(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu sự biến động của glycoprotein thời kỳ có chửa và lactogen nhau thai ở trâu đầm lầy việt nam (bubalus bubalis)

MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình ảnh, đồ thị vi MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1 Hoạt động sinh sản mang thai trâu đầm lầy 1.1.1 Chăn nuôi trâu Việt Nam 1.1.2 Chu kỳ sinh sản trâu đầm lầy 1.1.3 Môi trường biểu động dục trâu đầm lầy 10 1.1.4 Sự phát triển bào thai 11 1.1.5 Tương quan số đo khác thai 12 1.1.6 Sự phát triển thai động vật nhai lại 14 1.1.7 Hocmon thai 19 1.2 Nghiên cứu glycoprotein thời kỳ có chửa (PAG) 20 1.2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu PAG 20 1.2.2 Chức PAG 24 1.2.3 Biểu PAG động vật nhai lại 25 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu lactogen thai 27 1.3.1 Tổng quan tài liệu PL 27 1.3.2 Chức PL 30 1.3.3 Biểu PL động vật nhai lại 32 iii Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Động vật thí nghiệm 33 2.2 Thu thập mẫu vật 34 2.2.1 Thu mẫu từ lò mổ 34 2.2.2 Phương pháp đo thai 35 2.2.3 Gây động dục đồng pha trâu nông hộ 37 2.2.4 Thu mẫu máu từ trâu nông hộ 38 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio immunoassay – RIA) 38 2.3.1 Kháng nguyên 38 2.3.2 Chuẩn bị kháng thể 39 2.3.3 Chuẩn bị kháng thể thứ cấp 39 2.3.4 Chuẩn bị PAG đánh dấu phóng xạ 40 2.3.5 Chuẩn bị rbPL đánh dấu phóng xạ 41 2.3.6 Chuẩn bị đường chuẩn 42 2.3.7 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) 43 2.3.8 Kiểm tra độ nhạy 44 2.3.9 Kiểm tra tính tương đồng 44 2.4 Phương pháp Elisa 45 2.4.1 Tạo phân lập IgG 45 2.4.2 Sự kết hợp IgG – Biotine 46 2.4.3 Xác định độ pha loãng tối ưu cho kháng thể gắn enzyme 46 2.4.4 Phương pháp ELISA kẹp gián tiếp cho định lượng PAG 46 2.5 Phân tích số liệu 48 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Phát triển trước sinh trâu đầm lầy 49 3.1.1 Kích cỡ bào thai 49 iii 3.1.2 Tương quan chiều dài đầu đuôi với số đo khác 53 3.1.3 Tương quan khối lượng thai với số đo khác 60 3.2 Thiết lập hệ thống RIA cho việc định lượng PAG trâu đầm lầy 65 3.2.1 Hệ thống RIA với phương pháp có ủ trước kháng thể 66 3.2.2 Hệ thống RIA sử dụng phương pháp không ủ trước kháng thể 68 3.2.3 Hàm lượng PAG trâu đầm lầy định lượng ba hệ thống RIA 71 3.2.4 Tương quan hàm lượng PAG trâu tuổi thai ước lượng 78 3.2.5 Định lượng PAG mẫu máu bò kháng thể kháng PAG khác loài 3.3 Thiết lập hệ thống sandwich ELISA cho định lượng PAG 3.3.1 Tối ưu phương pháp sandwich ELISA 83 86 86 3.3.2 Tương quan hàm lượng PAG trâu loại mẫu định lượng phương pháp ELISA RIA 90 3.3.3 Định lượng hàm lượng PAG hệ thống ELISA 98 3.3.4 Chẩn đốn có thai sớm trâu phương pháp định lượng PAG 3.4 Hàm lượng PL trâu đầm lầy 3.4.1 Thiết lập phương pháp định lượng PL trâu đầm lầy 99 101 101 3.4.2 Hàm lượng PL loại mẫu khác trâu đầm lầy 104 3.4.3 Tương quan hàm lượng PL với tuổi thai ước lượng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105 112 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT As (Antiserum) Kháng huyết Ac-PAG (PAG antibody) Kháng thể kháng PAG B (Tracer bound) Gắn kết đánh dấu phóng xạ bCG (Bovine chorionic gonadotrophin) Gonadotrophin thai bò BNC (Binucleate cell) Tế bào hai nhân bPL (Bovine placental lactogen) Lactogen thai bò cPL (Caprine placental lactogen) Lactogen thai dê oPL (Ovine placental lactogen) Lactogen thai cừu rbPL (recombination placental lactogen) Lactogen thai tái tổ hợp bò CRL (Crown rump length) Dài đầu đuôi Cs Cộng DEAE (Diethylaminoethyl) Diethylaminoethyl ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAO (Food associated organization) Tổ chức nông lương giới 125 I (ioden 125) Iốt phóng xạ 125 kDa kilo Danton MDL (Minimal detection limit) Giới hạn định lượng nhỏ OD (optical density) Độ hấp thụ P4 Progesteron PAG (Pregnancy-associated glycoprotein) Glycoprotein thời kỳ có chửa boPAG (bovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa bị caPAG (caprine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa dê ovPAG (ovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa cừu PEG Polyethylene glycol pI (isoelectric point) Điểm đẳng điện PSP60 (Pregnancy serum protein 60) Protein huyết giai đoạn có chửa 60 PSPA (Pregnancy specific protein-A) Protein đặc hiệu giai đoạn có chửa A PSPB (Pregnancy specific protein-B) Protein đặc hiệu giai đoạn có chửa B R (r) (Correlation coefficient) Hệ số tương quan RIA (Radioimmunoassay) Miễn dịch phóng xạ ED-20 (20% bound) Vị trí có 20% gắn kết ED-50 (50% bound) Vị trí có 50% gắn kết ED-80 (80% bound) Vị trí có 80% gắn kết SD (Standard deviation) Sai số tuyệt đối SF (serum free) Huyết động vật khơng có chửa iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang 1.1 Phân bố quần thể trâu Việt Nam 1.2 Đặc điểm tăng trưởng khối lượng trâu đầm lầy Việt Nam 1.3 Đặc điểm sinh sản bị, trâu sơng trâu đầm lầy 1.4 Sự biểu phân tử PAG bò dê hợp bào thai (Green vcs, 2000) 26 2.1 Đường chuẩn phương pháp RIA không ủ trước kháng thể 42 2.2 Đường chuẩn phương pháp RIA có ủ trước kháng thể 43 2.3 Phương pháp RIA có khơng ủ trước với kháng thể 44 3.1 Trung bình số kích thước phơi/thai trâu đầm lầy giai đoạn mang thai nghé sơ sinh 50 3.2 Tương quan hồi quy CRL với chiều dài thai 54 3.3 Tương quan hồi quy CRL với kích thước thân thai 55 3.4 Tương quan hồi quy CRL với bốn số đo đầu thai 56 3.5 Tương quan hồi quy CRL với số đo chân thai 57 3.6 Tương quan hồi quy CRL với chu vi cuống rốn 58 3.7 Tương quan hồi quy CRL với khối lượng thai 59 3.8 Tương quan hồi quy khối lượng thai chiều dài thai 60 3.9 Tương quan hồi quy khối lượng thai thân thai 61 3.10 Tương quan hồi quy khối lượng thai số đo đầu thai 62 3.11 Tương quan hồi quy khối lượng thai kích thước chân 63 3.12 Tương quan hồi quy khối lượng thai chu vi cuống rốn 64 3.13 Đặc điểm đường chuẩn bốn hệ thống RIA phương pháp có ủ trước kháng thể 66 3.14 Đặc điểm đường chuẩn ba hệ thống RIA phương pháp không ủ trước kháng thể 70 3.15 Hàm lượng PAG loại mẫu khác trâu v định lượng ba hệ thống RIA 72 3.16 Phương trình hồi quy mối tương quan hàm lượng PAG huyết tương trâu định lượng ba hệ thống RIA 74 3.17 Phương trình hồi quy mối tương quan hàm lượng PAG huyết tương thai định lượng ba hệ thống RIA 75 3.18 Phương trình hồi quy mối tương quan hàm lượng PAG dịch niệu định lượng ba hệ thống RIA 76 3.19 Phương trình hồi quy mối tương quan hàm lượng PAG dịch ối định lượng ba hệ thống RIA 77 3.20 Kết chẩn đoán có chửa mẫu huyết tương bị 85 3.21 Phương trình hồi quy mổ tả tương quan ba hệ thống RIA 86 2.22 Giá trị OD thử nghiệm độ pha loảng biotine avidine 90 3.23 Giá trị trung bình hàm lượng PAG định lượng RIA ELISA 92 3.24 Hàm lượng PAG loại mẫu khác định lượng phương pháp RIA ELISA 92 3.25 Tương quan hồi quy hàm lượng PAG huyết tương trâu định lượng ELISA ba hệ thống RIA 94 3.26 Tương quan hồi quy hàm lượng PAG huyết tương thai định lượng ELISA ba hệ thống RIA 95 3.27 Tương quan hồi quy hàm lượng PAG dịch niệu định lượng ELISA ba hệ thống RIA 96 3.28 Tương quan hồi quy hàm lượng PAG dịch ối định lượng ELISA ba hệ thống RIA 97 3.29 Hàm lượng PAG loại mẫu khác định lượng ba hệ thống ELISA 3.30 Tỷ lệ chẩn đốn có chửa trâu dựa vào định lượng PAG 3.31 Hàm lượng PL loại mẫu khác trâu đầm lầy 98 99 104 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Trang Hình ảnh trâu đực 1.2 Hình ảnh trâu mẹ 1.3 Thai trâu bọng dịch ối 16 Sự di trú phát triển tế bào đa nhân (Wooding vcs., 1992) 18 1.5 Đồ thị biểu tồn phân tử PAG bò suốt trình mang thai (Green vcs., 2000) 26 2.1 Hình ảnh đàn trâu Việt Nam 33 2.2 Thu mẫu máu thai từ tim thai 35 2.3 Các vị trí đo kích thước thai 37 2.4 Thu mẫu máu trâu nông hộ 38 2.5 Phản ứng gắn I125 40 2.6 Biến động PAG gắn phóng xạ phân đoạn sau lọc phân đoạn sephadex 2.7 Sơ đồ bước phương pháp Elisa 40 47 3.1 Biến thiên kích thước trung bình thai trâu suốt trình mang thai sơ sinh 52 3.2 Tương quan hồi quy CRL chiều dài thai theo đường cong 53 3.3 Đồ thị tương quan CRL kích thước thân thai 54 3.4 Đường hồi quy mô tả mối tương quan CRL bốn số đo kích thước đầu 55 3.5 Tương quan dài đầu (đầu-mũi) rộng đầu với CRL khoảng quý đầu mang thai bò (George cs, 2008) 56 3.6 Đường tương quan CRL số đo kích thước chân thai 57 3.7 Đường đồ thị thể mối tương quan CRL với chu vi rốn 58 3.8 Đường đồ thị thể mối tương quan CRL với khối lượng thai 59 vi 3.9 Đường hồi quy mô tả mối tương quan khối lượng thai chiều dài thai 60 3.10 Đường hồi quy mô tả mối tương quan khối lượng thai ba số đo kích thước thân 61 3.11 Đường hồi quy mơ tả mối tương quan khối lượng thai bốn số đo kích thước đầu 62 3.12 Đường hồi quy mô tả mối tương quan khối lượng thai bốn số đo kích thước chân 63 3.13 Đường hồi quy mô tả mối tương quan khối lượng thai chu vi cuống rốn 64 3.14 Sự tương đồng đường chuẩn PAG bò với dãy pha loãng mẫu vật khác từ trâu đầm lầy phương pháp RIA có ủ trước kháng thể 67 3.15 Sự tương đồng đường chuẩn PAG bò với dãy pha loãng mẫu vật khác từ trâu đầm lầy phương pháp RIA không ủ trước kháng thể 69 3.16 Tương quan hàm lượng PAG huyết tương trâu định lượng ba hệ thống RIA 73 3.17 Tương quan hàm lương PAG huyết tương thai định lượng ba hệ thống RIA 74 3.18 Tương quan hàm lương PAG dịch niệu định lượng ba hệ thống RIA 75 3.19 Tương quan hàm lương PAG dịch ối định lượng ba hệ thống RIA 76 3.20 Tương quan hàm lượng PAG huyết tương trâu với tuổi thai ước lượng 79 3.21 Tương quan hàm lượng PAG huyết tương thai với tuổi vi thai ước lượng 80 3.22 Tương quan hàm lượng PAG dịch niệu với tuổi thai ước lượng 81 3.23 Tương quan hàm lượng PAG dịch ối với tuổi thai ước lượng 82 3.24 Tương quan hàm lượng PAG thai bò với tuổi thai ước lượng (Zoli cs., 1992) 83 3.25 Kết tương đồng đường chuẩn PAG bò với dãy pha lỗng mẫu huyết tương bị phương pháp định lượng RIA có ủ trước kháng thể kháng PAG dê trâu 84 3.26 Đồ thị tương quan hàm lượng PAG mẫu huyết bò định lượng ba hệ thống RIA 85 3.27 Đĩa ELISA kiểm tra độ pha loãng kháng thể kháng PAG dê (As#726) (dừng phản ứng sau 30 phút) 87 3.28 Đặc điểm đường chuẩn phương pháp ELISA - PAG 87 3.29 Đường chuẩn phương pháp ELISA theo Green cs., (2005) 88 3.30 So sánh kết hàm lượng PAG định lượng RIA ELISA 91 3.31 Tương quan hàm lượng PAG huyết tương trâu định lượng ELISA ba hệ thống RIA 93 3.32 Tương quan hàm lượng PAG huyết tương thai định lượng ELISA ba hệ thống RIA 94 3.33 Tương quan hàm lượng PAG dịch niệu định lượng ELISA ba hệ thống RIA 95 3.34 Tương quan hàm lượng PAG dịch ối định lượng ELISA ba hệ thống RIA 96 3.35 Tính tương đường chuẩn PL bị dãy pha lỗng dịch vi mẫu khác trâu đầm lầy 102 3.36 Miễn dịch phóng xạ kháng thể đúp lactogen thai (Forsyth, 1986) 103 3.37 Tương quan hàm lượng PL huyết tương trâu mẹ với tuổi thai ước lượng 106 3.38 Tương quan hàm lượng PL huyết tương thai với tuổi thai ước lượng 106 3.39 Biến động hàm lượng PL bò suốt trình mang thai (Beckers vcs, 1982) 107 3.40 Tương quan hàm lượng PL dịch niệu với tuổi thai ước lượng 108 3.41 Tương quan hàm lượng PL dịch ối với tuổi thai ước 119 lượng 3.42 Tương quan hàm lượng PL nước tiểu trâu mẹ với tuổi thai dự kiến 110 vi ... (Pregnancy-associated glycoprotein) Glycoprotein thời kỳ có chửa boPAG (bovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa bị caPAG (caprine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa dê ovPAG (ovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa. .. [26] 1 Hoạt động sinh sản mang thai trâu đầm lầy 1.1.1 Chăn nuôi trâu Việt Nam Trâu địa Việt Nam trâu đầm lầy Chưa có tài liệu thức phân loại giống trâu Việt Nam, số tác giả dựa vào hình thái... dụng kháng thể kháng PL bò nghiên cứu biến động hàm lượng PL huyết tương trâu thai, dịch ối, dịch niệu nước tiểu trâu mẹ trình mang thai trâu đầm lầy Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Theo