(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (cylas formicarius)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ XUÂN THAO NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ KHOAI LANG CHUYỂN GEN CRY3 KHÁNG SÂU NON BỌ HÀ (Cylas formicarius) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ XUÂN THAO NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ KHOAI LANG CHUYỂN GEN CRY3 KHÁNG SÂU NON BỌ HÀ (Cylas formicarius) Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 40 42 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phạm Bích Ngọc Hà Nội - 2012 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG I DANH MỤC CÁC HÌNH II BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT III MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò giá trị khoai lang 1.1.1 Sơ lƣợc khoai lang 1.1.2 Giá trị dinh dƣỡng giá trị kinh tế khoai lang 1.2 Bọ hà hại khoai lang (Cylas formicarius) 1.2.1 Đặc điểm sinh học bọ hà hại khoai lang 1.2.2 Tập tính sống gây hại bọ hà 1.3 Kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogens ứng dụng 1.3.1 Giới thiệu vi khuẩn A rhizogens 1.3.2 Hệ vector nhị thể 11 1.3.3 Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ 13 1.3.4 Yếu tố ảnh hƣởng lên trình chuyển gen nhờ Agrobacterium 17 1.4 Gen có hoạt tính gây độc Bacillus thuringiensis (Bt) 18 1.4.1 Sơ lƣợc Bt 18 1.4.2 Phân loại gen mã hoá độc tố Bt 20 1.4.2.1 Các gen nội độc tố cry 20 1.4.2.2 Các gen ngoại độc tố khác 21 1.4.3 Cấu trúc chế tác động protein cry gây độc cho côn trùng 23 1.4.4 Một số thành tựu tạo khoai lang chuyển gen 25 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 27 2.1.1 Vật liệu 27 2.1.2 Hóa chất 27 2.1.3 Thiết bị 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Chuyển gen thông qua Agrobacterium 28 2.2.1.1 Tạo dịch huyền phù Agrobacterium 28 2.2.1.2 Nhiễm vi khuẩn với mảnh 28 2.2.2 Đánh giá trồng chuyển gen qua biểu tạm thời gen gus 29 2.2.3 Tách, tinh DNA tổng số 29 2.2.4 Kiểm tra gen biến nạp kỹ thuật PCR 29 2.2.5 Điện di sản phẩm PCR agarose, nhuộm Ethidium Bromide đọc kết máy soi gel 31 2.3 Tách protein tổng số thực vật 32 2.4 Xác định hàm lƣợng protein phƣơng pháp Bradford 32 2.5 Xác định hoạt lực diệt côn trùng protein lên sâu non bọ hà 33 2.5.1 Nuôi sâu non bọ hà 33 2.5.2 Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà 34 2.5.3 Đánh giá hoạt lực protein lên sâu non bọ hà 34 2.6 Phƣơng pháp sử lý số liệu 34 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết phân tích biểu tạm thời gen gus 35 3.1.2 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả biến nạp 36 3.1.3 Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả biến nạp 37 3.1.4 Ảnh hƣởng chất cảm ứng (AS) đến khả biến nạp 39 3.2 Kết chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A rhizogens 41 3.2.1 Sơ đánh kết chuyển gen thông qua A rhizogens mang vector pIBT/cry3 42 3.2.2 Kết tinh DNA khoai lang tổng số 45 3.2.3 Kết chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua A rhizogens 45 3.3 Kết tách protein tổng số 48 3.4 Kết kiểm tra hoạt lực diệt côn trùng protein biến nạp 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 Kết Luận 52 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 62 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình sản xuất khoai lang nƣớc theo địa phƣơng Bảng 1.2 Phân loại độc tố cry 21 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 31 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian lây nhiễm đến khả biến nạp 36 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả biến nạp 37 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả biến nạp 38 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ chất cẩm ứng AS đến khả biến nạp 40 Bảng 3.5 Hàm lƣợng protein dòng KB1 48 Bảng 3.6 Hoạt lực diệt côn trung protein lên sâu non bọ hà 49 i DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Bọ hà trƣởng thành Hình 1.2 Cấu trúc plasmid Ri A rhizogenes 11 Hình 1.3 Hình ảnh tạo khối u gây A tumefaciens rễ tơ A rhizogenes 13 Hình 1.4 Nuôi cấy rễ tơ G.glabra 15 Hình 1.5 Một số ứng dụng rễ tơ 17 Hình 1.6 Bào tử tinh thể độc Bacillus thuringiensis 19 Hình 1.7 Cấu trúc độc tố Cry3A 23 Hình 1.8 Mơ hình hoạt động protein Cry gây độc côn trùng 25 Hình 3.1 Kết biến nạp A rhizogens mang vector pPTN289/Gus 39 Hình 3.2 Kết biến nạp A rhizogens mang vector pPTN289/Gus 41 Hình 3.3 Rễ tơ mô chuyển gen 43 Hình 3.4 Kết biến nạp gen cry3 vào khoai lang KB1 44 Hình 3.5 Kết điện di kiểm tra tách DNA tổng số 45 Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR dòng rễ khoai lang với cặp mồi cry3 46 Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR dòng rễ khoai lang với cặp mồi virC 47 Hình 3.8 Kết thử hoạt tính protein độc lên sâu non bọ hà 51 ii BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A.rhizogenes Agrobacterium rhizogenes ATCC American Type Culture Collection Bt Bacillus thuringiensis Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid Gus β-glucuronidase Km Kanamycin MS Murashige and Skoog OD Optical Density PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction Ri plasmid Root inducing plasmid TL – DNA T Left - DNA TR – DNA T Right - DNA WPM Woody Plant Medium X-Gluc -D-glucuronide Cyclohexylamine iii MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Khoai lang (Ipomoea batatas) lƣơng thực quan trọng vùng nhiệt đới số khu vực ơn đới bao gồm vùng phía nam châu Âu châu Mỹ Củ khoai lang tích lũy lƣợng tinh bột cao Khoai lang giàu lƣợng, vitamin, nhƣ hàm lƣợng protein từ 2% đến 10% khối lƣợng chất khơ [73] Bên cạnh khoai lang tím có polyphenol chứa anthocyamin có tác dụng kháng ơxy hố mạnh, có khả kiềm chế đột biến tế bào ung thƣ, hạ huyết áp, phòng ngừa bệnh tim mạch, có cơng làm đẹp, giàu chất xơ thực phẩm có tác dụng thơng tiện, tác dụng tốt ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng Cây khoai lang có sắc tố bào chế chất nhuộm màu thực phẩm thiên nhiên thay sắc tố tổng hợp nhân tạo Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc đánh giá khoai lang thực phẩm bổ dƣỡng tốt kỷ 21, đƣợc thị trƣờng giới ƣa chuộng Ở nƣớc ta, khoai lang trồng chiếm vị trí quan trọng sản xuất lƣơng thực, đứng thứ sau lúa ngô Với ƣu tạo sinh khối lớn thời gian ngắn phận đƣợc sử dụng, khoai lang đƣợc ý thâm canh Tổng diện tích trồng khoai lang nƣớc 150 800 ha, đạt sản lƣợng 317 200 (Tổng cục thống kê, 2010) Năng suất khoai lang bình quân nƣớc ta 8,73 tấn/ha, thấp so với suất bình quân quốc gia châu Mỹ số nƣớc châu Á Năng suất thấp nguyên nhân giống khoai lang địa phƣơng thối hóa, việc canh tác khoai lang chƣa thực quy trình kỹ thuật nguyên nhân chủ yếu tổn thất sâu bệnh , đă ̣c biê ̣t là bọ hà hại khoai Ở Việt Nam, vùng khơ hạn miền núi phía Bắc, tỉnh miền Trung Tây Nguyên củ khoai lang bị bọ hà gây hại nặng, vụ hè thu tỷ lệ củ bị hại lên đến 30 – 50%, chí lên đến 100% [18] Thiệt hại chủ yếu xảy sâu non bọ hà đục ăn thịt củ thải phân đƣờng đục làm cho củ khoai xuất vết thâm, mùi hắc vị đắng ăn Hiện nay, có nhiều biện pháp để phịng trừ bọ hà khoai lang nhƣ sƣ̉ du ̣ng biện pháp trừ sâu hóa học ; Biện pháp sƣ̉ du ̣ng chấ t dẫn du ̣ sinh học ; Biện pháp canh tác; Sử dụng kẻ thù tự nhiên; Hoặc sử dụng kết hợp nhiều biện pháp khác phòng trừ bọ hà… Tuy nhiên phƣơng pháp gặp phải số vấn đề nhƣ an toàn sinh học, thủ công nên nhiều thời gian nhân cơng, khó đáp ứng cho nhu cầu sản xuất quy mô lớn vùng chuyên canh giới hóa sản xuất Ngày với phát triển Công nghệ sinh học, đặc biệt Công nghệ chuyển gen mở nhiều hƣớng đầy tiềm phòng trừ sâu bệnh cho trồng nói chung phịng trừ bọ hà cho khoai lang nói riêng Phƣơng pháp sẽ giải triệt để hạn chế của các phƣơng pháp truyền thố ng Việc chuyển gen vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoai lang thông qua hệ thống chuyển gen thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium hƣớng Tuy nhiên, nay, tạo khoai lang chuyển gen gặp nhiều khó khăn Do tối ƣu hóa quy trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium, nhƣ thử nghiệm hoạt động cấu trúc gen biến nạp thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ cần thiết Với mục đích làm sở cho việc nghiên cứu tạo giống khoai lang kháng bọ hà, vào điều kiện phịng thí nghiệm cho phép với phƣơng pháp khả thi, tiến hành nghiên cứu đề tài: ―Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius)‖ Mục tiêu đề tài - Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen vào khoai lang thông qua vi khuẩn Agrobacterium - Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen mang gen cry3 thông qua Agrobacterium rhizogens sử dụng làm mơ hình đánh giá hoạt động cấu trúc gen chuyển Nội dung đề tài - Tối ƣu số yếu tố quy trình chuyển gen vào khoai lang KB1 nhờ vi khuẩn A.rhizogens thông qua biểu gen gus - Chuyển gen cry3 vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A rhizogens kiểm tra biểu cấu trúc gen chuyển dòng rễ tơ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò giá trị khoai lang 1.1.1 Sơ lược khoai lang Khoai lang (Ipomoea batatas), hai mầm, thuộc chi khoai lang (Ipomoea), họ bìm bìm (Convolvulaceae), cà (Solanales) Khoai lang trồng vùng nhiệt đới thân thảo sống lâu năm, trồng vùng ôn đới, thƣờng có dạng bụi Lá hình tim, ngun hay có khía Hoa trắng, vàng hay tím, hình phễu Củ hình thoi rễ phồng lên, chứa tinh bột đƣờng, vỏ củ màu trắng, vàng hay đỏ tím, thịt củ trắng, vàng hay tím nhạt tùy theo giống Chúng giao phấn, ngày ngắn, không hoa ngày dài q 13 30 phút, hoa vùng có vĩ độ ơn đới 30 độ Bắc hay Nam Ở vùng nhiệt đới, dễ hoa, có hạt, có sức sống, nhƣng thƣờng trồng đoạn dây gọi hom, trƣờng hợp gây giống trồng mầm nẩy từ củ Khoai lang lục bội thể (hexaploid 2n = 6x = 90), nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới châu Mỹ, đƣợc ngƣời trồng cách 5000 năm, lan truyền sớm sang quần đảo Thái Bình Dƣơng từ sang nƣớc Châu Á, đƣợc C.Colombo đƣa Châu Âu ngƣời Bồ Đào Nha đƣa sang Châu Phi Hiện nay, khoai lang đƣợc trồng khắp vùng nhiệt đới số vùng cận nhiệt đới, ôn đới [16] 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế khoai lang Về giá trị dinh dƣỡng, 100g củ khoai lang tƣơi trung bình có 68g nƣớc; 0,8g protein; 0,2g lipid; 28,5g glucid (24,5g tinh bột, 4g glucoza) 1,3g cellulose, cung cấp cho thể khoảng 122 calo Ngồi khoai lang tƣơi cịn có nhiều vitamin muối khống (34mg canxi, 49,4mg photpho, 1mg sắt, 0,3mg caroten, 0,05mg vitamin B1, 0,05mg vitamin B2, 0,6mg vitamin PP, 23mg vitamin C ) Tuy nhiên hàm lƣợng nƣớc chất khô phụ thuộc vào yếu tố nhƣ giống, nơi trồng, khí hậu, độ dài ngày, loại đất, kỹ thuật trồng trọt Khi phơi khô rút gần hết nƣớc, giá trị dinh dƣỡng khoai cao Trong 100g khoai lang khơ có 2: Mẫu có kết PCR âm tính với gen cry 3: Mẫu có kết PCR dƣơng tính với gen cry Qua bảng cho thấy, với hàm lƣợng protein 20µg 40µg/giếng tỷ lệ sâu chết mẫu tƣơng đối nhỏ Theo nghiên cứu Sheng-Jiun Wu &CS (2012) liều lƣợng gây chết LD50 protein cry3A lên ấu trùng bọ cánh cứng Tenebrio molitor 11,4µg/ấu trùng Ekobu & CS (2010) thử hoạt lực diệt sâu protein Cry3Ca1 với loại sâu lồi Cylas puncticollis Cylas brunneus có liều lƣợng chết trung bình (LC50) 1µg/g thức ăn Youngjin &CS (2009), hoạt lực diệt bọ cánh cứng protein Cry3A, Cry3B có liều chết trung bình (LC50) khoảng 0,7- 13,0µg/cm2 Trong theo Selvapandiyan & cs (2001) thử hoạt lực diệt sâu protein vip3V với loại sâu khác thuộc Bộ Cánh vảy có liều lƣợng chết trung bình dao động khoảng từ 5-2000 ng/cm2 Tuy nhiên điều protein chiết thí nghiệm chƣa đƣợc tinh sạch, tách riêng protein độc, protein sử dụng dƣới dạng protein thô Cũng sâu ăn thức ăn nên lƣợng độc tố chƣa đủ làm chết sâu Trong thực tế nghiên cứu, tỷ lệ sâu non chết ít, khơng đồng tiến hành thử nghiệm nồng độ độc tố phụ thuộc nhiều vào cách bố trí, thao tác thí nghiệm, mơi trƣờng ni sâu chất lƣợng sâu non đem thử Theo số nghiên cứu Cao-guo & CS (1997), Selvapandiyan CS (2001), tiến hành thí nghiệm thử protein độc với sâu xám (Agrotis ypsilon) tác giả xác định trọng lƣợng sâu trƣớc sau thí nghiệm với kích thƣớc sâu non ban đầu 30-40mm Tuy nhiên thí nghiệm đây, sâu non bọ hà tuổi nhỏ kích thƣớc thể dài khoảng 6-7mm nên việc thao tác gặp nhiều khó khăn, quan sát phát triển sâu non hình thái bên ngồi Do dựa theo kết (bảng 3.6) tạm kết luận protein tách từ dịng khoai lang dƣơng tính với gen cry3 có hoạt tính độc sâu non bọ hà 50 Sâu non mẫu đối chứng (trái) mẫu Sâu non chết mẫu (dòng rễ tơ (phải) (dịng rễ tơ âm tính với gen cry3) dƣơng tính với gen cry3) Hình 3.8 Kết thử hoạt tính protein độc lên sâu non bọ hà 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết Luận - Xác định đƣợc điều kiện thích hợp cho q trình chuyển gen tạo rễ tơ vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A rhizogens sử dụng vector chuyển gen pPTN289 mang gen thị gus Thời gian biến nạp: 20 phút Thời gian đồng nuôi cấy: ngày Nồng độ chất cảm ứng AS bổ xung vào huyền phù vi khuẩn: 100µM OD huyền phù vi khuẩn: 0,8 - Bƣớc đầu thu nhận đƣợc 01 dòng khoai lang KB1 mang gen cry3 kháng bọ hà - Bƣớc đầu xác định đƣợc protein tạo thành từ dòng khoai lang chuyển gen cry3 có hoạt tính độc sâu non bọ hà tuổi Kiến nghị Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu, đề xuất kiến nghị nhƣ sau: - Tiếp tục tách, tinh định lƣợng protein cry3 đƣợc mã hóa gen cry3 dòng rễ tơ chuyển gen - Tiến hành thử protein cry3 đƣợc tinh lên sâu non bọ hà để đánh giá hiệu diệt sâu non bọ hà cách xác - Tiếp tục tạo dòng rễ tơ chuyển gen từ giống khoai lang khác, sử dụng cấu trúc gen khác đánh giá hoạt động gen đƣợc chuyển, để hoàn thiện phƣơng pháp chuyển gen vào khoai lang 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng kĩ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Phan Văn Chi (2003), ―Khối phổ nghiên cứu proteomics‖, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 1(1), tr 11-24 Nguyễn Hoài Hƣơng, Bùi Thế Vinh (2009), Thực hành hóa sinh, Đại học Quốc Gia, TPHCM Bùi Thị Hƣơng (2002), Phân lập phân loại xác định tính chất sinh hố sinh học phân tử số chúng Bacillus thuringiensis Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ sinh học, tr 1-4 Lê Thị Thu Hiền (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng, Luận văn Tiến sĩ Sinh học, tr 22-28; 33-36 Bùi Bảo Hồn (1993), Ứng dụng kỹ thuật ni cấy mơ tế bào bảo quản nhân giống chọn dòng chịu lạnh khoai lang (Ipomea batatas L.), Luận văn Thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2007), Công nghệ gen nông nghiệp, Nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội Đinh Thế Lộc (1977), Kỹ thuật canh tác khoai lang, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, tr 5-13 10 Ngô Xuân Mạnh (1996), Nghiên cứu tiêu phẩm chất số biện pháp chế biến nhằm nâng cao hiệu sử dụng khoai lang trồng vụ đông miền Bắc Việt Nam, Luận án phó Tiến sỹ khoa học nơng nghiệp, Trƣờng Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội 11 Nguyễn Trung Nam, Vũ Đình Hồ, Đinh Sơn Quang, Nguyễn Thị Bích Thuỷ, Võ Thị Thứ, Lê Trần Bình (2001), ―Sàng lọc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phục vụ cho việc phân lập gen kháng bọ hà khoai lang‖, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr.206-213 53 12 Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc (2005), Cây có củ kỹ thuật thâm canh, Nhà xuất Lao động xã hội, Hà Nội Tập 13 Phạm Bích Ngọc, Đinh Thị Phịng, Egnin M., Prakash C.S., Lê Trần Bình (2002), ―Hồn thiện phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens‖, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 40, tr 142-149 14 Lâm Đại Nhân (2000), Tách dòng thiết kế vector chuyển gen gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng đu đủ (PRSV) Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, tr 35-36 15 Nguyễn thị Kim Oanh, Elske Van de Fliert, Ann R Braun (2001), Quản lý dịch hại tổng hợp khoai lang, Trung tâm Khoai tây quốc tế, tr 106-113 16 Nguyễn Công Tạn (2012), Vị khoai lang nông nghiệp, Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội 17 Lê Thị Bích Thảo (2003), Nghiên cứu biểu tinh chế protein lai HSP2, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, tr 35-36 18 Nguyễn Văn Toản, Nguyễn Văn Đĩnh Nguyễn Bích Thuỷ (1997), ―Kết bƣớc đầu sử dụng vật liệu ngăn ngừa bọ hà (Cylas farmicarius) bảo quản khoai lang tƣơi‖, Tạp chí BVTV, 1, tr 26-28 19 Nguyễn Thị Bích Thuỷ (1997), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học bọ hà (Cylas formicarius fabricius) biện pháp phòng chống chúng thời kỳ bao quản khoai lang tươi, Luận văn Thạc sĩ khoa học nông nghiệp, tr 40-42; 54-59; 80-83 20 Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Nhà xuất Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Tập Tài liệu tiếng Anh 21 Amoah, B.K., H Wu, C Sparks and H.D Jones (2001) ―Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue‖, Journal of Experimental Botany, 52(358), pp.1135-1142 22 Bo Yu Hong Zhai Yuping Wang Ning Zang Shaozhen He Qingchang Liu (2007), ―Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using embryogenic suspension cultures in sweetpotato, Ipomoea batatas (L.) Lam.‖, Plant Cell Tiss Organ Cult, 90, pp 265–273 23 Briew L O., Henrry R J (2000), Transgenic Cereal, American Association of Cereal Chemist St Paul, Minnesota, USA, pp 649-656 54 24 Cannon R J C (1997) ―Bacillus thuringiensis use in agriculture: A molecular perspective‖, Biol Rev., 71, pp 561-636 25 Cao-guo Y., Martha A M., Gregory W W., Micheal G K and Juan J E (1997), ―The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects‖, Appl Environ Microbiol, 63, pp 532-536 26 Carozzi, N B., V C Kramer, G.W.Warren, S.Evola, and M.G Koziel (1991), “Prediction of insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains by polymerase chain reaction product profile‖, Appl Environ Microbiol, 57, pp 3057-3061 27 De Maagd R., H Van Der Klei, P L Bakker, W J Stiekema, and D Bosch (1996) ―Different domains of Bacillus thuringiensis δ-endotoxins can bind to insect midgut membrane protens on ligand blots.‖, Appl Environ Microbiol, 62, pp 2753-2757 28 De Maagd R.A., A Bravo, and N Crickmore (2001) ―How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world.‖, Trends in Genetic, 17, pp 193-200 29 Dix P J (1986), Plant Cell Culture Technology, Yeoman M.M, Oxford, Blackwell Scientific Publication, pp.143-201 30 Drake, P.M.W., D.M Chargelegue, N.D Vine, C.J van Dolleweerd, P Obregon, and J.K.C Ma (2003), ―Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex from transgenic tobacco roots‖, Plant Molecular Biology, 52(1): p 233-241 31 Ekobu M, Solera M, Kyamanywa S, Mwanga RO, Odongo B, Ghislain M, Moar WJ (2010), ―Toxicity of seven Bacillus thuringiensis Cry proteins against Cylas puncticollis and Cylas brunneus (Coleoptera: Brentidae) using a novel artificial diet‖, J Econ Entomol, 103(4), pp 1493-502 32 FAOSTAT (1998), FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) Statistics Database (Online) Accessed June 1999 Available http://apps.fao.org 33 Francis R and Donald H D (1996), Report on Molecular of Bacillus thuringiensis, Bacillus thuringiensis conferences in Thailand, pp 2-3; 8-13 55 34 Gawel N.J and Jarret R.L (1991), ―A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoea‖ Plant Molecular Biology Reporter, 9, pp 262-266 35 Gill S S., E A Cowles, and P V Pietranto (1992), ―The mode of action of Bacillus thuringiensis endotoxins‖, Annu Rev Entomol., 37, pp 615-636 36 Grachulski P., L Masson, S Borisova, M Puzstai-Carey, J.-L Schwartz, R Brousseau, and M Cygler (1995), ―Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation‖, J Mol Biol., 254, pp 447-464 37 Gregory C Philips, John F Hubstenberger, and Elizabeth E Hansen (1995), ―Plant regeneration from callus and cell suspension cultures by somatic embryogenesis‖, Plant Cell, Tissue and Organ Culture Springer, pp 80-82 38 Guo-Qing Song, Hideo Honda, and Ken-Ichi Yamaguchi (2004), ―Efficient Agrobacterrium tumefaciens-mediated transformation of Sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam) from stem explants using a two-step kanamycinhygromycin selection method‖, In Vitro Cell Dev Biol.Plant, 40, pp 359–365 39 Hamid Rashid, Asma Afzal, M Haroon Khan, Zubeda Chaudhry and Salman A Malik (2010), ―Effect of bacterial culture density and acetosyringone concentration on Agrobacterium-mediate transformation in wheat‖ Pak J Bot., 42(6), pp 4183-4189 40 Hai-Kun Liu Chao Yang Zhi-Ming Wei (2004), ―Efficient Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of soybeans using an embryonic tip regeneration system‖, Planta, 219, pp.1042–1049 41 Höfte H., and H R Whiteley (1989), ―Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis‖, Microbiological Reviews, 53, pp 242-255 42 Jansson, R K Raman,K.V (1991), Sweetpotato pest management, West view press India 43 Jefferson R.A (1987) ―Gus fusions: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants‖ EMBO J, 16, pp 2901-2907 44 Jin Xu, Yu Zhen Wang, Heng Xia Yin and Xiao Jing Liu (2009), ―Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Malus zumi (Matsumura) Rehd using leaf explant regeneration system‖, Electronic Journal of Biotechnology, 12(1), pp 3-7 56 45 Jinjuan Shen, Pingzhong Cai, Feng Qing, Zhiyong Zhang, and Gũiue Wang (2012), ―A primary study of high performance transgenic rice through maize UBI-1 promoter fusing selective maker gene‖, Pak J Bot, 44(2), pp 501-506 46 Juan J Estruch Gregory W Warren, Martha A Mullins, Gordon J Nye, Joyce A Craig and Michael G Koziel (1996), ―Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects‖, Proc Natl Acad Sci, 93, pp 5389-5394 47 Li J., J Carroll, and D J Ellar (1991), ―Crystal structure of insecticidal δendotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5A0 resolution‖, Nature, 353, pp 81-821 48 Li J., P A Koni, and D J Ellar (1996), ―Structure of the mosquitocidal δendotoxin cyt B from Bacillus thuringiensis.”, Journal of Moleculer Biology, 257, pp 129-152 49 Liu J R and Cantliffe D J (1984), ―Somatic embryogenic and plant regeneration in tissue cultures of sweetpotato (Ipomoea batatas Poir.)‖, Plant Cell Reports, 3, pp 112-115 50 Loguercio L L., Barreto M L., Rocha T L., Santos C G and Paiva E (2002), ―Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a first-tier screening strategy for Vip-derived activities in Bacillus thuringiensis strains effective against tropical fall armyworm‖, Jounal of Applied Microbiology, 93, pp 269-277 51 Lucckmini K W (1994), ―Plant regeneration of sweetpotato (Ipomoea batatas Poir.)‖, Plant Cell Reports, 3, pp.112-115 52 Luo H R, Santa Maria M, Benavides J, Zhang D P, Zhang Y Z and Ghislain M (2006), ―Rapid genetic transformation of sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam) via organogenesis‖, African Journal of Biotechnology, 5(20), pp 1851-1857 53 Marfalane R., Jackson G V (1989), Cylas formicarius, Sweetpotato weevil, Published by the Pacific Commission, BPDC noumea cedex, new caledonia, pp.1-4 54 Marceline Egnin, Adalgisa Mora, and Channapatna S Prakash (1998), ―Factors enhancing Agrobacterium tumefaciens - Mediated gene transfer in Peanut (Arachish ypogaea L.)‖, In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 34 (4), pp 310-318 57 55 McCormac, A.C., H Wu, M Bao, Y Wang, R Xu., M.C Elliott and Chen Dong-Fang (1998), ―The use of visual marker genes as cell specific reporters of Agrobacterium-mediated TDNA delivery to wheat (Triticum aestivum L.) and barley (Hordeum vulgare L.)‖, J.Euphytica, 99, pp 17-25 56 Mohamed A Ibrahim, Natalya Griko, Matthew Junker, and Lee A Bulla (2010), ―Bacillus thuringiensis‖, Bioeng Bugs, 1(1), pp 31–50 57 Merkli A, Christen P, and Kapetanidis I (1997), ―Production of diosgenin by hairy root cultures of Trigonella foenum-graecum L.‖ Plant Cell Reports 16(9), pp 632-636 58 Moran R., Garcia R., Lopez A., Zaldua Z., Mena J., Garcia M., Armas R., Somonte D and Pimentel E (1998), "Transgenic sweetpotato plants carrying delta-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis var tenebrionis" Plant Science 139, pp 175-184 59 Newel, C.A., Lowe, J.M., Merryweather, A., Rooke, L.M and Hamilton, W.D.O (1995), ―Transformation of sweet potato (Ipomoea batatas Lam.) with Agrobacterium tumefaciens and regeneration of plants expressing cowpea trypsin inhibitor and snowdrop lectin‖ Plant Science, 107, pp 215-227 60 Nina Sevón, Kirsi Marja Oksman Caldentey (2002), ―Agrobacterium rhizogenes - Mediated transformation: Root cultures as a source alkaloids‖, Planta Med, 68, pp 859-868 61 Otani, M., Mii, M., Handa, T., Kamada, A and Shimada, T (1993), ―Transformation of sweet potato (Ipomoea batatas (L) Lam) plants by Agrobacterium rhizogenes”, Plant Science, 94, pp 151- 159 62 Pineda CR, Toro PN, Narvaez J, Orozco Cardenas ML, Laignelet A, Cárdenas H (2002), ―Genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens of embryogenic cell suspensions of plantain "dominico Harton" (Musa AAB Simmonds)‖, Informusa, 11, pp 9-13 63 Prakash C S., Varadarajan U (1992), Genetic transformation of sweetpotato Sweetpotato Technology for the 21st century, Tuskegee University, pp 27-37 64 Prakash CS, Varadarajan U (1992), ―Genetic transformation of sweetpotato by particle bombardment‖, Plant Cell Rep, 11, pp 53-57 65 R Pratap Chandran and V P Potty (2008), ―Induction of hairy roots through the mediation of four strains of Agrobacterium rhizogenes on five host plants‖, Indian Journal of Biotechnology, 7, pp 122-128 58 66 Rolando García González, Danalay Somonte Sánchez, Zurima Zaldúa Guerra, Jesús Mena Campos, Alina López Quesada, Rolando Morán Valdivia, Ariel D Arencibia, Karla Quiroz Bravo and Peter DS Caligari (2008), ―Efficient regeneration and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of recalcitrant sweet potato (Ipomoea batatas L.) cultivars‖, AsPac J Mol Biol Biotechnol., 16 (2), pp 25-33 67 Selvapandiyan A., Arora N., Rajagopal R., Jalati S K., Venkatesan T., Singh S P and Raj K Bhatnagar (2001), "Toxicity analysis of N-terminus-deleted tvegetative insecticidal protein from Bacillus thuringiensis", Appl Environ Microbiol, 57(12), pp 5855-5858 68 Sevon N, Drager B, Hiltunen R, Oksman-Caldentey K.-M (1997), ―Characterization of transgenic plants derived from hairy roots of Hyoscyamus muticus‖, Plant cell reports, 16 (9), pp 605-611 69 Sheng-Jiun Wu & CS (2012), ―Two disulfide mutants in domain I of Bacillus thuringiensis Cry3Aa δ-endotoxin increase stability with no effect on toxicity‖, Advances in Biological Chemistry, 2, pp 123-131 70 Shoja H.M (2010), Contribution to the study of the Agrobacterium rhizogenes plast genes, rolB and rolC, and their homologs in Nicotiana tabacum, PhD dissertation, University of Strasborg 71 Sikuli N.N, Demeyer, K (1997), ―Influence of the ion-composition of the medium on alkaloid production by "hairy roots" of Datura stramonium‖, Plant cell, tissue and organ culture, 47 (3), pp 261-267 72 Simon Deroles, Mary Anne Lila Smith & Carmella Lee (2002), ―Factors affecting transformation of cell cultures from three dicotyledonous pigmentproducing species using microprojectile bombardment‖, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 70, pp 69–76 73 Sullivan J N., Asher C J and Blamey F.P (1997), Nutrient disorder of sweetpotato Australian Centre for International Agricultural Research, pp 9-15 74 Sylvain E., Michel G., Josette C., Christophe B., Ste‘phane P and Vincent S (2002), ―Correspondence of high levels of beta- endotoxin I and the presence of cry 1B in Bacillus thuringiensis‖, Applied Environmental Microbiology, pp 4182- 4186 75 Thomas D.J.I., Morgan J.A.W., Whipps J.M and Saunders J.R (2001), ―Plasmid transfer between Bacillus thuringiensis subsp israelensis strains in 59 laboratory culture, river water, and Dipteran larvae‖, Appl environ Microbiol., 67, pp 330–338 76 Trick HN, Finer JJ (1998), ―Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill] embryogenic suspension culture tissue.: Plant Cell Rep, 17, pp 482–488 77 Veena V and Christopher G T (2007), ―Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promising applications‖, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 43, pp 383-403 78 Victor A Doss, K Anup Kumar, R Jayakumar, and Vaithilingam S (2002), "Cloning and expression of vegetative insecticidal protein (vip3V) gene of Bacillus thuringiensis in Escherichia coli" Protein expression and purification, 26, pp 82-88 79 Vijayachandra.K (1995), Development of Agrobacterium transformation system for rice Ph.D thesis Madurai Kamaraj Uni, India, pp 1-13; 27-30 80 Vilas P Sinkar, Frank F White, and Milton P Gordon (1987), ―Molecular biology of Ri-plasmid—A review‖, J Biosci, 11(1–4), pp 47–57 81 Wahlroos T, Susi P, Tylkina L, Malyshenko S, Zvereva S (2003), ―Agrobacterium -mediated transformation and stable expression of the green flurescence protein in Brassica rapa‖, Plant Physiol.Biochem, 41, pp.773-778 82 Walter A H., Conrad K B., Philip A L., (1992), ―Sweetpotato rsearch: Curent status and future needs― Sweepotato technology for the 21st century Tuskeege University, pp 3-6 83 Wang J S (1998), "Efficient embryogenic callus formation and plant regeneration in shoot tip cultures of sweetpotato" Mern Fac Agr Kagoshima Univ, 34, pp 61-64 84 Warren G W., Koziel M G., Mullins M A., Nye B C and Estruct J J (1996), Novel pesticidal proteins and strains, Patent WO 96/10083, World Intellectual Property Organization 85 Wongsamuth, R., and P.M Doran (1997), ―Production of monoclonal antibodies by tobacco hairy roots‖, Biotechnol Bioeng, 54(5): p 401-415 86 Whiteley H R and Schnef, H E (1986), "The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis" Annual review of Microbiology, 40, pp 549-576 87 Woolfe J.A (1992), Sweetpotato an untapped food resource, Cambridge 60 88 Yasutaka Nishiyama, Takashi Yamakawa (2004), ―Effect of medium composition on the production of anthocyanins by hairy root cultures of Ipomoea batatas‖, Plant Biotechnology, 21(5), pp 411–414 89 Youngjin Park, Mohd Amir F Abdullah, Milton D Taylor, Khalidur Rahman, and Michael J Adang (2009), ―Enhancement of Bacillus thuringiensis Cry3Aa and Cry3Bb Toxicities to Coleopteran Larvae by a Toxin-Binding Fragment of an Insect Cadherin‖, Applied and Environmental Microbiology, 75 (10), pp 3086–3092 90 Zimmerman E C (1994), Australian Weevils (Coleoptera: Curculionoidea), CSIRO, Australia 61 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần loại môi trƣờng nuôi cấy chuyển gen khoai lang Môi trƣờng YMP 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + đặc g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar YMP 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + lỏng g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl, pH = WPM WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + đặc WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30g đƣờng + g aga WPM WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) lỏng + WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đƣờng MS đặc MS lỏng ½ MS Thành phần pH 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đƣờng + g aga 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đƣờng 10 ml/L MS I + ml/L MS II + ml/L MS III + ml/L MS IV + ml/L MS V 7,0 7,0 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 Phụ lục Thành phần cho 100ml môi trƣờng nuôi bọ hà TT Thành phần dinh dƣỡng Đơn vị tính Hàm lƣợng Bacto agar g 4,0 Yeast extract g 1,0 Casein g 2,4 Saccharose g 4,0 Cellulose g 1,6 Salt mix g 0,3 62 Ascobic acid g 0,2 Inositol g 0,04 Postassium sorbate g 0,1 10 Choline cloride mg 5,0 11 Sweet potato g 10,0 12 Methyl g 0,1 13 Cholesterol g 0,08 14 Ethanol ml 2,0 15 Vitamin mix g 0,1 Phụ lục Cấu trúc vectơ pIBT/cry3 nằm vi khuẩn A rhizogenes 63 Phụ lục Cấu trúc vector pPTN289 mang thị gen gus nằm vi khuẩn A rhizogenes 64 ... lang kháng bọ hà, vào điều kiện phịng thí nghiệm cho phép với phƣơng pháp khả thi, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius)? ??...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ XUÂN THAO NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ KHOAI LANG CHUYỂN GEN CRY3 KHÁNG SÂU NON BỌ HÀ (Cylas formicarius) Chuyên ngành: Vi sinh... thành tựu tạo khoai lang chuyển gen Cũng nhƣ lƣơng thực khác, phƣơng pháp tạo khoai lang chuyển gen đƣợc tiến hành nghiên cứu từ năm 1987 Đã có nhiều nghiên cứu nhằm tăng cƣờng khả tái sinh khoai