 32 12 190 Số khỏe 16 11 10 55 Khi có thật, chuyển sinh trưởng phát triển khỏe sang chậu vại để tiến hành lây nhiễm nhân tạo với PVY Sử dụng que thử nhanh virus hãng Agdia để chọn lọc dòng bệnh Kết trình bày Bảng 3.21 Bảng 3.21 Đánh giá khả kháng bệnh virus lai BC1 giai đoạn Ký hiệu dòng lai BC1 1300 BC1 1301 Số lây nhiễm 16 Số virus Tỷ lệ virus 37,5 33,3 19 BC1 1302 BC1 1303 BC1 1304 BC1 1305 Tổng 11 10 55 2 26 81,8 40,0 50,0 40,0 47,3 Trong 55 dịng lai lây nhiễm virus có 26 dịng khơng bị nhiễm bệnh đạt 47,3% Hai sáu dịng lai bệnh tiếp tục theo dõi để chọn dịng có tiềm năng suất đặc tính nơng sinh học giống khoai tây trồng 3.4.1.3 Chọn lọc lai BC1 có đặc tính nơng sinh học mong muốn Các dịng lai BC1 sau chọn lọc kháng virus chăm sóc, theo dõi đặc tính nơng sinh học để chọn lọc dòng lai triển vọng để khảo nghiệm tiếp vụ sau Bảng 3.22 Bảng đánh giá hình thái kiểu sinh trưởng lai BC1 STT Kí hiệu dịng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 ĐC BC1 1300.3 BC1 1300.6 BC1 1300.9 BC1 1300.13 BC1 1300.14 BC1 1300.16 BC1 1301.4 BC1 1301.5 BC1 1301.11 BC1 1302.1 BC1 1302.2 BC1 1302.3 BC1 1302.4 BC1 1302.5 BC1 1302.6 BC1 1302.7 BC1 1302.11 BC1 1302.10 BC1 1303.2 BC1 1303.3 BC1 1303.4 BC1 1303.6 BC1 1303.22 BC1 1304.1 BC1 1304.3 BC1 1305.6 Solara (ĐC) Cấu trúc tán Kiểu sinh trưởng Hình thái/sức sinh trưởng Trung gian Dạng Lá Dạng Lá Trung gian Trung gian Dạng Lá Dạng Thân Trung gian Dạng Thân Dạng Thân Dạng Thân Trung gian Dạng Thân Dạng Thân Trung gian Trung gian Trung gian Dạng Thân Trung gian Trung gian Dạng Lá Trung gian Dạng Lá Trung gian Trung gian Dạng Thân Trung gian Đứng Nửa đứng Nửa đứng Đứng Nửa đứng Nửa đứng Đứng Bò Bò Nửa đứng Nửa đứng Nửa đứng Nửa đứng Đứng Nửa đứng Nửa đứng Nửa đứng Đứng Nửa đứng Đứng Bò Đứng Nửa đứng Nửa đứng Nửa đứng Nửa đứng Nửa đứng T, +++ T, ++ T, +++ T, +++ T, +++ T, +++ T, +++ T, ++ T, ++ T, ++ T, +++ T, +++ T, +++ T, ++ T, +++ T, ++ T, +++ T, ++ T, +++ T, ++ T, +++ T, +++ T, +++ T, +++ T, + T, +++ T, +++ Chú thích: T: dạng trồng; + yếu; ++ trung bình; +++ khỏe Kết Bảng 3.22 cho thấy: Trong tổ hợp lai dịng khác có khác cấu trúc tán kiểu sinh trưởng dòng lai Điều phân ly phép lai hữu tính Các dịng lai BC1 có sức sinh trưởng tốt, tương đương với khoai tây trồng Solara, ngoại trừ dòng BC1 1304.3 Dòng có kiểu hình giống với khoai tây trồng, khơng cịn hình dạng giống với khoai tây dại sức sinh trưởng lại yếu Bảng 3.23 Bảng đánh giá suất hình thái củ lai BC1 20 STT Kí hiệu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 BC1 1300.3 BC1 1300.6 BC1 1300.9 BC1 1300.13 BC1 1300.14 BC1 1300.16 BC1 1301.4 BC1 1301.5 BC1 1301.11 BC1 1302.1 BC1 1302.2 BC1 1302.3 BC1 1302.4 BC1 1302.5 BC1 1302.6 BC1 1302.7 BC1 1302.11 BC1 1302.10 BC1 1303.2 BC1 1303.3 BC1 1303.4 BC1 1303.6 BC1 1303.22 BC1 1304.1 BC1 1304.3 BC1 1305.6 slc/cây Kltbc/cây (củ) (gam) 11 11 16 7 13 11 9 12 18 12 5 20 130,4 120,8 120,1 60,8 50,8 190,8 170,1 150,7 130,4 120,1 70,1 60,8 140,8 120,8 150,1 100,7 90,8 50,2 180,1 60,5 150,3 100,4 180,1 150,6 50,4 140,1 Dạng củ Màu vỏ củ Ovan dài Vàng Ovan Tím Ovan dài Nâu đỏ Ovan Vàng Ovan Nâu đỏ Ovan dài Vàng Trịn Vàng Ovan Tím Ovan Tím đậm Ovan dài Kem nhạt Ovan Kem nhạt Ovan Nâu đỏ Ovan ngắn Nâu đỏ Ovan dài Nâu đỏ Ovan Nâu đỏ Tròn Vàng Ovan Vàng Ovan Vàng Tròn Kem nhạt Ovan Vàng Ovan Tím Ovan Đỏ phần Ovan Vàng Ovan Vàng Ovan Vàng Ovan Vàng Màu thịt củ Độ sâu mắt ngủ Vàng nhạt Vàng TB Kem Kem Vàng TB Vàng nhạt Vàng TB Vàng nhạt Vàng TB Vàng nhạt Vàng nhạt Kem Kem Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng TB Vàng nhạt Vàng nhạt Kem Vàng nhạt Trắng kem Vàng TB Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng TB Rất nông Sâu Nơng Nơng Nơng Nơng Sâu Trung bình Trung bình Nơng Trung bình Nơng Trung bình Nơng Trung bình Nơng Trung bình Nơng Nơng Nơng Nơng Trung bình Rất sâu Trung bình Trung bình Trung bình Chú thích: slc/cây: số lượng củ/cây; kltbc/cây: khối lượng trung bình củ/cây Số liệu Bảng 3.23 cho thấy đặc điểm hình dạng, màu sắc vỏ củ, thịt củ hay độ sâu mắt ngủ dòng lai BC1 ngày hướng giống trồng xác nhận Kết thúc vụ lọc đánh giá dòng lai BC1, kết đánh giá qua hai Bảng 3.22, 3.23 bước đầu chọn lọc dòng triển vọng nhất: tổ hợp 1300 thu hai dòng 1300.3, 1300.6; tổ hợp 1301 thu dòng 1301.4, 1301.5, 1301.11; tổ hợp 1302 thu dòng: 1302.4, 1302.5, 1302.6; tổ hợp 1303 thu dòng: 1303.2, 1303.4, 1303.22; tổ hợp 1304 thu dòng 1304.1; tổ hợp 1305 thu dòng 1305.6 Đây nguồn vật liệu sử dụng đánh giá vụ sau 3.4.1.4 Đánh giá lai BC1 sau lọc 190 dòng nảy mầm từ 315 hạt lai lọc để chọn 26 dịng có khả sinh trưởng phát triển tốt, đặc điểm nông sinh học giống với khoai tây trồng virus lây nhiễm nhân tạo Từ 26 dòng tiếp tục đánh giá đặc điểm hình thái thu 13 dịng phát triển thành dòng/giống tiếp Củ 13 dòng trồng điều kiện chậu vại (giá thể sơ dừa) để tiếp tục chọn lọc dòng triển vọng Bảng 3.24 Các yếu tố cấu thành suất dòng/giống khoai tây khảo sát STT Dòng/giống Số TB/cây Chiều cao TB (cm) Số thân TB/khóm BC11300.3 19,36 86,10 5,8 21 10 11 12 13 14 15 16 17 BC1 1300.6 BC1 1301.4 BC1 1301.5 BC1 1301.11 BC1 1302.4 BC1 1302.5 BC1 1302.6 BC1 1303.2 BC1 1303.4 BC1 1303.22 BC1 1304.1 BC1 1305.6 Rasant Delikat Atlantic Solara 17,53 16,57 19,56 18,23 18,26 17,16 14,34 15,48 20,37 19,59 17,23 19,51 20,37 22,48 20,67 21,13 82,11 80,27 94,32 89,26 90,12 87,56 87,93 82,59 89,68 93,12 84,10 92,21 97,63 92,28 95,12 91,10 5,0 4,0 4,5 4,4 5,0 5,1 5,0 5,5 5,7 5,1 4,9 6,0 5,2 4,5 5,5 5,0 Số liệu Bảng 3.24 cho thấy phát triển đồng dòng khảo sát tương đồng so với hai giống khoai tây trồng làm đối chứng Bảng 3.25 Các yếu tố cấu thành suất dòng/giống khoai tây khảo sát STT 10 11 12 13 14 15 16 17 Dòng/giống BC1 1300.3 BC1 1300.6 BC1 1301.4 BC1 1301.5 BC1 1301.11 BC1 1302.4 BC1 1302.5 BC1 1302.6 BC1 1303.2 BC1 1303.4 BC1 1303.22 BC1 1304.1 BC1 1305.6 Rasant Delikat Atlantic Solara (ĐC) Phân Loại Củ (%) Số củ TB/ khóm (củ) Khối lượng TB/ khóm (gam) Φ >5cm 3cm-Φ-5cm Φ