Nghiên cứu sử dụng phức phát quang Eu(III)-OTC để xác định ATP

Bài viết nghiên cứu ứng dụng phức chất phát quang của Eu(III) với oxytetracycline (OTC), một phối tử loại β diketonate (Hình 1), để xác định anion ATP (adenosine disodium triphosphate).

Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học - Tập 25, Số 1/2020 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHỨC PHÁT QUANG Eu(III)-OTC ĐỂ XÁC ĐỊNH ATP Đến tòa soạn 10-11-2019 Trần Thượng Quảng, Vũ Thị Hậu, Trần Thu Quỳnh, Vũ Anh Tuấn, Lương Xuân Điển, Nguyễn Xuân Trường Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội SUMMARY STUDY ON APPLICATION OF LUMINESCENT COMPLEX Eu(III)-OTC FOR IDENTIFICATION OF ATP In this paper, we have investigated the application of luminescent complex Eu(III)-OTC for identification of ATP (adenosine disodium triphosphate) in water The Eu(III)-OTC complex is prepared by the mixing of Eu3+ ion and OTC ligand (oxytetracycline) with a 1:1 molar ratio The luminescent intensity of the complex is at em = 616 nm, which is used for quantification of ATP The luminescent intensity dereases with ATP concentration according to the Stern-Volmer equation with the linearity over range of 5,010-7  2,510-6M (coefficient correlation R2 = 0.9925) and LOD of 9,6108 M The Eu(III)-OTC complex is potential for ATP determination Keywords Luminescent complex, Eu(III), oxytetracycline, adenosine disodium triphosphate sẵn có, bảo quản thuốc thử dễ dàng Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu xác định ATP phương pháp phát quang hóa học sử dụng phức chất phát quang nguyên tố đất Eu/Tb hay kim loại chuyển tiếp Cu/Zn [3-14] Phức chất phát quang Eu, Tb, Cu, Zn,… với phối tử hữu (imidazole, β-diketonate, pyridine,…) có đặc tính quang lý trội như: độ dịch chuyển Stokes lớn, thời gian phát quang tương đối “dài” (cỡ s) có dải phát xạ hẹp Độ dịch chuyển Stokes lớn nên phát quang không bị hấp thụ khung phối tử hữu (hiện tượng nội hấp thụ) giảm nhiễu Thời gian phát quang “dài” nên loại bỏ hồn tồn tín hiệu nhiễu gây tượng phát quang ngắn Hơn nữa, dải phát quang hẹp nên làm tăng độ nhạy phép đo Do đó, phức chất phát quang cho đáp ứng tín hiệu/nền lớn nhạy với đối tượng phân tích MỞ ĐẦU Adenosine-disodium-triphosphate (ATP) có mặt tế bào sống có chức dự trữ lượng Việc xác định ATP cho biết thông tin số lượng vi sinh vật mẫu kiểm tra Phương pháp ATP quang sinh học áp dụng để kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm cho sở sản xuất chế biến thực phẩm; phương pháp mới, tiên tiến Nguyên tắc phương pháp ATP quang sinh học, ATP tế bào giải phóng nhờ tác nhân cation, tác dụng enzym luciferin có mặt Mg2+ tạo phản ứng phát quang Cường độ phát quang tỷ lệ thuận với lượng ATP có mẫu [1,2] Ngồi phương pháp quang sinh học, có nhiều cơng trình nghiên cứu xác định ATP phương pháp phát quang hóa học Phương pháp có độ chọn lọc cao, độ nhạy tốt có ưu điểm sử dụng hóa chất 20 OTC ATP Adenine Adenosine Hình 1: Cơng thức cấu tạo phân tử OTC, ATP, adenine adenosine Trong báo này, nghiên cứu ứng dụng phức chất phát quang Eu(III) với oxytetracycline (OTC), phối tử loại βdiketonate (Hình 1), để xác định anion ATP (adenosine disodium triphosphate) THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất thiết bị 2.1.1 Hóa chất Eu2O3 (99,8%), adenosine disodium triphosphate (ATP, 99,8%), adenosine (99,8%) adenine (99,8%) mua từ Sigma Aldrich Các hóa chất dung môi khác gồm đệm TrisHCl 0,01M pH = 7,5, NaNO3, Na2CO3, Na2SO4, Na3PO4, NaH2PO4, Na2HPO4 (Trung Quốc); nước cất lần sử dụng để pha chế dung dịch thí nghiệm 2.1.2 Thiết bị Phổ hấp thụ phân tử chất nghiên cứu ghi máy quang phổ UV-Vis 8453 Agilent Phổ huỳnh quang phức chất ghi máy đo Brolight 6102 (ex = 405 nm) Tất thí nghiệm thực điều kiện nhiệt độ phòng Một số thiết bị khác phịng thí nghiệm máy quay chân không, máy khuấy từ máy đo pH Hanna 2215 2.2 Tổng hợp phức phát quang Eu(III)OTC Phức chất phát quang Eu(III)-OTC tổng hợp dựa theo tài liệu tham khảo [3,7], gồm bước sau: Muối EuCl3 tạo thành cách cho Eu2O3 tác dụng với lượng HCl 0,1M tối thiểu đủ để hịa tan hết, sau cạn dung dịch Tiếp theo, thêm lượng ethanol gấp hai lần lượng axit HCl dùng Khuấy phút, cho tiếp 1-2 giọt NaOH 2N Rồi tiếp tục thêm OTC vào hỗn hợp trên, khuấy trộn 30 phút Tỷ lệ số mol phức Eu3+ OTC lấy theo tỷ lệ 1:1 Quá trình tổng hợp phức phát quang thực 600C 2.3 Quan hệ cường độ phát quang phức Eu(III)-OTC nồng độ ATP – Phương trình Stern-Volmer Trong dung dịch với nồng độ ATP tăng dần, cường độ phát quang phức Eu(III)-OTC giảm dần Sự phụ thuộc cường độ phát quang phức Eu(III)-OTC vào nồng độ ATP biểu diễn theo phương trình SternVolmer [15]: I0   K SV  ATP  I (1) Trong đó: I0 I tương ứng cường độ phát quang phức Eu(III)-OTC dung dịch nghiên cứu khơng có có ATP; [ATP]: nồng độ ATP dung dịch; KSV: số Stern-Volmer Phương trình Stern-Volmer, phương trình tuyến tính bậc biểu diễn mối quan hệ đại lượng I0 [ATP], sở để xác định I ATP theo phương pháp quang phổ phát quang 2.4 Xác định giới phát ATP sử dụng phức Eu(III)-OTC Giới hạn phát (LOD) ATP phương pháp quang phổ phát quang sử dụng phức Eu(III)-OTC tính tốn theo phương trình [16]: 21 LOD  3,3  SD a (2) 4x104 Trong đó, SD độ lệch chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn a độ dốc đường chuẩn (phương trình Stern-Volmer) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phổ hấp thụ phân tử phổ phát quang phức Eu(III)-OTC (1) Intensity 3x104 500 600 700 800 wavelength / nm Hình 3: Phổ phát quang phức Eu(III)-OTC 6,20 mg/L (1) đệm Tris-HCl pH = 7,5 (2) nước 3.2 Nghiên cứu ứng dụng phức phát quang Eu(III)-OTC để xác định ATP 3.2.1 Thời gian phản ứng Kết khảo sát thời gian phản ứng (Hình 4) cho thấy, thêm ATP cường độ phát quang (I) phức Eu(III)-OTC mạnh sau 25 phút ổn định mẫu Do đó, nghiên cứu mẫu để ổn định vòng 25 phút trước đo 0.4 Absorbance (2) 1x10 Phổ hấp thụ UV-Vis phức Eu(III)-OTC Hình Phức Eu(III)-OTC hấp thụ bước sóng  ~200  500 nm, với cực đại hấp thụ max  385 nm, ứng với bước chuyển dời điện tử -* OTC Nhận thấy, môi trường đệm Tris-HCl pH = 7,5 nước phổ hấp thụ phân tử UV-Vis phức gần tương đương Tuy nhiên, độ hấp thụ phức Eu(III)-OTC đệm Tris-HCl có lớn nước (1) 0.3 2x104 (2) 0.2 0.1 4.5x104 0.0 300 400 500 600 wavelength / nm Intensity 4.0x104 Hình 2: Phổ hấp thụ UV-Vis phức Eu(III)OTC 6,20 mg/L (1) đệm Tris-HCl pH = 7,5 (2) nước 3.5x104 3.0x104 2.5x104 Hình phổ phát quang phức Eu(III)OTC môi trường đệm Tris-HCl pH = 7,5 nước Phổ phát quang phức Eu(III)-OTC cho thấy có chuyển electron từ OTC sang ion Eu(III) tạo nên bước sóng phát xạ đặc trưng ion Eu(III): em = 590; 616 695 nm Cường độ phát xạ phức môi trường đệm mạnh nước ~4,5 lần nên dung dịch đệm Tris-HCl dùng cho nghiên cứu 2.0x104 10 20 30 40 time / Hình 4: Ảnh hưởng thời gian đến cường độ phát quang phức Eu(III)-OTC ([ATP] = 5,010-7 M) 3.2.2 Ảnh hưởng pH Cường độ phát quang phức Eu(III)-OTC thêm ATP với pH = - Hình Kết khảo sát cho thấy, môi 22 Bảng 1: Ảnh hưởng số anion phân tử khác đến cường độ phát quang phức Eu(III)-OTC trường kiềm pH >8 cường độ phát quang phức giảm dần, điều giải thích tạo thành phức cạnh tranh – phức hidroxo ion Eu3+ Trong môi trường kiềm yếu đến axit yếu (8>pH>6), cường độ phát quang phức giảm dần, giá trị pH = 7,5 phức Eu(III)-OTC cho cường độ phát xạ huỳnh quang mạnh Do đó, mơi trường đệm TrisHCl pH = 7,5 lựa chọn cho nghiên cứu phép phân tích có độ nhạy cao Anion Nồng độ (mol L-1) I/I0 (%) NO3- 1,0×10-4 + 2,60 SO42- 1,0×10-4 + 1,69 CO32- 1,0×10-4 + 2,23 PO43- 5,0×10-6 + 0,92 HPO42- 2,5×10-5 + 0,17 H2PO4- 5,0×10-6  8,94 Intensity 2.5x10 2.0x104 -4 Adenine 1,0×10 Adenosine 1,0×10-4 1,67  2,96 1.5x10 3.2.4 Giới hạn phát ATP Phổ phát quang phức Eu(III)-OTC tăng dần nồng độ ATP biểu diễn Hình 6a; tương quan cường độ phát quang (I) nồng độ ATP tương ứng theo phương trình Stern-Volmer biểu diễn Hình 6b Kết cho thấy, I giảm nồng độ ATP tăng; khoảng tuyến tính xác định ATP lựa chọn từ 5,010-7  2,510-6M với hệ số tương quan R2 = 0,9925 Kết phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ATP 5,010-7M cho giá trị độ lệch chuẩn SD = 0,07914 (n = 6) Từ tính tốn giá trị LOD = 9,610-8M 1.0x104 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 pH Hình 5: Ảnh hưởng pH đến cường độ phát quang phức Eu(III)-OTC ([ATP] = 7,510-7 M) 3.2.3 Độ chọn lọc Ion Eu3+ có khả tương tác tạo liên kết với số anion dung dịch, đồng thời phân tử có phần cấu trúc giống ATP (adenosine adenine – Hình 1) có tương tác làm thay đổi cường độ phát quang phức Eu(III)-OTC Do vậy, độ chọn lọc phức Eu(III)-OTC khảo sát với số anion phân tử sau: NO3-, CO32-, SO42-, PO43-, HPO42-, H2PO4-, adenosine adenin Kết khảo sát (Bảng 1) cho thấy, có mặt anion NO3-, CO32-, SO42- phân tử adenosine, adenine dung dịch với nồng độ 510-6M), HPO42- (>2,5105 M), H2PO4- (>510-6M) gây ảnh hưởng đến tín hiệu phát quang phức Do đó, khơng sử dụng phức Eu(III)-OTC để xác định ATP dung dịch có chứa phosphate anion Intensity 3x104 ATP 2x104 1x104 550 600 650 700 wavelength / nm Hình 6a: Phổ phát quang phức Eu(III)OTC dung dịch tăng dần nồng độ ATP 23 luminescent probes, Coord Chem Rev., 2014, 273–274, 201-212 [4] Xiao Liu, Jun Xu, Yinyun Lv, Wenyu Wu, Weisheng Liu and Yu Tang, An ATPselective, lanthanide complex luminescent probe, Dalton Trans., 2013, 42, 9840-9846 [5] Sneha Wankar, Aarti Saxena, Umar J Pandit, Imran Khan, Ratnesh Das & Sudhir N Limaye, Synthesis and characterization of luminescent indole based Europium complex for selective sensing of ATP, J Biomol Struct Dyn., 2017, 35, 2049-2054 [6] YingWu, Jia Wen, Hongjuan Li, Shiguo Sun, Yongqian, Xu, Fluorescent probes for recognition of ATP, Chinese Chemical Letters, 28, 2017, 1916-1924 [7] Hou, F.; Miao, Y.; Jiang, C Determination of Adenosine Disodium Triphosphate (ATP) Using Oxytetracycline-Eu3+ as a Fluorescence Probe by Spectrofluorimetry Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 2005, 61 (13–14), 2891–2895 [8] Hou, F.; Wang, X.; Jiang, C Determination of ATP as a Fluorescence Probe with Europium(III)-Doxycycline Anal Sci Int J Jpn Soc Anal Chem 2005, 21 (3), 231–234 [9] Z.Y Wu, J.N Cui, X.H Qian, T.Y Liu, Chin Chem Lett 24 (2013) 359-361 [10] W Feng, Q.L Qiao, S Leng, et al., Chin Chem Lett 27 (2016) 1554-1558 [11] A.J Moro, P.J Cywinski, S Korsten, G.J Mohr, Chem Commun 46 (2010) 1085-1087 [12] V Amendola, G Bergamaschi, A Buttafava, L Fabbrizzi, E Monzani, J Am Chem Soc 132 (2010) 147-156 [13] A Ojida, S Park, Y Mito-oka, I Hamachi, Tetrahedron Lett 43 (2002) 6193-6195 [14] E Kataev, R Arnold, T Ruffer, H Lang, Inorg Chem 51 (2012) 7948-7950 [15] Joseph R Lakowicz, Principle of Fluorescence Spectroscopy, Springer, 3rd Edition, (2006) [16] Trần Cao Sơn, Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 2010 I0/I - Equation Residual Sum of Squares Adj R-Square y = a + b*x No Weighting 0.14035 B 5.0x10-7 1.0x10-6 1.5x10-6 0.99245 Intercept Slope Value Standard Erro -1.10862 0.1461 2.72628E6 97017.85678 2.0x10-6 2.5x10-6 ATP conc / M Hình 6b: Đường chuẩn xác định ATP sử dụng phức phát quang Eu(III)-OTC Như vậy, phương pháp quang phổ phát quang, phức Eu(III)-OTC sử dụng để xác định nồng độ ATP nước KẾT LUẬN Phức phát quang Eu(III)-OTC sử dụng để xác định ATP điều kiện tối ưu sau: đệm Tris-HCl pH = 7,5; thời gian ổn định mẫu 25 phút dung dịch phân tích khơng chứa phosphate anion với nồng độ >5,010-6M Cường độ phát quang phức ghi bước sóng em = 616 nm, khoảng tuyến tính xác định ATP 5,010-7  2,510-6M giới hạn phát 110-6 M Lời cảm ơn Nghiên cứu hoàn thành với tài trợ đề tài B2019-BKA-06, Bộ Giáo dục Đào tạo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trần Thị Hảo, Đánh giá tương thích phương pháp kiểm tra vi sinh vật truyền thống phương pháp đo ATP quang sinh học trình kiểm tra vệ sinh dây chuyền sản xuất bia Viện công nghiệp thực phẩm, Luận văn Thạc sỹ Khoa học, 2011, Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội [2] Võ Minh Trí, Trần Linh Thước, Khảo sát điều kiện phản ứng phát sáng sinh học cần ATP để định lượng nhanh vi sinh vật, Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ ĐH Quốc Gia TP HCM, 2002, 5, 13-19 [3] Xiaohui Wang, Hongjin Chang, Juan Xie, Baozhou Zhao, Botong Liu, Shuilin Xu, Wenbo Pei, Na Ren, Ling Huang, Wei Huang, Recent developments in lanthanide-based 24 ... I0 [ATP] , sở để xác định I ATP theo phương pháp quang phổ phát quang 2.4 Xác định giới phát ATP sử dụng phức Eu(III)-OTC Giới hạn phát (LOD) ATP phương pháp quang phổ phát quang sử dụng phức Eu(III)-OTC. .. 2.5x10-6 ATP conc / M Hình 6b: Đường chuẩn xác định ATP sử dụng phức phát quang Eu(III)-OTC Như vậy, phương pháp quang phổ phát quang, phức Eu(III)-OTC sử dụng để xác định nồng độ ATP nước KẾT LUẬN Phức. .. phức phát quang Eu(III)-OTC để xác định ATP 3.2.1 Thời gian phản ứng Kết khảo sát thời gian phản ứng (Hình 4) cho thấy, thêm ATP cường độ phát quang (I) phức Eu(III)-OTC mạnh sau 25 phút ổn định