Chuong1

Các vector nhị thể này khác nhau về kích thước, sự tái bản ổn định trong Agrobacterium, các vị trí tạo dòng, sự bổ trợ α để có thể sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên các đĩa X-GAL, các g[r]

Chương 1

Các vector sử dụng công nghệ

chuyển gen động vật thực vật

I Vector

Trong sinh học, vector phân tử DNA có khả mang đoạn DNA ngoại lai xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp có khả tự tái không phụ thuộc vào chép hệ gen tế bào chủ

Nói cách khác, vector phương tiện truyền thông tin di truyền thể thể khác

Tế bào chủ thường sử dụng vi khuẩn E.coli Phần lớn vector phân tử DNA dạng vòng nhỏ (plasmid) bacteriophage

Vector cắt vị trí xác định enzym hạn chế nối với đoạn DNA tương hợp khác cắt enzym

Trong tạo dòng phân tử, vector cần thiết thực tế cho thấy đoạn DNA chứa gen khơng thể làm tế bào chủ Vì khơng phải phận genome bình thường tế bào, không tái tế bào phân chia, không biểu có khả bị phân huỷ nhanh

Trong kỹ thuật di truyền, vector cơng cụ có khả nghiên cứu genome người genome loài khác sử dụng chúng nghiên cứu trở nên ngày phổ biến cách rộng rãi

II Các đặc tính vector

- Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai không lớn

- Vector phải mang nhiều vị trí nhận biết enzym hạn chế

- Vector phải mang gen marker chọn lọc (thường gen kháng chất kháng sinh) Vì tế bào chứa chúng phát cách dễ dàng

III Các bước tạo dòng phân tử

- Nối vector đoạn DNA ngoại lai cần tạo dòng ống nghiệm để tạo DNA tái tổ hợp nhờ xúc tác enzym ligase

- Biến nạp DNA tái tổ hợp vào dòng tế bào chủ Chọn lọc thể biến nạp môi trường agar đĩa petri có chất kháng sinh

- Tách dịng DNA tái tổ hợp cách sử dụng mẫu dò (probe)

IV Các vector sử dụng để chuyển gen động vật thực

vật

1 Các vector sử dụng để chuyển gen động vật

1.1 Vector sử dụng để thêm gen

Phần lớn vector sử dụng để tạo động vật chuyển gen cách thêm gen xây dựng để hợp vào genome Các phương pháp sử dụng nghiên cứu để tăng tần số hợp gen ngoại lai trì chúng nhiễm sắc thể nhỏ độc lập

1.1.1 Vector thẳng tối thiểu (Minimum linear vectors)

DNA genome dài nhạy với hiệu câm trình tự prokaryote Ðiều thích hợp nhờ diện yếu tố cách ly đoạn genome dài nhờ hiệu khoảng cách đơn giản

Các đoạn DNA khơng chứa trình tự đặc biệt hợp vào genome với tần số tương đối thấp Một số DNA xen vào tạo số động vật chuyển gen nhiều so với DNA khác Ðiều xuất từ có mặt trình tự đoạn xen mà nhận biết thường xuyên trình tự genome (Hình 1) Một số đoạn xen vào chứa trình tự ưu tiên cho phiên mã chúng trì chúng phôi, tăng cường hợp xảy 1.1.2 Vector chứa trình tự lặp lại

Cơ chế hợp mô tả hình bao hàm nhận biết trình tự đoạn xen genome Tần số hợp tăng lên nhờ có mặt hai đầu đoạn xen trình tự lặp lại cao genome chủ chúng bị thối hóa nhiều Ở bị, trình tự có mặt nhiều tâm động làm tăng thêm đoạn xen tăng tần số hợp Ở trường hợp đặc biệt này, gen chuyển không hoạt động Ðiều tâm động vùng không phiên mã genome phá hủy gen chuyển

Một phương pháp tương tự tiến hành chuột, sử dụng trình tự Alu Các trình tự yếu tố lặp lại Các trình tự Alu chứa 200-300 nucleotid có nhiều genome động vật có vú đặc biệt vùng lân cận vùng phiên mã Một số trình tự Alu phiên mã RNA polymerase III, làm cho chức RNA khơng rõ ràng khơng tồn Các thí nghiệm cho thấy tần số hợp tăng lên đoạn xen chứa trình tự Alu

1.1.3 Vector transposon

Hình 1.2: Cấu trúc transposon

Kích thước transposon nói chung khơng dài 2kb Nhiều transposon có mặt genome vị trí ngẫu nhiên cách rõ ràng Transposon phiên mã thành RNA, RNA phiên mã ngược thành DNA sợi kép DNA sợi kép hợp vào genome với hiệu cao Sự hợp điều khiển gen transposase mã hóa transposon trình tự lặp lại đảo ngược ITR (inverted repeated sequence) Các trình tự lặp lại đảo ngược có mặt hai đầu transposon (Hình 1.3) Cơ chế cho phép transposon trải rộng cách nhanh chóng tỏa khắp genome, bao gồm bất hoạt gen số trường hợp Sự lan tỏa transposon bị giới hạn chế tế bào làm bất hoạt phiên mã transposon

Transposon vector có tiềm hợp gen ngoại lai vào genome Ðể làm điều này, phần lớn vùng phiên mã transposon bị đi, tạo khoảng trống gen ngoại lai ngăn cản transposon trải rộng cách tự chủ khơng kiểm sốt genome

DNA tái tổ hợp chứa gen ngoại lai khơng có khả đặc biệt để tự hợp vào genome Sự có mặt gen transposase cần thiết mục đích Tiêm đồng thời transposon mang gen ngoại lai plasmid vịng có khả biểu gen transposase cho phép transposon hợp với hiệu có ý nghĩa, khoảng 1-5 % số phơi tiêm (Hình 1.3)

Các vector khác sử dụng để tạo côn trùng chuyển gen như Aedes aegypti tằm (Tamura, 1999) Gần transposon sử dụng để tạo chuột chuyển gen (Dupuy, 2002)

Hình 1.3: Sử dụng vector transposon để chuyển DNA ngoại lai

Gen transposase thay gen mong muốn Transposon tái tổ hợp tiêm vào tế bào Vector điều khiển tổng hợp enzyme gắn (intergrase) tiêm vào Transposon hợp cách sử dụng trình tự lặp lại đảo ngược ITR chúng

Vì vậy, vector transposon cho phép tạo động vật chuyển gen loài mà vi tiêm DNA thông thường không thành công Vector xem an toàn Vector transposon thủy thủ thiếu gen transsposae tái hợp vào genome chủ với tần số thấp Ðiều có mặt transposase nội sinh tế bào chủ Vấn đề giới hạn sử dụng transposon số trường hợp Trong đó, transposon BAC lợn sử dụng để tạo tằm chuyển gen ổn định hoàn toàn sau số hệ

Transposon mang đoạn DNA ngoại lai với chiều dài giới hạn Các cấu trúc phức tạp sử dụng để biểu gen ngoại lai rõ ràng hạn chế Ngoài chế tế bào phá hủy transposon ức chế biểu gen chuyển số trường hợp

1.1.4 Vector retrovirus

a Cấu trúc retrovirus

Retrovirus loại virus RNA, có vỏ bọc bên ngồi Sau xâm nhiễm, genome virus chép ngược thành DNA sợi kép, hợp vào genome tế bào chủ biểu thành protein

Retrovirus đặc trưng chu kỳ tái chúng, mô tả lần vào đầu thập niên 1900 (Ellermann Bang.O, 1908)

Hạt retrovirus có kích thước, hình dạng thay đổi đơi chút đường kính khoảng 100nm Vỏ virus glycoprotein, tạo thành gai màng (Hình 1.4A) Protein trưởng thành chia làm hai loại polypeptid (Hình 1.4B):

- Glycoprotein vỏ bên ngồi (SU), kháng nguyên chủ yếu virus, có chức bám vào thụ quan

A B

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc cắt ngang retrovirus

A Cấu trúc cắt ngang B Cấu trúc protein vỏ

Bên màng protein (MA), khơng định hình Protein bao lấy capsid (CA) CA protein phong phú hạt virus (chiếm khoảng 33 % trọng lượng tổng số), có hình khối 20 mặt Bên capsid lõi, thường có hình nón, bao gồm: RNA genome, protein nucleocapsid (NC), enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase = RT) enzyme hợp (intergrase = IN)

Genome retrovirus bao gồm hai phân tử RNA sợi đơn, mạch thẳng, có cap đầu 5’ poly A đầu 3’ (tương đương với mRNA) Genome retrovirus có kích thước khoảng 8-11kb

Retrovirus chia làm hai loại retrovirus đơn giản retrovirus phức tạp

RNA retrovirus đơn giản chứa nhóm gen chủ yếu: - Gen gas mã hóa protein lõi, capsid nucleoprotein.

- Gen pol mã hóa enzyme phiên mã ngược enzyme hợp

- Gen env mã hóa protein cấu trúc vỏ virus

Trật tự nhóm gen tất retrovirus không thay đổi:

Ngồi cịn có nhóm gen pro mã hóa enzyme protease viruss Các retrovirus đơn giản bao gồm hầu hết virus gây ung thư viruss bạch cầu chuột Moloney Mo-MLV (Moloney, 1960), virus ung thư tuyến vú chuột (mouse mammary tumor virus = MMTV) (Bittner, 1936 )

Các retrovirus phức tạp, ngồi ba nhóm gen chủ yếu gag, pol và env cịn có gen khác tat, rev HIV-1 Nhóm virus bao gồm lentivirus kể virus HIV-1, spumavirus, HFV (human foamy virus) SFV (simian foamy virus)

Ở đầu genome đoạn lặp dài tận (LTR) chứa tất tín hiệu cần thiết cho biểu gen virus Một đoạn LTR gồm có vùng: U3, R U5 Vùng U3 bao gồm yếu tố kiểm soát phiên mã, promoter gen tăng cường (enhancer) Ðây vùng không mã hóa có kích thước 75-250 nucleotid, phần genome phiên mã ngược, tạo đầu 3’ genome provirus Vùng R thường trình tự có kích thước ngắn khoảng 18-250 nucleotid tạo thành đoạn lặp trực tiếp hai đầu genome Vùng U5 vùng khơng mã hóa có kích thước 200-1.200 nucleotid tạo nên đầu 5’ provirus sau phiên mã ngược vùng U5 mang vị trí poly A với vùng R xác định gắn thêm đuôi poly A vào Cả hai vùng U3 U5 mang vị trí gắn att cần thiết cho hợp genome virus vào genome chủ

Mặt khác, genome virus cịn có đoạn dẫn đầu (leader), vị trí bám primer (primer binding site = PBS) vùng polypurine (polypurine tract = PPT) Ðoạn dẫn đầu không dịch mã, dài, có kích thước khoảng 90-500 nucleotid, xi theo vị trí khởi đầu phiên mã, nằm vùng U3 R, phía đầu 5’ tất virus mRNA PBT dài 18 nucleotid bổ sung với đầu 3’ primer tRNA đặc hiệu virus sử dụng để bắt đầu phiên mã ngược PTT ngắn khoảng 10 A G có chức khởi đầu tổng hợp sợi (+) trình phiên mã ngược

Ngồi cịn có trình tự cần thiết cho đóng gói genome virus gọi trình tự Ψ (psi) vị trí cắt RNA gen env

Một số retrovirus chứa protooncogene Khi protooncogene bị đột biến gây ung thư

b Vector retrovirus

Vector retrovirus cấu trúc DNA nhân tạo có nguồn gốc từ retrovirus, sử dụng để xen DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể vật chủ

Yếu tố chìa khóa việc sử dụng retrovirus làm thể truyền phân phối gen an toàn sinh học (biosafety) Mục đích thiết kế vector bảo đảm tạo virus không khả tái (replication incompetent virus) tế bào chủ (Hình 1.6 )

Hình 1.6: Virus ngun vẹn có khả tái và vector retrovirus khơng có khả tái bản

vector) Mặt khác, kích thước đoạn DNA ngoại lai mà vector tái khơng hồn tồn tiếp nhận lớn nhiều so với vector có khả tái Sự biểu protein retrovirus hầu hết retrovirus gây ung thư xảy tự nhiên promoter đơn (single promoter) nằm đoạn lặp dài tận (LTR) đầu 5’và biểu vùng mã hóa virus phức tạp xảy nhờ cắt ghép xen kẻ (alternative splicing) Tuy nhiên, việc thiết kế vector không bị giới hạn sử dụng promoter retrovirus đơn Một hướng thiết kế khác sử dụng promoter phức (multiple promoter) trình tự tiếp nhận ribosome bên (internal ribosome entry site = IRES)

Sự tải nạp hợp gen có hiệu phụ thuộc vào yếu tố virus có mặt vector retrovirus

Một điểm lưu ý quan trọng thiết kế vector retrovirus hiệu tái virus cấu trúc vector

Phần lớn vector retrovirus thường thiết kế dựa virus Mo-MLV Ðây loại virus có khả xâm nhiễm vào tế bào chuột (có thể phát triển vector mơ hình chuột) tế bào người (có thể điều trị bệnh cho người) Các gen virus (gag, pol và env) thay gen chuyển mong muốn biểu plasmid dịng tế bào đóng gói Các vùng cần thiết bao gồm đoạn lặp dài tận đầu 3’ 5’ (3’LTR 5’LTR) trình tự đóng gói

Trước virus hỗ trợ khả tái sử dụng để đóng gói virus vector virus hỗ trợ Trong phương pháp tinh vi sử dụng nay, dòng tế bào thao tác di truyền đặc hiệu biểu gem virus promoter không tương đồng sử dụng để tạo virus vector Các dòng tế bào gọi dịng tế bào đóng gói dòng tế bào hỗ trợ

Chuyển gen biểu gen vector virus gọi tải nạp để phân biệt với trình xâm nhiễm retrovirus có khả tái (replication competent retrovirus = RCR)

của gen chuyển thay đổi nhỏ 5’LTR ảnh hưởng đến biểu gen chuyển (Rivire,1995)

Hình 1.7: Quá trình đóng gói tạo hạt retrovirus

Ðể nhận biết tế bào biến nạp, marker chọn lọc neomycin beta galactosidase sử dụng biểu gen chuyển cải tiến cách thêm vào trình tự ribosome bên (Saleh, 1997)

Một yêu cầu hợp biểu gen virus tế bào đích phải phân chia Ðiều giới hạn liệu pháp gen tăng sinh tế bào in vivo ex vivo, tế bào thu nhận từ thể xử lý để kích thích tái sau tải nạp với retrovirus trước đưa trở lại bệnh nhân

c Ứng dụng vector retrovirus

Vector retrovirus cần thiết cho liệu pháp gen, sử dụng có hiệu nhiều liệu pháp gen chữa bệnh cho người suy giảm miễn dịch thiếu hụt enzyme ADA, ung thư, tiểu đường, thiếu máu,

Các vector retrovirus khác thiết kế để tạo động vật chuyển gen gà chuyển gen đặc biệt (Ronfort, Legras Verdier, 1997) Các vector mang trình tự env có khả nhận biết tế bào phôi gà Chúng tiêm vào trứng gà đẻ Ở giai đoạn này, tế bào cịn đa tham gia vào việc tạo thành giao tử, dẫn đến truyền gen ngoại lai cho hệ sau Phương pháp cho hiệu không cao Phôi giai đoạn chứa khoảng 60.000 tế bào Chỉ tỉ lệ nhỏ tế bào có hội mang gen chuyển nhờ vector retrovirus Gà chuyển gen tạo thành dạng thể khảm có hội truyền gen chuyển chúng cho hệ sau Một phương pháp khác chứng tỏ có hiệu Việc tiêm gen thực giai đoạn phôi 16 tế bào vùng lân cận tế bào gốc nguyên thủy Các tế bào tiêm cách ưu tiên, tạo động vật chuyển gen có hội truyền gen chuyển chúng cho hệ sau (Hình 1.9)

virus hội tốt để đến genome tế bào chủ (Hình 1.9)

Lentivirus phân lớp retrovirus Chúng có khả hợp vào genome tế bào pha nghỉ, tế bào tăng sinh tế bào không tăng sinh Khả có có mặt tín hiệu số protein virus Protein virus nhắm tới genome virus vùng nhân Lentivirus phức tạp hơn retrovirus đơn giản, chứa thêm gen tat, rev, vpr, vpu, nef và vif HIV loại lentivirus Vector lentivirus nghiên cứu nhiều tiềm sử dụng chúng liệu pháp gen

Hình 1.9: Sử dụng vector retrovirus để tạo động vật chuyển gen

Genome virus mang gen ngoại lai đưa vào tế bào tổng hợp protein virus khuyết Các hạt virus sử dụng để tiêm vào nỗn bào động vật có vú (bị, khỉ), tế bào mầm nguyên thủy gà phôi tế bào chuột

Các vector ngày cải tiến tinh vi Genome chúng có nguồn gốc từ lentivirus tạo hạt virus tái tổ hợp có khả nhiễm vào tế bào phân chia tế bào không phân chia Vector chứa LTR sửa đổi dẫn đến tự bất hoạt genome virus hợp Ðiều làm giảm đáng kể khả tái tổ hợp tạo virus xâm nhiễm mang gen ngoại lai với phương thức khơng kiểm sốt Các loại vector khơng có gen tăng cường Sự vắng mặt gen tăng cường làm cho thay cho promoter nội sinh điều khiển gen mong muốn hoạt động mà không lệ thuộc vào ảnh hưởng gen tăng cường LTR Vector chứa yếu tố điều hòa sau phiên mã ưu tiên cho việc biểu gen đoạn virus HIV mà đoạn cho phép genome virus vào nhân tế bào không phân chia hợp vào DNA chủ

Các vector điều khiển biểu gen FGFP chuột, tạo màu xanh huỳnh quang tất loại tế bào tế bào promoter hoạt động tất loại tế bào tế bào

Lưu ý khoảng 80% chuột sinh chuột chuyển gen Khoảng 90% số chuột biểu gen chuyển chúng số hệ Protein VSV sử dụng vỏ bọc cho phép xâm nhiễm hiệu vào phơi

Ưu điểm vector hiệu biến nạp cao, thao tác đơn giản, xâm nhiễm thực cách ủ phôi loại bỏ màng với thể virus Phương pháp mở rộng động vật có vú khác mà khơng có vấn đề đặc biệt Phương pháp thuận lợi cách đặc biệt cho việc chuyển gen vào chuột phương pháp vi tiêm khó sử dụng

Rõ ràng, phương pháp thay vi tiêm số trường hợp

1.1.5 Vector Adenovius

a Cấu trúc adenovirus

Adenovirus loại virus khơng có vỏ, chứa genome DNA sợi kép, mạch thẳng Trong có 40 dòng adenovirus typ huyết phần lớn gây nhiễm trùng đường hơ hấp người có nhóm phụ C typ huyết sử dụng làm vector cách ưu Chu trình sống adenovirus thường không liên quan đến hợp vào genome vật chủ, chúng tái yếu tố episome nhân tế bào chủ khơng có nguy phát sinh đột biến xen (insertional mutagenesis)

Tất hạt adenovirus khơng có vỏ, đường kính 60-90nm Chúng có tính đối xứng icosahedron, dễ dàng nhìn thấy kính hiển vi điện tử nhuộm âm tính Vỏ capsid adenovirus bao gồm 252 capssomer Lõi hạt virus chứa tối thiểu protein: protein đầu mút (terminal protein = TP), gắn với đầu 5’ genome liên kết đồng hóa trị; protein V (180 sao/hạt virus) protein VII (1070 sao/hạt virus), protein protein Mu, protein nhỏ (4kD), vị trí chức chưa biết

A B

Hình 1.10: Adenovirus

Hình 1.11: Sơ đồ cấu trúc cắt ngang adenovirus

Genome adenovirus phân tử DNA sợi kép không phân đoạn, dài 30-38kb (các nhóm khác có kích thước khác nhau), mã hóa 30-40gen Có vùng gen phiên mã sớm E1, E2, E3 E4, có chức điều hòa sản phẩm phiên mã muộn mã hóa cho protein cấu trúc Các trình tự đầu mút sợi lặp lại đảo ngược sợi đơn biến tính tạo cấu trúc “cán xoong” (“panhandle”) Ngoài ra, cịn có protein 55kD liên kết với đầu 5’ sợi liên kết đồng hóa trị

b Vector adenovirus

Vector adenovirus vector chuyển gen tạo từ adenovirus tái tổ hợp

gần chứa trình tự lặp lại đảo ngược ITR trình tự đóng gói Tất gen cần thiết virus cung cấp virus hỗ trợ

Vector virus không hợp vào nhiễm sắc thể tế bào tồn episome nhân

Adenovirus vector chuyển gen an tồn, xâm nhiễm cách hiệu vào tế bào không phân chia tế bào phân chia nhiều loại tế bào khác loại tế bào đích chứa thụ quan phù hợp với adenovirus Khi xâm nhiễm vào tế bào chủ, phần lõi mang genome virus gen ngoại lai qua lỗ màng nhân Trong nhân tế bào chủ, gen adenovirus gen ngoại lai phiên mã dịch mã tế bào chất để tạo nên loại protein cần thiết cho virus protein mong muốn gen ngoại lai mã hóa Hạn chế vector adenovirus thứ giảm khả sinh miễn dịch vị trí ngồi nhiễm sắc thể làm cho biểu gen thời, không bền Kết số nghiên cứu cho thấy biểu gen chuyển kéo dài từ vài ngày đến vài tuần

Ðể khắc phục vấn đề nêu trên, hệ adenovirus thứ hai thứ ba tạo Trong vector này, gen E4 (hoặc E2) mã hóa nhiều protein virus loại bỏ để giảm biểu protein virus

c Ứng dụng vector adenovirus

Adenovirus người hệ thứ sử dụng rộng rãi làm vector chuyển gen in vivo (Wilson, 1996) Các vector được sử dụng để chuyển gen người in vivo vào tế bào mũi, tế bào phổi (CFTR cDNA), tế bào màng mạch, tế bào thận (Heikkila, 1996; Sukhatme, 1997), tim, gan, hệ thần kinh trung ương, cơ, tế bào mô máu tế bào ung thư (Jaffe, 1992; Engelhardt, 1993; Chen, 1994; Chang, 1995; Cussack, 1996; Simon, 1999) Merrrich (1996) so sánh tính lây nhiễm adenovirus tái tổ hợp typ tái khơng hồn tồn tế bào màng mạch mơi trường nuôi cấy in vitro Kết cho thấy môi trường nuôi cấy, lây nhiễm tốt tế bào màng mạch người lợn 1.1.6 Vector episome

Lợi trình hợp sử dụng vector DNA ngoại lai truyền cách ổn định cho hệ sau Hạn chế hợp xảy Một vấn đề khác gen hợp bị phụ thuộc vào hoạt động môi trường chromatin nó, làm thay đổi thường xuyên biểu gen chuyển Mặt khác, số lượng hợp bị hạn chế, nói chung khơng vượt 10 số trường hợp tất phiên mã có hiệu

Genome episome phải chứa số yếu tố để bền vững Genome episome có dạng vịng dạng thẳng Khi dạng vòng, thành phần nhỏ chúng khởi điểm tái Tại khởi điểm tái tổng hợp DNA bắt đầu hệ thống làm cho truyền genome tái đến tế bào Genome episome dạng thẳng phải mang telomere hai đầu Cấu trúc telomere có mặt đầu mút nhiễm sắc thể bình thường Chúng thường xun bị suy thối exonuclease phục hồi lại nhờ phức hợp enzyme đặc hiệu Telomere bảo vệ nhiễm sắc thể khỏi bị suy thoái exonuclease Khi tế bào già hơn, tổng hợp telomere trở nên hiệu dẫn đến suy thoái nhiễm sắc thể chết tế bào

Các loại vector episome khác thiết kế để tạo động vật chuyển gen Chúng có kích thước tương đối nhỏ, mang yếu tố tái truyền lại cho tế bào Một phương pháp khác bao gồm sử dụng đoạn nhiễm sắc thể mang tất yếu tố tự nhiên để chuyển gen cho hệ sau

Các vector episome biết rõ sử dụng thường xuyên plasmid, cosmid, phage, BAC YAC Khơng có loại vector sử dụng eukaryote bậc cao yếu tố chúng không hoạt động tế bào động vật Các vector sử dụng chủ yếu để xây dựng DNA tạo DNA tái tổ hợp để nghiên cứu chuyển vào tế bào động vật

Các vector vi khuẩn chứa khởi điểm tái Số tạo sau tái DNA đủ phép truyền vector có tính thống kê đến tế bào

Vector YAC dạng thẳng thiết kế (Hình 1.13) YAC chứa telomere, khởi điểm tái (ARS 1), tâm động (CEN 4), gen chọn lọc (Ura 3) vị trí tạo dịng Vector tương đối ngắn dễ thao tác Sở dĩ khởi điểm tái và tâm động ngắn Khởi điểm tái nấm men Saccharomyces

cerrevisae tập trung vùng genome ngắn Saccharomyces pombe khởi điểm tái dài đến vài nghìn base

Hình 1.13: Cấu trúc vector YAC

Vector chứa khởi điểm tái DNA (ARS 1), tâm động (CEN 4) làm cho phân chia vector tái tế bào con, telomere bảo vệ DNA khỏi bị suy thoái exonuclease, hai gen chọn lọc (TRP UR 3) vị trí tạo dịng mà đưa vào đoạn có kích thước lên đến 1000kb

Vector BAC thiết kế để tái E.coli diện tế bào Chúng mang đoạn DNA có kích thước lên đến 250kb Chúng xây dựng vi khuẩn tái tổ hợp tương đồng Ðiều cho phép việc đưa đoạn DNA ngoại lai vào vector loại bỏ chúng Vector BAC công cụ tốt cho việc chuẩn bị cấu trúc mang đoạn DNA có kích thước lớn để dùng cho việc tạo động vật chuyển gen (Giraldo Montoliu, 2001) (Hình 1.14)

Trong tế bào động vật, tạo vector ngắn mang yếu tố tự nhiên tìm thấy nhiễm sắc thể Khởi điểm tái genome động vật vùng xác định không tốt Một số vùng mô tả đặc điểm sử dụng để tái DNA tế bào nuôi cấy chuột chuyển gen Như đoạn DNA genome chứa vài nghìn bp yêu cầu để khởi đầu trình tái DNA Một phương pháp khả thi tạo dòng đoạn DNA genome vào vector chọn lọc đoạn có khả tái cao tế bào động vật Thí nghiệm cho thấy tối thiểu khởi điểm tái có mặt đoạn DNA động vật có kích thước khoảng 40kb (Kelleher, 1998)

Các khởi điểm tái khơng thích hợp vector vịng truyền cách có hiệu đến tế bào hệ động vật Một nghiên cứu tiến hành cách vài năm cho thấy vector chứa hỗn hợp khởi điểm tái động vật plasmid có hiệu cao việc tạo chuột chuyển gen Vector truyền từ chuột sang vi khuẩn, từ vi khuẩn sang phôi lợn từ phôi lợn quay trở lại vi khuẩn (Attal, 1997) Tuy nhiên vector khơng ổn định xen gen vào Hơn khơng trì suốt đời sống chuột không truyền lại cho hệ Vì vector chứa khởi điểm tái có hiệu truyền lại có tính chất thống kê q trình phân chia tế bào nhanh khơng có hiệu q trình phân chia tế bào chậm Điều giải thích vector khơng mang yếu tố đóng vai trị tâm động

Nhiễm sắc thể eukaryote chứa trình tự lặp lại phần trung tâm chúng Các trình tự lặp lại bám vào khung tế bào (cytoskeleton) suốt trình nguyên phân, cho phép nhiễm sắc thể phân chia tế bào với phương thức thích hợp Vùng tâm động thêm vào vài vector episome Các đoạn tâm động dài tất nhiên sử dụng chúng mang tính đặc hiệu lồi Vì khơng thể sử dụng chúng để thiết kế vector ngắn

Khởi điểm tái virus SV40 nghiên cứu kỹ Khởi điểm có kích thước ngắn cần có kháng ngun T mã hố genome SV40 thành phần tế bào Linh trưởng để tái Vector SV40 chuyển vào tế bào tổng hợp kháng nguyên T (tế bào Cos) sử dụng phổ biến để biểu gen ngoại lai với tần số cao Vector không tái tế bào khơng thuộc Linh trưởng sử dụng để tạo động vật chuyển gen

Virus herpes trạng thái tiềm sinh tế bào nhiễm Mỗi tế bào chứa vài genome virus mà truyền cho tế bào Trong trường hợp định đặc biệt thể bị nhiễm suy giảm miễn dịch, genome virus tái với tần số cao gây trạng thái bệnh lý có liên quan Đây trường hợp virus Herpes simplex, cytomegalovirus, virus Epstein-Barr số virus khác

Các virus có khởi điểm tái hệ thống tâm động giả (pseudocentromeric system) Hai yếu tố nghiên cứu cách chi tiết virus Epstein-Barr (EBV) Các vùng có kích thước nhỏ cần thiết cho tái genome EBV di truyền chúng cho tế bào vùng khởi điểm tái P (ori P) gen EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen) Vùng khởi điểm tái P chứa hai vùng có chức riêng biệt Cả hai bám vào protein EBNA Một vùng khởi điểm tái P làm chức khởi điểm tái Vùng thứ hai cần cho truyền genome virus cho tế bào

Các kết nghiên cứu cho thấy khởi điểm tái EBV hoạt động tế bào Linh trưởng chó Khởi điểm tái EBV bị thay đoạn DNA genome người động vật có vú khác Một số đoạn DNA genome chứa khởi điểm tái cho phép vector tái truyền lại cho tế bào chuột chuyển gen (Kelleher, 1998) Tuy nhiên chưa có chứng chứng minh vector ổn định truyền lại cho hệ

vào chromatin tế bào eukaryote khác Một nghiên cứu cho thấy EBNA bám vào ori P protein EBP nhận thành phần chưa biết chromatin (Hình 1.15 ) Một vector vòng mang vùng ori P bám vào EBNA khởi điểm tái nấm men trì hồn tồn hiệu nấm men biểu gen EBNA EBP người (Kapoor, Shire Frappier, 2001) Điều cho phép đưa giả thuyết vector episome mang khởi điểm tái hoạt động tế bào chuột gen mã hoá protein EBNA EBP trì vector vịng episome suốt đời sống động vật truyền lại cho hệ Genome EBV có kích thước 200kb vector EBV mang đoạn DNA ngoại lai có kích thước 100kb

Vector chứa khởi điểm tái SV40 trình tự MAR có khả trì ổn định episome tế bào nuôi cấy (Jenke, 2002)

Các loại vector nghiên cứu phịng thí nghiệm vector thoi (shuttle) chúng mang hệ thống tái prokaryote eukaryote Chúng truyền đến vi khuẩn đường ruột (intestine bacteria) gieo rắc vào môi trường Điều tránh cách dễ dàng cách loại bỏ khởi điểm tái prokaryote

Khả thiết kế vector độc lập khác bao gồm sử dụng đoạn DNA genome dài chứa khởi điểm tái tự nhiên, tâm động telomere Các vector nhiễm sắc thể nhân tạo người (HAC), có sau xảy đột biến ngẫu nhiên loại bỏ phần lớn nhiễm sắc thể giữ lại yếu tố nhỏ để tạo hệ thống tự chủ (Vos, 1998; Voet, 2001) Thao tác vector khơng dễ dàng khó để đưa gen ngoại lai vào chúng Hơn nữa, đoạn genome dài chứa nhiều gen can thiệp vào sinh lý học động vật can thiệp vào gen quan tâm thêm vào vector

Hình 1.15: Cấu trúc vector episome vòng dựa genome virus Epstein-Barr (EBV)

Protein EBNA mã hoá genome EBV bám vào vùng khác genome EBV Protein EBNA bám vào protein tế bào EBP Protein EBP liên kết với yếu tố không đặc hiệu chromatin Hệ thống giống tâm động cho phép truyền vector cho tế bào Khởi điểm tái EBV hoạt động riêng biệt tế bào Linh trưởng

bằng dung hợp tế bào Các tế bào gốc phôi mang nhiễm sắc thể người sử dụng để tạo chuột chuyển gen thể khảm Chuột chuyển gen thể khảm biểu gen globulin miễn dịch (immunoglobulin) nằm nhiễm sắc thể số Vì thu kháng thể đơn dòng người từ chuột (Tomizuka, 1997)

Vector episome hoàn toàn hữu dụng cho nhà nghiên cứu, cho việc nghiên cứu gen tế bào bị nhiễm liệu pháp gen việc tạo động vật chuyển gen

1.2 Vector thay gen

Một tái tổ hợp tương đồng hai đoạn DNA xảy thể khác chúng mang trình tự DNA chung Ở vi khuẩn kích thước cần thiết đoạn DNA vài trăm bp, nấm men tối thiểu 20-50bp tế bào động vật vài ngàn bp để gây nên tái tổ hợp tương đồng Cơ sở chế tái tổ hợp tương đồng mơ tả hình 1.16 Nếu trình tự tương đồng đơn có mặt genome DNA ngoại sinh tái tổ hợp dẫn đến hợp đích (targeted intergration) DNA ngoại lai (Hình 1.17) Nếu hai trình tự tương đồng khác biệt diện DNA ngoại sinh hai tái tổ hợp tương đồng xảy cách độc lập dẫn đến thay riêng biệt vùng genome (Hình 1.16) Vì trình tự ngoại lai hợp cách xác vào vị trí cho genome Trình tự ngoại lai làm ngắt qng gen đích, làm cho trở nên bất hoạt Protocol gọi là knock-out gen Trình tự ngoại lai gen hoạt động có thể liên quan khơng liên quan với gen đích Sự hợp được gọi knock-in gen.

1.3 Vector xếp lại gen đích

Hình 1.16: Sự chọn lọc dương tính âm tính kép để tách chiết tế bào mà tái tổ hợp tương đồng xảy ra

A Tái tổ hợp tương đồng bao hàm hợp gen neor loại gen

TK Các tế bào kháng với G418 gancyclovir

B Sau hợp vector vào vị trí ngẫu nhiên, tế bào kháng với G418 nhạy cảm với gancyclovir

hợp Hai loại enzyme recombinase tồn dạng thể đột biến khác Trong thực tế, trình tự LoxP FRT phải thêm vào cấu trúc gen

Hình 1.17: Sự thay gen thể đột biến sử dụng tái tổ hợp tương đồng kép

Ưu điểm hệ thống LoxP FRT tái tổ hợp xảy có mặt recombinase Các tế bào động vật có vùng DNA tiếp giáp với trình tự LoxP khơng có recombinase Các enzyme bổ sung vào tế bào

in vitro in vivo động vật chuyển gen cách vi tiêm trực

đưa vào tế bào vector adenovirus Các vector tiêm vào mô động vật chuyển gen mang vùng DNA tiếp giáp với trình tự LoxP Hơn nữa, plasmid chứa gen recombinase đưa vào phơi giai đoạn tế bào vào tế bào soma Các plasmid có hội hợp cấu trúc dạng vịng chúng Chúng biến nhanh chóng q trình nhân tế bào có mặt recombinase thời

Các recombinase truyền cho động vật chuyển gen chuyển gen Chuột chuyển gen mang gen recombinase lai với dòng chứa vùng DNA tiếp giáp với trình tự LoxP

Một cách lý tưởng, gen recombinase không nên biểu nhiều trường hợp tất mô biểu thường xuyên Nếu điều cần thiết recombinase đặt kiểm soát promoter hoạt động tất loại tế bào Trái ngược lại, promoter đặc hiệu mơ hạn chế tái tổ hợp LoxP tế bào mà promoter hoạt động Hệ thống biểu kiểm soát tetrecycline dẫn xuất tetracycline, cho phép gen recombinase biểu loại tế bào động vật có tetracycline

Một bước điều hồ khác thêm vào để kiểm soát recombinase Cre Các gen dung hợp mang trình tự mã hố recombinase Cre phần thụ quan steroid xây dựng Protein dung hợp hoạt động có mặt steroid steroid gây biến đổi hình thể protein

Trình tự NLS (nuclear localization signal = tín hiệu định vị nhân) cho phép recombinase tập trung nhân đạt hiệu nồng độ thấp Trường hợp xảy phụ thuộc vào tính đặc hiệu tế bào promoter yếu sử dụng để biểu gen recombinase

Tất hệ thống tinh vi nhằm gây tái tổ hợp xác để giống hệt biểu gen tự nhiên để tạo điều kiện thí nghiệm thích hợp

2 Các vector sử dụng để chuyển gen thực vật

2.1 Các vector biến nạp vào tế bào thực vật sử dụng Agrobacterium 2.1.1 Sự gây khối u Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens A rhizogenes hai loài vi

khuẩn sống đất gây bệnh khối u hình chóp (crown gall) (Hình 1.18 hình 1.19 ) bệnh lơng rễ (hairy root) vị trí tổn thương thực vật hai mầm

Chỉ thực vật mầm thuộc họ Liliaceae

Amaryllidaceae dễ bị bệnh khối u hình chóp Lý giới hạn vật

chủ chưa biết Một lần khởi đầu, sinh trưởng khối u tiếp diễn vắng mặt vi khuẩn mơ khối u sinh trưởng vô trùng nuôi cấy mô môi trường thiếu bổ sung auxin cytokinin ngoại sinh mà bình thường cần thiết để xúc tiến sinh trưởng mô thực vật in

vitro Mô khối u tổng hợp amino acid dẫn xuất

đường biết chung opine Loại opine tổng hợp khối u (ví dụ nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine agropine) phụ thuộc vào dịng Agrobacterium khởi đầu hình thành khối u Octopine nopaline hai loại opine có nguồn gốc từ arginine dễ dàng phát mơ khối u hình chóp Do nhiều dịng Agrobacterium tumefacien phổ biến thiết kế theo kiểu octopine nopaline Agropine, dẫn xuất đường được tìm thấy phổ biến khối u lơng rễ gây A

rhizogenes Agrobacterium chịu trách nhiệm hình thành

khối u dị hóa cách có chọn lọc opine mà tổng hợp sử dụng opine nguồn cacbon nitơ

Hình 1.18: Bệnh khối u hình chóp ở mâm xơi (Rubus)

A.tumefaciens gây ra

Hình 1.20: Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

2.1.2 Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens

Ti-plasmid (Hình 1.21A)được tìm thấy tất dịng

A.tumefaciens gây độc, có kích thước khoảng 200-250 kb Chúng

được trì ổn định Agrobacterium nhiệt độ 30oC Bằng phương pháp lai DNA-DNA lập đồ chuỗi kép dị hợp (heteroduplex mapping), người ta xác định Ti-plasmid có vùng tương đồng Kết phân tích di truyền cho thấy vùng T-DNA (transferred DNA) vùng gây độc (virulence) liên quan đến hình thành khối u hai vùng khác liên quan đến tiếp hợp và tái plasmid Agrobacterium.

Trong hình thành khối u, T-DNA chuyển vào tế bào thực vật hợp với genome nhân T-DNA ổn định

genome nhân Lai Ti-plasmid với DNA khối u cho thấy T-DNA tế bào thực vật tương ứng song song với T-T-DNA Ti-plasmid Agrobacterium Kết chứng tỏ khơng có xếp lại vị trí T-DNA lúc khối u tạo thành Một nhiều T-DNA có mặt đoạn lặp nối tiếp Chúng tách liên kết với vùng khác DNA thực vật Vị trí hợp T-DNA vào DNA thực vật hoàn toàn ngẫu nhiên Các vùng tương đồng với T-DNA tìm thấy Ti-plasmid khác (Hình 1.21B ) Trong dịng

A.tumefaciens kiểu nopaline sử dụng phổ biến Vùng T-DNA

có kích thước khoảng 24 kb Ở số khối u hình chóp kiểu octopine, hai đoạn khơng kề tìm thấy TL TR TL có kích thước 14 kb, có mặt tất dòng tế bào biến nạp có chức tương đương với T-DNA dịng tế bào nopaline TR có kích thước kb, hình thành từ phía bên phải TL -DNA Ti- plasmid, không phát thấy tất dòng khối u số khác với TL người ta giả thiết xảy trình chuyển độc lập

mã hóa enzyme liên quan đến hệ thống cytokinin đột biến dẫn đến tăng sinh rễ từ khối u hình chóp gây một số loài (các thể đột biến rễ) Các locus tms tms liên quan đến tổng hợp khơng điều hịa auxin đột biến hai locus gây nên tăng sinh chồi từ khối u hình chóp nhiều loại thực vật (các thể đột biến chồi) Vì vậy, T-DNA mang gen (tms 1, tms tmr) mà sản phẩm chúng không chịu điều hịa bình thường đường chuyển hóa thực vật liên quan đến tổng hợp phytohormone điều gây kiểu hình ung thư Do gen tms 1, tms tmr xem gen ung thư Tuy nhiên cần lưu ý gen mã hóa T-DNA khơng địi hỏi phải chuyển T-DNA vào tế bào thực vật khơng trì ổn định genome thực vật

2.1.3 Ri-plasmid Agrobacterium rhizogenes

Hình 1.21: Cấu trúc biểu Ti-plasmid kiểu octopine nopaline

A Bản đồ Ti-plasmid kiểu octopine (pTiAch5) kiểu nopaline (pTiC58) cho thấy vị trí tương đối kích thước vùng chức

Các vị trí tơ đậm chí vùng tương đồng lớn plasmid

//: Các đoạn lặp trực tiếp 25 bp; CON: vùng mã hóa chức tiếp hợp ORI: vùng mã hóa chức tái khởi điểm tái

B Bản đồ vùng T kiểu nopaline octopine cho thấy vùng chức chính, vùng tương đồng sản phẩm phiên mã

đã biết khơng có tương đồng có ý nghĩa T-DNA (kiểu octopine) A.tumefacien TR T-DNA khơng cần thiết trì kiểu hình lơng tơ Tuy nhiên nhiều lồi, dịng Agrobacterium có TL TR T-DNA độc nhiều so với dòng mang T-DNA (Vilaine Case-Delbart, 1987) 2.2 Cơ chế chuyển T-DNA

Các vùng T-DNA A.tumefaciens A.rhizogenes nằm bên cạnh đoạn lặp trực tiếp 25 bp (Hình 1.11) điểm kết thúc T-DNA hợp genome thực vật nằm sát với trình tự Trình tự liên ứng biên T-DNA GGCAGGATATTC/GA/G GT/GTCTAAA/TT/C Hầu hết nghiên cứu cơ chế chuyển T-DNA từ Agrobacterium vào tế bào thực vật được tiến hành A.tumefaciens Việc loại bỏ bờ phải Ti-plasmid kiểu nopaline làm hình thành khối u, đoạn oligonucleotid tương đồng với bờ phải tạo dòng với định hướng xác với Ti-plasmid thiếu bờ phải hình thành khối u lại phục hồi (Wang, 1984), cho thấy trình tự lặp 25 bp phân cực tác động (cis-acting)

Sự tiếp xúc Agrobacterium với hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương làm cho vùng vir Ti-plasmid phiên mã (Hình 1.22) Trong trình chất có hoạt tính hóa học cao đặc trưng nhận biết acetosyringone Gen vir A gen vir C biểu vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng gen vir C phiên mã mức độ thấp Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ tế bào thực vật bị tổn thương, acetosyringone tinh khiết, sản phẩm gen vir A (có thể liên kết với màng) nhận diện tương tác với acetosyringone truyền tín hiệu ngoại bào vào tế bào làm hoạt hóa sản phẩm gen vir C Sau protein vir C biến đổi hoạt hóa làm cho gen vir B, C, D E không hoạt động làm tăng cường phiên mã gen vir C

cơ chế tương tự tiếp hợp vi khuẩn, T-DNA chuyển sang tế bào thực vật xen cách ổn định vào DNA nhân (Stachel Zambryski, 1986) Sự kiện liên quan đến protein mã hóa operon vir E (Winans, 1987) Mơ hình mơ tả kiện xảy mức phân tử tương tác tế bào thực vật

Agrobacterium để hình thành khối u hình chóp trình bày hình

1.22

2.3 Plasmid Agrobacterium vector biến nạp

Khả chuyến cách tự nhiên trình tự DNA xác định vào genome thực vật Agrobacterium sử dụng vào việc phát triển vector biến nạp thực vật Các vector lợi dụng một số đặc tính bẩm sinh Agrobacterium trình biến nạp trung gian (mediated transformation process) Vào đầu thập niên 1980, số nhóm nghiên cứu Ti-plasmid loại bỏ tất gen

onc T-DNA Khám phá quan trọng thứ gen onc

không cần thiết việc chuyển T-DNA vào tế bào thực vật khơng hợp vào DNA nhân Vì gen thay Nó khơng cho phép xen DNA ngoại lai vào mà cho phép loại bỏ chức gen onc Tuy nhiên cần lưu ý rằng, nos hoặc ocs gen marker hữu ích biến nạp hoạt tính enzyme sản phẩm gen chúng phát xét nghiệm đơn giản Cho đến nay, giới hạn kích thước đoạn DNA xen vào chưa công bố Sự kiện quan trọng thứ ba khám phá sản phẩm gen vir hoạt động chức trans Cuối cùng, T-DNA không gây ung thư có mặt tồn thực vật tái sinh truyền lại cho hệ sau theo kiểu di truyền Mendel

2.4 Các thành phần vector Ti-plasmid không gây ung thư Ðặc điểm chuyển gen qua trung gian Agrobacterium DNA tạo dịng chuyển vào genome tế bào thực vật hai mầm DNA ngoại lai phải nằm mép trình tự biên T-DNA trì ổn định dịng

Agrobacterium mang nhóm bổ sung đầy đủ gen vir dạng cis

được mô tả có liên quan với việc vi khuẩn nhận thành phần bề mặt tế bào thực vật, gắn vào sau

Ðể nhận tế bào biến nạp, gen trội kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn xen vào trình tự lặp 25 bp kiểm soát T-DNA promoter tín hiệu polyadenyl hóa Các gen kháng thuốc kháng sinh dạng khảm biểu cách có hiệu tế bào thực vật môi trường di truyền Việc liên kết cách chặt chẽ gen marker với DNA ngoại lai có lợi ích: thứ để chọn lọc trực tiếp mô thực vật biến nạp DNA ngoại lai vào cách chắn; thứ hai đảm bảo DNA ngoại lai dòng biến nạp đặc trưng chọn lọc không xen vào vùng genome không phiên mã

2.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa Ti-plasmid

Cả A.tumefaciens A.rhizogenes sử dụng để chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực vật Nhiều vector biến nạp dựa Ti-plasmid phát triển (Bảng 1.1 bảng 1.2) Các vector không chứa trình tự ung thư tế bào thực vật sinh trưởng bình thường sau chuyển DNA vào nhân Các vector khơng gây ung thư sử dụng chia làm hai loại cis trans, dựa vào việc có hay khơng vùng T-DNA nằm mép trình tự lặp trực tiếp 25 bp đơn vị tái (replicon) gen vir plasmid phân tán (Hình 1.13) Trước đây, loại vector thường đề cập đến vector liên hợp (co-intergrative vector), nhiên gần vector nhị thể (binary vector) phổ biến

2.5.1 Cis vector

Ðây vector có nguồn gốc từ Ti-plasmid kiểu dại mà gen

onc T-DNA loại bỏ số trường hợp

chọn lọc hoạt động chức tế bào thực vật trình tự cho việc xen DNA ngoại lai vào

Vector trung gian mang trình tự DNA ngoại lai thường đưa vào A.tumefaciens tiếp hợp sử dụng chọn lọc thích hợp thu thể nhận tiếp hợp với DNA ngoại lai ổn định T-DNA kết tái tổ hợp tương đồng (Hình 1.23A )

Hình 1.23: Sơ đồ hệ thống vector liên hợp (A) vector nhị thể (B)

Ở số vector pGV3850 (Hình 1.24), hai biên T-DNA Ti-plasmid sửa đổi Trong vector pGV2260 (Debleare, 1982), trình tự lặp 25 bp vector trung gian, vector pTiBS3-SE (Fraley, 1985), biên phải vector trung gian biên trái gen vir plasmid Bất kỳ đâu vị trí khởi đầu trình tự lặp 25 bp, kết thực sau liên hợp xen trình tự DNA ngoại lai biên T-DNA lặp lại Ti-plasmid sửa đổi Vì dịng

A.tumefaciens mang cấu trúc này, T-DNA chuyển vào genome

thực vật suốt biến nạp kết hoạt động vùng vir dạng cis

Hình 1.24 : Cấu trúc sử dụng vector liên hợp pGV3850

Bản đồ cho thấy cấu trúc vector biến nạp thực vật pGV3850 vector trung gian pGV1103 kết việc hợp pGV1103 vào pGV3850 LB: biên trái; RB: biên phải; Pnos: promoter nopaline synthetase; npt-II: trình tự mã hóa neomycin phosphotransferase-II từ Tn5; ocA: trình tự polyadenyl hóa octopine synthase; E: EcoRI; H: HindIII; B: BamHI; nos: nopaline synthase; ApR: gen kháng ampicillin; KmR: gen

Một ví dụ chi tiết vector cis pGV3850 (Zambryski, 1983) Vector loại bỏ gen onc Ti-plasmid kiểu nopaline (C58) thay pBR322 (Hình 1.25) Bất kỳ trình tự DNA ngoại lai tạo dịng pBR322 đưa vào pGV3850 trình chuyển vào Agrobacterium theo cách tiếp hợp tái tổ hợp bao gồm hai bước Trước hết pBR322 mang gen cần chuyển marker kháng thuốc kháng sinh cho phép chọn lọc Agrobacterium (kanamycin streptomicin/spectinomycin) được đưa vào dòng Ecoli chứa hai plasmid hỗ trợ pGJ28 pRGdrd11 Các plasmid cung cấp ColE1 có chức hỗ trợ, cho phép chuyển plasmid vào Agrobacterium qua tiếp hợp Tuy nhiên pBR322 tái Agrobacterium không bảo tồn, tái tổ hợp xảy pBR322 pGV3850 làm cho gen quan tâm chuyển vào Ti-plasmid Thể nhận tiếp hợp chọn lọc nhờ tính kháng plasmid mã hóa tính kháng rifampicin nhiễm sắc thể

Agrobacterium mã hóa

2.5.2 Vector nhị thể

Vector trans vector nhị thể dựa plasmid có thể tái E.coli Agrobacterium plasmid có chứa trình tự biên T-DNA (Hình 1.23B) Các vector thiết kế cho trình tự biên cạnh MCS cho phép xen DNA ngoại lai vào marker cho phép chọn lọc trực tiếp tế bào thực vật biến nạp Plasmid thao tác

E.coli chuyển vào qua tiếp hợp với dòng Agrobacterium mang plasmid có chứa vùng vir thiếu T-DNA

và trình tự lặp 25 bp Các plasmid thường thể đột biến đoạn đơn giản Ti-plasmid octopine kiểu dại kiểu nopaline (Bảng 1.2) Việc chuyển DNA ngoại lai vector tạo dịng vào tế bào thực vật thực hoạt động chức vùng vir

pBin19 vector nhị thể phổ biến dựa đơn vị tái (replicon) vật chủ mở rộng pRK252 (Hình 1.25A) Vì có thể tái E.coli Agrobacterium, cho phép xen DNA ngoại lai vào vector sàng lọc E.coli trước chuyển vào

Hình 1.25 : Cấu trúc sử dụng vector nhị thể pBin19

A Bản đồ vector nhị thể pBin19

LB: biên trái; RB: biên phải; lac: vùng bổ sung α operon lac; Pnos: promoter gen nopaline synthetase; npt-II: trình tự mã hóa neomycin phosphotransferase-II từ Tn5; nosA: trình tự polyadenyl hóa gen nopaline synthase

B Sự xâm nhập pBin19 vào A.tumefaciens LBA4404 sử dụng plasmid hỗ trợ pRK2013 sau loại bỏ plasmid hỗ trợ Agrobacterium.

các tế bào thực vật (một gen kháng kanamicin nằm cạnh promoter nos trình tự poly(A) thêm vào) MCS vùng bổ sung α β-galactosidase Sự sàng lọc thể tái tổ hợp tiến hành Lac- E.coli nhờ bổ trợ α với có mặt IPTG X-GAL (Groneborn Messing, 1978) Vector đưa vào Agrobacterium tiếp hợp sử dụng chức hỗ trợ của pKR2013 Agrobacterium chủ LBA4404 chứa Ti-plasmid (pLBA4404) loại bỏ T-DNA vùng vir khơng đổi Thể nhận tiếp hợp chọn lọc nhờ tính kháng kanamicin rifampicin

Ví dụ hệ thống vector nhị thể trình bày bảng 1.2 Các vector nhị thể khác kích thước, tái ổn định trong Agrobacterium, vị trí tạo dịng, bổ trợ α để sàng lọc plasmid tái tổ hợp đĩa X-GAL, gen marker để chọn lọc thực vật biến nạp gen marker để chọn lọc thể nhận tiếp hợp, phần lớn biết thích hợp với số plasmid hỗ trợ mang gen vir A.tumefacien với nhiều Ri-plasmid

2.6 Vector biến nạp thực vật sử dụng A.rhizogenes

Các vector sử dụng lần biến nạp vào loại thực vật mà tái sinh toàn thể từ tế bào đơn lẻ khó khăn Ở số lồi, tái sinh thể xảy từ nuôi cấy rễ gây A.rhizogenes thông qua phát triển phôi soma phát sinh quan Cơ chế kiểu hình lơng rễ bị ức chế làm phát sinh hình thái chồi chưa rõ Thực vật tái sinh từ lông rễ thường bị biến đổi hình thái: bị gấp nếp, hệ thống rễ ăn nghiêng, sinh trưởng cằn cỗi khả sinh sản

2.6.1.Vector liên hợp

Ðây vector trung gian thiết kế cho phép thao tác

E.coli chứa vùng T-DNA Ri-plasmid Sự dẫn nhập vector vào A.rhizogenes mang Ri-plasmid bình thường làm ổn định

2.6.2.Vector nhị thể

Vector nhị thể loại bỏ hết khả gây hại có nguồn gốc từ A.tumefaciens (Bevan, 1984; Van den Elzen, 1985) đưa vào A.rhizogenes tái ổn định miễn chọn lọc trì Sau nhiễm A.rhizogenes mang vector nhị thể với thực vật làm chuyển T-DNA từ vector nhị thể với T-DNA

A.rhizogenes vào genome thực vật (Shalin, 1986; Simpson, 1986)

Các gen chuyển vào genome thực vật định vị trình tự biên vector nhị thể Các trình tự biên vector nhị thể có tác dụng sau cảm ứng vùng vir Ri-plasmid kiểu dại chỗ (Simpson, 1986; Trulson, 1986) Ðiều xảy độ tương đồng lớn, mức DNA, vùng gây độc (virulence region) A.tumefacien A.rhizogenes (Huffman, 1984)

Gần lông tơ (hairy root) cà chua dưa chuột tạo ra A.rizhogenes kiểu dại mang vector nhị thể với marker chọn lọc Kmr Thể tái sinh từ môi trường nuôi cấy lông rễ kháng kanamicin sàng lọc thực vật kiểu hình bình thường số phục hồi mà thiếu T-DNA

A.rizhogenes có mặt T-DNA vector nhị thể (Shalin, 1986;

Trulson, 1986) chuyển độc lập T-DNA tách rời Ðặc tính A.rhizogenes làm cho trở nên hấp dẫn vector biến nạp q trình mở rộng nhiều loại trồng khác

Tài liệu tham khảo chính

Makrides SC 2003 Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells Elsevier Science B V USA

Louis-Marie H 2003 Animal Transgenesis and Cloning John Wiley and Sons, Ltd USA

Leland HH, Leroy H, Michael LG, Ann ER, Lee MS, Ruth CV 2000 Genetics, The McGraw-Hill Companies, Inc USA

Glick BR, Jackj P 1994 Molecular Biotechnology ASM Press Washington D.C USA

Chopra VL, Anwan N 1990 Genetic Engineering and Biotechnology Oxford and IBH Publishing CO.PVT, Ltd UK