Nghiên cứu ứng dụng đột biến thực nghiệm và chỉ thị phân tử để cải tiến giống lúa ST19 và q2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ LOAN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ CẢI TIẾN GIỐNG LÚA ST19 VÀ Q2 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒNG THỊ LOAN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ CẢI TIẾN GIỐNG LÚA ST19 VÀ Q2 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn Khoa học: GS.TS Trần Trung GS.TSKH Trần Duy Quý HÀ NỘI, 2020 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Trần Trung, GS.TSKH Trần Duy Quýngƣời hƣớng dẫn đề tài, ngƣời Thầy tận tình hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ, cung cấp tài liệu, kiến thức quý báu tạo điều kiện tốt để thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam cho phép, ủng hộ, tạo hội cho học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án nghiên cứu sinh Xin gửi lời cảm ơn đến ban giám hiệu Trƣờng đại học Sƣ phạm Kỹ thuật Hƣng Yên cho phép, ủng hộ, tạo hội cho học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án nghiên cứu sinh Xin chân thành cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện di truyền nông nghiệp, anh chị em môn Kỹ thuật di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp tạo điều kiện hỗ trợ trình nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp yêu thƣơng, thơng cảm, chia sẻ, an ủi, khích lệ tơi lúc khó khăn thực luận án, giúp tơi có thêm động lực để hồn thành chƣơng trình học thực luận án nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận án Hoàng Thị Loan ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình "NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ CẢI TIẾN GIỐNG LÚA ST19 VÀ Q2” đƣợc thực thân nghiên cứu sinh Hoàng Thị Loan với hƣớng dẫn GS.TS Trần Trung, GS.TSKH Trần Duy Quý Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chƣa cơng bố cơng trình Tác giả luận án Hoàng Thị Loan iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 2-AP 2-acetyl-1-pyrroline ASA Allele Specific Amplification CDS Coding sequence ADN Dezoxyribonucleic acid ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long DES Diethylsulfate DMS Dimethylsulfate EAP External Antisense Primer ESP External Sense Primer GC Gas chromatography GLC Gas liquid chromatography IFAP Internal Fragrant Antisense Primer INSP Internal Non-fragrant Sense Primer IRRI International Rice Research Institute MABC Marker-Assisted Backcross MAS Marker Assisted Selection NCBI National Center for Biotechnology Information NIL Near - isogenic lines NST Nhiễm Sắc Thể PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative Trait Loci RAPD RADNom Amplified Polymorphic ADNs RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms SNP Single Nucleotide Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats iv STS Sequence Tagged Sites TGST Thời gian sinh trƣởng TLC Thin layer chromatography USDA United States Department of Agriculture v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU xii Tính cấp thiết đề tài xii Mục tiêu luận án xiii Ý nghĩa khoa học, thực tiễn tính của luận án xiii CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân loại lúa 1.2 Tình hình sản xuất lúa chất lƣợng giới Việt Nam .3 1.3 Các yếu tố cấu thành suất, chất lƣợng lúa .4 1.4 Nghiên cứu đột biến thực nghiệm chọn tạo giống lúa chất lƣợng .5 1.4.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống phƣơng pháp đột biến thực nghiệm giới 1.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống phƣơng pháp đột biến thực nghiệm Việt Nam 1.4.3 Cơ sở khoa học phát sinh đột biến chọn giống trồng .12 1.4.4 Một số phƣơng pháp chọn tạo giống lúa chất lƣợng 17 1.4.4.1 Phƣơng pháp chọn tạo giống đột biến 17 1.4.4 Nghiên cứu lai tạo giống lúa chất lƣợng 19 1.4.4.3 Di truyền tiêu chí suất, chất lƣợng lúa .20 1.4.4.4 Chọn tạo giống lúa chất lƣợng phƣơng pháp chuyển gen 25 1.4.5 Sử dụng thị phân tử chọn giống lúa chất lƣợng 26 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu nghiên cứu 30 vi 2.2 Nội dung nghiên cứu 30 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu: 30 2.3.1 Xử lý đột biến 30 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 31 2.3.3 Phƣơng pháp chọn dòng đột biến 31 2.3.4 Phƣơng pháp đánh giá số tính trạng nơng học yếu tố cấu thành suất 33 2.3.5 Phƣơng pháp phân tích thành phần sinh hóa gạo 35 2.3.6 Nghiên cứu đa dạng di truyền thị ADN 40 2.3.6.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 40 2.3.6.2 Phƣơng pháp PCR 41 2.3.6.3 Phƣơng pháp điện di gel agarose 1% 42 2.3.6.4 Phƣơng pháp gel theo kit Qiagen 43 2.3.6.5 Giải trình tự 43 2.3.7 Phân tích xử lý số liệu 43 2.3.7.1 Phân tích số liệu kiểu hình 43 2.3.7.2 Phân tích số liệu kiểu gen 43 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Ảnh hƣởng tác nhân đột biến lên tỷ lệ sống sót qua giai đoạn hệ M1 45 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng tác nhân gây đột biến đến số đặc tính nơng sinh học lúa sau xử lý hệ M1, M2, M3 49 3.2.1 Ảnh hƣởng tác nhân đột biến đến chiều cao 49 3.2.2 Ảnh hƣởng tác nhân đột biến đến khả đẻ nhánh 54 3.2.3 Ảnh hƣởng tác nhân đột biến đến thời gian sinh trƣởng .57 3.2.4 Ảnh hƣởng tác nhân đột biến đến yếu tố cấu thành suất 60 3.3 Đánh giá số tiêu chất lƣợng hệ M2, M3 63 3.3.1 Đánh giá tiêu phẩm chất hệ M2 63 3.3.2 Đánh giá tiêu phẩm chất hệ M3 67 vii 3.4 Đánh giá số tiêu dịng đột biến hệ M4, M5, M6 3.5 Đa dạng di truyền dòng nghiên cứu giống gốc dựa vào đặc điểm hình thái 77 3.5.1 Đa dạng di truyền dựa vào đặc điểm hình thái giống ST19 dòng đột biến 77 3.5.2 Đa dạng di truyền dựa vào đặc điểm hình thái giống Q2 dịng đột biến 78 3.6 Ứng dụng thị phân tử chọn lọc dòng triển vọng 79 3.6.1 Kết tách chiết tinh ADN tổng số 79 3.6.2 Kết xác định hƣơng thơm số dòng lúa triển vọng 80 3.7 Đánh giá đa dạng di truyền mức độ phân tử dòng đột biến triển vọng 84 3.7.1 Hệ số PIC, số alen tổng số băng ADN thể cặp mồi 84 3.7.2 Tỷ lệ dị hợp tử (H%) tỷ lệ khuyết số liệu (M%) dòng lúa nghiên cứu 87 3.7.3 Kết phân tích đa hình mối quan hệ di truyền dòng lúa nghiên cứu 89 3.7.4 Kết giải trình tự số dịng đột biến triển vọng………… …….92 3.8 Kết khảo nghiệm dòng đột biến triển vọng 96 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 106 Kết luận .106 Kiến nghị .107 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO 109 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các bƣớc chọn dòng đột biến hạt trồng tự phấn 32 Bảng 2.2: Các tính trạng hình thái nơng học thang điểm theo IRRI, 1996 .34 Bảng 2.3 Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lƣợng amylose cho lúa (IRRI, 1988) 37 Bảng 2.4 Bảng phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979) 38 Bảng 2.5 Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm IRRI (1979) 38 Bảng 2.6 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá IRRI (1996) .39 Bảng 2.7 Thành phần chất dùng cho phản ứng PCR với mồi SSR 41 Bảng 2.8 Chƣơng trình chạy phản ứng PCR 42 Bảng 2.9 Danh sách mồi LOAN_qAC7_ amylose LOAN_Wx 42 Bảng 3.1: Tỷ lệ sống sót qua thời kì hệ M1 (Vụ xuân 2014) 45 Bảng 3.2 Tần số biến dị chiều cao dòng lúa hệ M1 50 Bảng 3.3 Tần số đột biến chiều cao dòng lúa hệ M2 52 Bảng 3.4 Tần số đột biến chiều cao dòng lúa hệ M3 53 Bảng 3.5 Tần số biến dị số nhánh dòng lúa hệ M1 55 Bảng 3.6 Tần số đột biến số nhánh dòng lúa hệ M2 56 Bảng 3.7 Tần số đột biến số nhánh dòng lúa hệ M3 56 Bảng 3.8 Tần số biến dị thời gian sinh trƣởng hệ M1 57 Bảng 3.9 Tần số biến dị thời gian sinh trƣởng hệ M2 58 Bảng 3.10 Tần số đột biến thời gian sinh trƣởng hệ M3 59 Bảng 3.11 : Thành phần suất số đột biến thu đƣợc hệ M2 .61 Bảng 3.12 : Thành phần suất số đột biến thu đƣợc hệ M3 .62 Bảng 3.13 Độ bền thể gel giống đối chứng đột biến thu đƣợc hệ M2 (Vụ mùa 2014) 64 Bảng 3.14: Hàm lƣợng amylose protein giống đối chứng đột biến thu đƣợc hệ M2 (Vụ mùa 2014) 66 Bảng 3.15: Độ bền thể gel giống đối chứng đột biến thu đƣợc hệ M3 (Vụ xuân 2015) 68 128 124 Zhou, Jianping, Xuhui Xin, Yao He, Hongqiao Chen, Qian Li, Xu Tang, Zhaohui Zhong, et al (2019), “Multiplex QTL Editing of Grain-Related Genes Improves Yield in Elite Rice Varieties”, Plant Cell Reports 38 (4), pp 475–85 https://doi.org/10.1007/s00299-018-2340-3 129 Zhu, Zhengzheng, Xiaoqiong Li, Yu Wei, Sibin Guo, and Aihua Sha (2018), “Identification of a Novel QTL for Panicle Length From Wild Rice (Oryza Minuta) by Specific Locus Amplified Fragment Sequencing and High Density Genetic Mapping”, Frontiers in Plant Science 9, pp.1492 https://doi.org/10.3389/fpls.2018.01492 130 Zhu X.D., H.Q Chen and D Luo (2003), “Screening ADN Characterization of mutants induced from Zhnghua 11 (Oryza sativa L.subsp Japonica) by Irradiation”, Chinese Journal of rice Sicience, 17(3), pp 205210 (in chinese winh English Abstracst) PHỤ LỤC Bảng 1: Danh sách mồi đƣợc sử dụng để nghiên cứu gen quy định mùi thơm lúa Marker BadhapUP12 BadhapUP11 BADHAPup10 55BadhapUP9/ Aro 19 BadhapUP8 BadhapUP7 BadhapUP6 BadhapUP5 BadhapUP4 BadhapUP3 55BadhapUP2 Aro9 BadhapUP1/ MITE BadhapG1 BadhapG2 BadhapG3 BadhapG4 BadhapG5 BadhapG6 BadhapG7 BadhapG8 BadhapG9 BadhapDOWN1 BadhapDOWN2 BadhapDOWN3 BadhapDOWN4 BadhapDOWN5 BadhapDOWN6 BadhapDOWN7 BadhapDOWN8 BadhapDOWN9 BadhapDOWN10 BadhapDOWN11 BadhapDOWN12 Bảng 2: Trình tự mồi STS CAPS đƣợc sử dụng để khuếch đại gen WS SBE Gen marker wx STS sbe1 STS sbe1 CAPS sbe3 CAPS Bảng 3: Danh sách mồi SSR đƣợc sử dụn Marker TT mp1-2 xa5add3 waxy bad2 RM 122 RM 225 RM 234 RM 246 qac7 10 RM 302 11 RM 247 12 RM 224 13 wx 14 srwd5 15 p3 16 pta248 17 RM 18 RM 431 19 RM 341 20 RM 160 21 RM 296 22 drep1a 23 pikp 24 RM 323 25 RM 337 26 RM 452 27 pi ta 28 RM 13 29 salt 30 RM 310 CÁC HÌNH ẢNH CHẠY MỒI SSR Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR dòng lúa nghiên cứu với cặp mồi RM1 ( 7: giống ST19 -ĐC;8, 9, … 36 dịng đột biến) Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR dòng lúa nghiên cứu với cặp mồi RM234 ( 7: giống ST19 -ĐC;8, 9, … 36 dịng đột biến) Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR dòng lúa nghiên cứu với cặp mồi RM225 ( 7: giống ST19 -ĐC;8, 9, … 36 dịng đột biến) Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR dòng lúa nghiên cứu với cặp mồi RM302 ( 7: giống ST19 -ĐC;8, 9, … 36 dịng đột biến) Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR dòng lúa nghiên cứu với cặp mồi RM160 ( 7: giống ST19 -ĐC;8, 9, … 36 dòng đột biến) Hệ số tƣơng đồng di truyền dòng đột biến từ giống ST19 CÁC HÌNH ẢNH ĐỘT BIẾN LÚA Đột biến thời gian sinh trƣởng chiều cao Đột biến từ 1-2 nhánh nhiều nhánh Đột biến có râu khơng râu Hình ảnh dịng lúa HY198 Đột biến màu sắc hạt lúa: ST19 dòng 17.1 ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ LOAN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ CẢI TIẾN GIỐNG LÚA ST19 VÀ Q2 Chuyên... phƣơng pháp chọn tạo giống lúa chất lƣợng Vì lý trên, chúng tơi lựa chọn đề tài "Nghiên cứu ứng dụng đột biến thực nghiệm thị phân tử để cải tiến giống lúa ST19 Q2? ??, nhằm tạo dịng lúa có suất cao,... học thực luận án nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận án Hồng Thị Loan ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình "NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ CẢI TIẾN